ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp thực hướng dẫn khoa học ThS Huỳnh Quang Phước, Trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án tốt nghiệp hồn tồn khơng chép kết người khác hình thức Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm đồ án tốt nghiệp Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, người nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hôm Qua bốn năm học tập Trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh em thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian học tập trường suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, nhờ thầy cô trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS Huỳnh Quang Phước, thầy tận tình quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ em để em hồn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy phòng thí nghiệm bạn bè quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện cho em thực đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực đề tài Phạm Ngọc Yến Trinh ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Tình hình nghiên cứu 4.1 Tình hình nghiên cứu nước 4.2 Tình hình nghiên cứu nước Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự chuyển hóa nitơ 1.1.1 Vai trò nitơ thực vật 1.1.2 Sự hấp thụ đạm thực vật 1.1.2.1 Sự dùng đạm khống thực vật có vài đặc tính đáng ý 1.1.2.2 Sự khử nitrate .10 1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid .10 1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein 12 1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp quang hợp 12 1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên 12 1.1.3.1 Q trình amon hóa 15 1.1.3.2 Quá trình nitrate hóa 16 1.1.3.3 Q trình phản nitrite hóa 17 1.1.3.4 Quá trình cố định nitơ phân tử 17 1.1.3.5 Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử 19 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 1.2 Vi khuẩn Paenibacillus 21 1.2.1 Phân loại 21 1.2.2 Đặc điểm hình thái 21 1.2.3 Sự phân bố Paenibacillus 23 1.2.4 Một số đặc tính khác Paenibacillus 23 1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm 23 1.3.1 Định nghĩa 23 1.3.2 Phân loại 24 1.3.3 Nguyên liệu sản xuất phân bón 25 1.3.3.1 Mật rỉ đường .25 1.3.3.2 Than bùn 27 1.3.4 Quy trình sản xuất 28 1.3.4.1 Quy trình sản xuất tổng quát 28 1.3.4.2 Thuyết minh .29 1.3.5 Các yêu cầu phân bón vi sinh cố định đạm 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu, thiết bị 31 2.1.1 Vật liệu 31 2.1.1.1 Mật rỉ 31 2.1.1.2 Than bùn 31 2.1.1.3 Nguồn phân lập vi sinh vật 31 2.1.2 Thiết bị 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp xác định số tiêu mật rỉ 31 2.2.1.1 Xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS 31 2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường tổng .32 2.2.1.3 Xác định hàm lượng chất khơ hòa tan phương pháp đo độ khúc xạ 32 2.2.2 Phương pháp xác định số tiêu than bùn 32 iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 2.2.2.1 Xác định carbon hữu tổng số phương pháp Walkley – Black (TCVN 9294-2012) 32 2.2.2.2 Xác định acid humic acid fulvic (TCVN 8561-2010) 33 2.2.2.3 Xác định N tổng số (TCVN 8557-2010) 33 2.2.2.4 Xác định N hữu hiệu (TCVN 9295-2012) 33 2.2.2.5 Xác định P2O5 tổng số (TCVN 8563 – 2010) 34 2.2.2.6 Xác định P2O5 hữu hiệu (TCVN 8559-2010) 34 2.2.2.7 Xác định K2O tổng số (TCVN 8660-2011) .35 2.2.2.8 Xác định K2O hữu hiệu (TCVN 8662-2011) .35 2.2.2.9 Xác định pH (TCVN 5979-2007) 35 2.2.2.10 Xác định độ ẩm phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi 36 2.2.3 Phương pháp phân tích vi sinh 36 2.2.3.1 Phương pháp phân lập 36 2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 36 2.2.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử 36 2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính vi sinh vật 37 2.2.4.1 Định tính nitơ dịch ni cấy phương pháp so màu với thuốc thử Nessler 37 2.2.4.2 Định lượng nitơ dịch nuôi cấy phương pháp Kjeldahl .37 2.2.4.3 Xác định khả tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) vi khuẩn phương pháp Salkowski (Glickmann Dessaux, 1995) .38 2.2.5 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 39 2.2.5.1 Đếm khuẩn lạc 39 2.2.5.2 Xác định mật độ vi sinh vật phương pháp đo mật độ quang 39 2.2.6 Định danh vi sinh vật 39 2.3 Bố trí thí nghiệm 41 2.3.1 Xác số tiêu mật rỉ 42 2.3.2 Xác định số tiêu than bùn 42 2.3.3 Phân lập vi sinh vật 43 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 2.3.4 Xác định hoạt tính vi sinh vật 43 2.3.5 Khảo sát điều kiện lên men 43 2.3.5.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng 44 2.3.5.2 Xác định hàm lượng mật rỉ bổ sung 45 2.3.5.3 Xác định hàm lượng khoáng bổ sung 45 2.3.6 Khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 46 2.3.7 Phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm 47 2.3.7.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật 47 2.3.7.2 Kiểm tra tiêu than bùn 47 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 49 3.1 Kết khảo sát tiêu nguyên liệu 49 3.1.1 Mật rỉ 49 3.1.2 Than bùn 49 3.2 Kết phân lập đặc điểm hình thái, sinh hóa 50 3.2.1 Kết phân lập đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 3.2.2 Tuyển chọn chủng cố định nitơ mạnh 53 3.2.3 Khả tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) vi sinh vật 54 3.2.4 Định danh sinh học phân tử chủng P2 55 3.3 Khảo sát thời gian môi trường tối ưu để lên men thu sinh khối 55 3.3.1 Khảo sát thời gian lên men 55 3.3.2 Khảo sát tỉ lệ mật rỉ bổ sung 56 3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng bổ sung 58 3.4 Kết khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 59 3.5 Kết kiểm tra chế phẩm phân bón sau phối trộn với than bùn 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC A: CÁC CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 35 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt q trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 20 Bảng 1.2 Phân loại vi khuẩn Paenibacillus 21 Bảng 1.3 Ưu nhược điểm chất mang khử trùng không khử trùng 25 Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng rỉ mật mía 26 Bảng 1.5 Thành phần hóa học rỉ đường mía 27 Bảng 1.6 Thành phần hóa học than bùn vùng khác 28 Bảng 2.1 Tên loại thiết bị sử dụng thí nghiệm 32 Bảng 2.2 Các tiêu mật rỉ 42 Bảng 2.3 Các tiêu than bùn 42 Bảng 2.4 Xác định hoạt tính vi sinh vật 43 Bảng 2.5 Xây dựng đường cong tăng trưởng vi sinh vật 44 Bảng 2.6 Mật độ vi sinh vật môi trường bổ sung mật rỉ qua mốc thời gian 45 Bảng 2.7 Mật độ vi sinh vậttrên mơi trường bổ sung khống qua mốc thời gian 46 Bảng 2.8 Mật độ tế bào thay đổi theo độ ẩm 47 Bảng 3.1 Một số tiêu mật rỉ 49 Bảng 3.2 Các tiêu than bùn trước ủ với vi sinh vật 50 Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi sinh vật 51 Bảng 3.4 Kết nhuộm Gram nhuộm bào tử 52 Bảng 3.5 Hàm lượng nitơ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật 54 Bảng 3.6 Khả sinh IAA chủng vi sinh vật 54 Bảng 3.7 Mật độ vi sinh vật mốc thời gian khác môi trường bổ sung mật rỉ 57 Bảng 3.8 Mật độ vi sinh vật mốc thời gian khác mơi trường bổ sung khống 58 Bảng 3.9 Ảnh hưởng độ ẩm đến phát triển vi sinh vật 60 Bảng 3.10 Các tiêu phân bón 61 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Con đường glutamin (sự gia nhập NH3 glutamin) 11 Hình 1.2 Vòng tuần hồn nitơ tự nhiên 14 Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử q trình khử oxy hóa nitơ 19 Hình 1.4 Liên kết bào tử P stellifer trưởng thành với 22 Hình 1.5 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh 29 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành 41 Hình 3.1 Phản ứng màu với thuốc thử Nessler 53 Hình 3.2 Khả tăng trưởng chủng P2 môi trường NB 56 Hình 3.3 Biến đổi mật độ tế bào chủng P2 môi trường qua mốc thời gian môi trường bổ sung mật rỉ 57 Hình 3.4 Biến đổi mật độ tế bào chủng P2 mơi trường bổ sung khống qua mốc thời gian 59 viii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong kinh tế nước ta nay, nơng nghiệp chiếm vị trí quan trọng Một biện pháp hàng đầu để đẩy mạnh sản xuất nơng nghiệp sử dụng phân bón Do nhu cầu xã hội ngày phát triển cao đòi hỏi người sử dụng nhiều biện pháp khác để tăng suất sản lượng sản phẩm Tuy nhiên, đa số nông dân cung cấp nitơ cho trồng dạng phân bón hóa học với hiệu suất thấp, dư lượng chất hóa học loại phân gây ô nhiễm môi trường đất làm đất bị thối hóa, chua hóa, làm cho mơi trường nước mặt nước ngầm tích lũy nhiều NO3-, NO2-, gây tượng phì hóa nước,…Ngồi ra, bón nhiều phân đạm vào thời kỳ thu hoạch làm tăng đáng kể lượng nitơ có sản phẩm mà người sử dụng hàng ngày có hại cho sức khỏe Đồng thời, nồng độ nitrate nước cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe người, đặc biệt trẻ em tháng tuổi Trong đường ruột, nitrate bị khử thành nitrite, nitrite tạo hấp thụ vào máu kết hợp với hemoglobin làm khả chuyên chở oxy máu bị giảm Nitrite nguyên nhân gây ung thư tiềm tàng Vì vậy, việc tìm nguồn phân bón hữu vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học vấn đề cấp thiết Đó lý để sinh viên thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm chất mang than bùn Tình hình nghiên cứu 4.1 Tình hình nghiên cứu nước ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Năm 1896 phân bón vi sinh Noble Hiltner sản xuất Đức đặt tên Nitragin Nitragin loại phân chế tạo vi khuẩn Rhizolium Beijerink phân lập năm 1888 Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho loại thích hợp họ đậu Ở Mỹ sản xuất chế phẩm Nitroculture, Anh sản xuất loại phân Nitrbacterin Tới hầu sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho đậu đặc biệt đậu tương Khả cố định đạm vi khuẩn đạm cố định hội sinh Azospirillum phát từ 1922, vai trò hoạt động cố định đạm vùng rễ hòa thảo biết đến vào năm thập kỷ 70 nhờ việc tìm nơi trú ngụ chúng Năm 1976 phát Azospirillum bên bên bề mặt mô rễ, tạo mối quan hệ cộng sinh với cây, chúng tồn đất vùng rễ, bề mặt rễ Đây lồi vi khuẩn có khả cố định đạm lớn, chúng nhận chất hữu pectin, acid hữu làm nguồn dinh dưỡng để phát triển cố định đạm, đồng thời cung cấp hợp chất nitơ cho chủ Nghiên cứu Puneet (1998) cho thấy phối hợp Azotobacter sp với chủng phân giải phosphate Aspergillus niger làm tăng suất lúa mì tăng 17,7%, Azotobacter tăng 9% Kapoor cho kết tương tự phối hợp chủng Azotobacter sp với chủng phân giải phosphate Bacillus sp., Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng suất lúa, vải lên 10 – 20% Năm 2008, Anelise Beneduzi cộng phân lập số chủng Bacillus Paenibacillus từ cánh đồng lúa miền nam Brazil Việc phân lập vi khuẩn từ đất ôn đới cận nhiệt đới, kết hợp khả cố định đạm với việc sản xuất chất có khả kích thích tăng trưởng thực vật, làm tăng đáng kể suất trồng ngũ cốc Brazil Năm 2013, chế phẩm sinh học Nano-Gro sản xuất công ty Custom Biologicals, Inc Hoa Kỳ độc quyền phân phối Việt Nam công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn MBT Chế phẩm có chứa nhiều loại vi sinh vật có tác dụng tăng cường hệ vi sinh vật có ích đất có lợi cho cây, ức chế lập ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 3.12 Phương pháp xác định pH  Chuẩn bị huyền phù Dùng thìa ml để lấy phần mẫu thử đại diện từ mẫu phòng thí nghiệm Cho phần mẫu thử vào bình mẫu (có thể tích nhỏ 50 ml làm thủy tinh bosilicat polyetylen có nắp nút kín) thêm vào thể tích nước (có độ dẫn điện riêng khơng lớn 0,2 mS/m 25 0C pH lớn 5,6), dung dịch kali clorua (1mol/lít) dung dịch canxi clorua (0,01mol/lít) gấp năm lần thể tích mẫu thử Trộn lắc mạnh huyền phù 60 phút – 10 phút máy lắc máy trộn chờ 1h không lâu 3h Phải tránh để khơng khí lọt vào khoảng thời gian sau lắc  Hiệu chuẩn máy pH-mét Điều chỉnh máy pH-mét theo hướng dẫn ghi sách hướng dẫn nhà sản xuất Hiệu chỉnh pH-mét quy định sách hướng dẫn nhà sản xuất, dùng dung dịch đệm 20 0C ± 0C Sử dụng điện cực điều kiện tốt, cân thường đạt 30 giây  Đo pH Đo pH huyền phù 20 0C ± 0C sau lắc Quá trình lắc phải đạt trạng thái huyền phù đồng hạt đất, phải tránh khơng khí lọt vào Đọc giá trị pH sau đạt trạng thái ổn định Chú ý ghi giá trị pH tới hai số thập phân Nếu sử dụng pH-mét kim dao động, phải ước lượng số lẻ thập phân thứ hai Ví dụ, giá trị pH đo vòng giây khơng sai khác q 0,02 đơn vị pH phép đo coi ổn định Thời gian yêu cầu để ổn định thường phút phụ thuộc vào số yếu tố sau: Giá trị pH (ở giá trị pH cao, khó đạt tới trạng thái ổn định); 27 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Chất lượng điện cực thủy tinh (sự khác chế tạo điện cực) thời gian sử dụng chúng; Môi trường dùng để đo pH (sự ổn định môi trường KCl CaCl2 đạt nhanh so với nước); Sự khác giá trị pH mẫu loạt mẫu đo: Thực khuấy trộn học trước đo giúp đạt kết ổn định thời gian ngắn Trong mẫu có hàm lượng chất hữu cao (đất than bùn, đất trồng chậu…) hiệu ứng huyền phù đóng vai trò quan trọng Đối với đất đá vơi, huyền phù hấp thụ carbon dioxit, trường hợp khó đạt tới giá trị pH cân  Độ lặp lại Độ lặp lại phép đo pH, thể khác hai huyền phù điều chế riêng biệt phải thỏa mãn yêu cầu đưa bảng 3.10 Bảng 3.10 Độ lặp lại chấp nhận phép đo pH Khoảng pH Mức chênh chấp nhận pH ≤ 7,00 0,15 7,00 < pH < 7,50 0,20 7,50 ≤ pH ≤ 8,00 0,30 pH > 8,00 0,40 3.13 Xác định độ ẩm phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi Cốc cân rửa sạch, đánh số, mở nắp cho vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 105oC ± 2oC Tại thời điểm sấy cuối cùng, đậy nắp cốc cân chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phòng, sau tiến hành cân (trước cân mở nắp cốc cân hộp cân để làm cân áp suất đậy lại ngay) 28 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Chuyển mẫu thử vào cốc cân, mở nắp cho vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 105oC ± 2oC Sau tiến hành sấy mẫu, với mẫu thử có khối lượng cân ban đầu 2g thời gian sấy làm nguội bình hút ẩm tới nhiệt độ phòng Cho lại mẫu thử vào tủ sấy tiến hành mẫu thử đạt khối lượng không đổi Mẫu thử coi đạt khối lượng không đổi, chênh lệch lần cân lien tiếp khơng lớn 0,05% mẫu thử có khối lượng cân ban đầu 2g  Tính tốn kết Độ ẩm (X) mẫu thử, tính phần trăm theo công thức sau: X (%) = 𝑚1 −𝑚2 𝑚1 −𝑚𝑜 x 100 Trong đó: m1: khối lượng cốc mẫu thử trước sấy (g) m2: khối lượng cốc mẫu thử sau sấy (g) mo: khối lượng cốc trước sấy (g) 3.14 Phương pháp phân lập Sau mẫu chế phẩm đem phòng thí nghiệm Tiến hành pha lỗng nhiều lần với nồng độ từ 10-1 đến 10-9 nước muối sinh lý 0,9% Hút 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml môi trường Ashby hấp khử trùng Tiếp theo lấy 0,1ml dịch pha loãng nồng độ cấy môi trường phân lập môi trường Ashby Cấy trang cách trải đĩa trang khơ mặt thạch hồn tồn đặt đĩa cấy nhiệt độ phòng vòng đến ngày Mỗi mẫu cấy lặp lại lần đĩa petri Theo dõi ngày, chọn khuẩn lạc rời rạc, tiến hành cấy ria nhiều lần môi trường Ashby tạo chủng giữ giống môi trường thạch nghiêng Ashby 3.15 Phương pháp nhuộm Gram Dùng que cấy vòng chấm nước cất lên lame dùng que cấy vòng chấm vào khuẩn lạc làm vết bôi, hơ lame lửa đèn cồn để cố định tiêu lame 29 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Bước 1: nhuộm tím crytal violet để ổn định phút, rửa nước cất (dùng bình tia phun mép vết bơi nhuộm, khơng phun trực tiếp lên làm trơi mẫu), thấm khô giấy thấm Bước 2: nhuộm glucol, ổn định phút, rửa nước cất Bước 3: dùng etanol 96o rửa mẫu 30 giây, dùng giấy thấm lau khô Bước 4: nhuộm bổ sung fucshin khoảng – phút, rửa lại nước cất, để khơ Bước 5: soi kính hiển vi 100X Quan sát kính hiển vi ghi nhận Gram vi khuẩn Nếu vi khuẩn có màu tím xanh crytal violet mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ fuchsin mẫu Gram âm 3.16 Phương pháp nhuộm bào tử Dùng que cấy vòng chấm nước cất lên lame dùng que cấy vòng chấm vào khuẩn lạc (nuôi cấy sau ngày) làm vết bơi − Làm khơ khơng khí, sau hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn – lần − Nhuộm dung dịch malachite 10 phút, rửa nước − Nhỏ – giọt Fuchsin 30 giây Rửa nước, để khô không khí − Soi kính: dùng vật kính dầu 100X − Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ Chú ý: phân biệt bào tử với hạt dị nhiễm bắt màu lục 3.17 Phương pháp Kjeldahl Tiến hành định lượng hàm lượng NH4+ phương pháp Kjeldahl: dùng pipet hút 2ml dịch ly tâm cho vào bình Kjedahl thêm 2g chất xúc tác (K2SO4: CúO4 tỉ lệ 3:1) lắc nhẹ, đậy kín phút Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình phễu thủy tinh, cho vào 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc 98% Giai đoạn thực tủ hote, đặt bình nghiêng bếp tránh trường hợp sơi mạnh hóa chất bắn ngồi khơng bị bay amoniac 30 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Trong đun, theo dõi màu đen dung dịch bình đun, thấy dung dịch gần suốt lắc nhẹ bình để kéo hết phân tử thánh bình chưa bị oxy hóa vào dung dịch Tiếp tục đun dung dịch hoàn toàn Để nguội bình chuyển tồn dung dịch sang bình định mức 50ml, dùng nước cất vơ dạm tráng lại bình Kjeldahl định mức tới vạch Sau cất đạm, chuyển 50ml dung dịch tronh bình định mức vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất giọt thuốc thử Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất Tashiro lúc có màu tím hồng, tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% tồn dung dịch chuyển màu xanh mạ (thêm 5ml NaOH 40% dung dịch tronh bình chưa chuyển hết sang màu xanh mạ) Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1N giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) Đặt bình hứng cho ngập đầu ống sinh hàn Bật công tắc cất đạm Kiểm tra xem từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không, không thêm NaOH 40% Sau cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH4OH tạo không, dùng giấy qùy thử đầu ống sinh hàn Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội tháo hệ thống đem rửa Chuẩn độ H2SO4 dư bình hứng NaOH 0,1N màu tím hồng chuyển sang màu xanh mạ Ghi nhận thể tích NaOH 0,1 N sử dụng Hàm lượng % nitơ tổng số tính theo cơng thức N (mg/ml) = {1,42 * (V1-V2)/a}*2 Với: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N chuẩn độ a số miligram nguyên liệu 31 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 1,42: hệ số, ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH tương đương với 1,42 mg Nitơ 3.18 Phương pháp dựng đường chuẩn IAA Xây dựng đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 mL đệm phosphate dung dịch IAA stock có nồng độ 160 μg/mL Sau pha lỗng stock đệm photphate để nồng độ 0; 5; 10; 15; 20; 25 μg/mL Bảng 3.11 Thiết lập đường chuẩn IAA Ống số ĐC Thể tích IAA 100 mg/l (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ IAA μg/ml 10 15 20 25 Thuốc thử Salkowski 2 2 2 OD 530nm 3.19 Phương pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị ống nước muối sinh lý 9ml tiệt trùng Từ môi trường nhân giống, lấy 1ml sinh khối Paenibacillus sp Cấy sang ống nước muối sinh lý, ta độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân đến 10-7 Từ ống nghiệm có nồng độ 10-5, 10-6, 10-7, hút 0.1ml cấy trang sang đĩa petri chứa môi trường Ashby agar, lặp lại lần nồng độ, ủ 30oC 48h đếm khuẩn lạc đĩa xác định mật độ vi sinh vật 𝐴= 𝑁 𝑛1 𝑉1 𝑓1 + ⋯ + 𝑛𝑖 𝑉𝑖 𝑓𝑖 Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n: số lượng đĩa cấy độ pha lỗng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mơi trường f: độ pha lỗng tương ứng 3.20 Phương pháp dựng đường chuẩn tế bào 32 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Xác định mật độ vi sinh vật dựa tương quan tuyến tính OD log nồng độ tế bào Tiến hành theo bảng 3.12: Bảng 3.12 Thiết lập đường chuẩn tế bào Huyền phù tế Dịch pha Hệ số pha OD N bào, ml loãng, ml lõang* 610nm (CFU/ml) 3,5 0,5 3,0 1,0 2,5 1,5 2,0 2,0 1,5 2,5 1,0 3,0 0,5 3,5 *Hệ số pha loãng ban đầu n, mẫu trắng dịch pha lỗng (mơi trường tiệt trùng môi trường suốt màu nhạt, ngược lại ly tâm mẫu pha loãng nước muối sinh lý) Từ huyền phù tế bào OD610nm ban đầu, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân 10-5,10-6, 10-7 trải đĩa môi trường Ashby hấp khử trùng, ủ 300C 24 giờ, đếm khuẩn lạc (25 – 250) Cơng thức tính mục 3.19 4.Các đường chuẩn Đường chuẩn Glucose 33 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Đường chuẩn Glucose 0.6 y = 1.1992x + 0.0705 R² = 0.9977 Nồng độ 0.5 0.4 đường chuẩn glucose 0.3 0.2 Linear (đường chuẩn glucose) 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 OD540nm Đường chuẩn IAA Đường chuẩn IAA 0.6 y = 0.0195x - 0.0104 R² = 0.9919 OD530nm 0.5 0.4 đường chuẩn IAA 0.3 0.2 Linear (đường chuẩn IAA) 0.1 -0.1 10 20 30 Nồng độ Đường chuẩn vi sinh vật Đường chuẩn tế bào 9.2 y = 2.4016x + 8.0303 R² = 0.9791 LogN 8.8 8.6 Đường chuẩn tế bào 8.4 Linear (Đường chuẩn tế bào) 8.2 0.2 0.4 0.6 OD610nm 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Hàm lượng nitơ dịch nuôi cấy chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật Nitơ tổng (mg/ml) Trung bình (mg/ml) 0,284 P1 0,142 0,213 0,213 0,852 P2 0,923 0,899 0,923 0,3976 P3 0,355 0,417 0,497 0,639 P4 0,497 0,615 0,71 ANOVA Table for Col_3 by Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 0.770718 0.256906 43.19 Within groups 0.047587 0.00594838 Total (Corr.) 0.818306 11 Multiple Range Tests for nito tong by chung vsv Method: 95,0 percent LSD chung vsv Count Mean Homogeneous Groups 0.213 X 3 0.416533 0.615333 0.899333 X X X 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Khảo sát hàm lượng IAA dịch nuôi cấy vi sinh vật Chủng vi sinh vật Hàm lượng IAA (μg/ml) Trung bình (μg/ml) 0,69 P1 0,74 0,70 0,69 0,84 P2 0.84 0,86 0,89 0,64 P3 0,69 0,63 0,58 0,74 P4 0,79 0,76 0,74 ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0788955 0.0262985 0.0004 Within groups 0.0105194 0.00131492 Total (Corr.) 0.0894149 11 20.00 Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups p3 0.635897 X p1 0.704274 X p4 0.755556 X p2 0.85812 36 X ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Khảo sát tỉ lệ mật rỉ bổ sung LogN Thời gian Mật rỉ 3% Trung bình 8,081 giờ 16 24 30 8,090 Mật rỉ 5% Trung bình 8,083 8,083 8,083 Mật rỉ 7% 8,084 8,105 8,086 8,117 8,114 8,098 8,146 8,113 8,100 8,101 8,158 8,107 8,107 8,148 8,686 8,773 8,230 8,723 8,707 8,770 8,778 8,250 8,712 8,792 8,225 8,514 8,601 8,582 8,570 8,556 8,571 8,593 8,569 8,583 8,606 8,560 8,476 8,566 8,527 8,460 8,508 8,481 8,595 8,602 37 bình 8,112 8,078 8,117 Trung 8,587 8,473 8,508 8,111 8,150 8,235 8,570 8,503 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Analysis of Variance for A.LogN - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:moi truong 0.10168 0.0508401 4.23 0.0220 B:thoi gian 2.20065 0.550162 45.77 0.0000 RESIDUAL 0.456757 38 0.0120199 TOTAL 2.75909 44 MAIN EFFECTS (CORRECTED) Multiple Range Tests for A.LogN by moi truong Method: 95.0 percent LSD moi truong Count 15 15 15 LS Mean 8.314 8.38793 8.42887 LS Sigma 0.0283078 0.0283078 0.0283078 38 Homogeneous Groups X XX X ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Khảo sát hàm lượng khống bổ sung LogN Thời gian 0,5X Trung bình 8,081 giờ 16 24 30 8,088 1,0X Trung bình 8,124 8,086 8,105 1,5X Trung bình 8,134 8,114 8,153 2,0X 8,145 8,138 8,114 8,148 8,155 8,225 8,218 8,369 8,218 8,225 8,239 8,222 8,347 8,379 8,189 8,232 8,210 8,419 8,225 8,108 8,852 8,521 8,703 8,113 8,101 8,891 8,846 8,543 8,551 8,707 8,083 8,795 8,588 8,679 8,534 8,899 8,495 8,719 8,560 8,554 8,898 8,897 8,469 8,479 8,794 8,568 8,893 8,473 8,795 8,248 8,893 8,273 8,406 8,250 8,250 8,249 8,874 8,886 8,890 8,288 8,307 40 bình 8,143 8,090 8,218 Trung 8,289 8,405 8,408 8,146 8,210 8,696 8,769 8,406 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP _ Analysis of Variance for B.logN - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:moi truong k 0.964159 0.321386 14.46 0.0000 B:thoi gian k 2.36191 0.590476 26.58 0.0000 RESIDUAL 1.15538 52 0.0222188 TOTAL 4.48144 59 MAIN EFFECTS (CORRECTED) Multiple Range Tests for B.logN by moi truong k Method: 95.0 percent LSD moi truong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0.5X 15 8.2432 0.0384871 X 1.5X 15 8.36847 0.0384871 X 2X 15 8.4456 0.0384871 X 1X 15 8.593 0.0384871 41 X ... Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm chất mang than bùn Tình hình nghiên. .. vậy, vi c tìm nguồn phân bón hữu vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học vấn đề cấp thiết Đó lý để sinh vi n thực đề tài Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm Mục đích nghiên cứu Nghiên. .. (2003) xác định P stellifer có khả sản xuất cyclodextrin ứng dụng thực phẩm 1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm 1.3.1 Định nghĩa Phân vi sinh cố định đạm sản phẩm chứa hay nhiều chủng vi sinh vật