BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực : PHAN ÁNH NGÂN MSSV: 1211100132 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu thực cá nhân em hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hai – giảng viên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Đề tài thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết tiến hành nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học, Khoa Cơng Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Tất số liệu, hình ảnh, kết nghiên cứu hồn tồn trung thực Đồ án không chép hình thức nào, có phát gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Tp HCM, ngày 15 tháng năm 2016 Sinh viên thực Phan Ánh Ngân i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trường đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt thời gian học tập trường Và đặc biệt, học kỳ Nếu khơng có lời hướng dẫn, dạy bảo thầy em nghĩ thu hoạch em khó hồn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực khoảng thời gian tháng Bước đầu vào thực tế em hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ bạn học lớp để kiến thức em lĩnh vực hoàn thiện Em xin gởi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp HCM, đặc biệt TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường trường tạo điều kiện cho em để em hồn thành tốt báo cáo đồ án tốt nghiệp Và em xin chân thành cám ơn thầy phòng thí nghiệm, anh chị, bạn nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp Trong trình thực đồ án tốt nghiệp, trình làm báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp Thầy/Cơ để em học thêm nhiều kinh nghiệm áp dụng vào công việc tới Em xin chân thành cảm ơn ! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC ĐÍCH NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu nấm Paecilomyces sp 1.1.1 Phân loại khoa học .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái .4 1.1.3 Cơ chế tiết độc tố nấm Paecilomyces 1.1.4 Chu kỳ sống chế tác động nấm Paecilomyces spp tuyến trùng 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển nấm Paecilomyces sp .7 Tổng quan tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh bướu rễ hồ tiêu 11 1.2.1 Tổng quan tuyến trùng ký sinh thực vật .11 1.2.2 Phân loại khoa học 14 Các nghiên cứu nước ngồi nhân ni sử dụng nấm Paecilomyces sp phòng từ tuyến trùng hại trồng 19 Các nghiên cứu nước nhân nuôi sử dụng Paecilomyces sp phòng trừ tuyến trùng hại 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 Thời gian địa điểm nghiên cứu .24 iii Vật liệu nghiên cứu, thiết bị hóa chất 24 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.2 Thiết bị 24 2.2.3 Các loại môi trường sử dụng 25 Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp .27 2.3.2 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng .28 2.3.3 Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 28 2.3.4 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29 2.3.5 Khảo sát phát triển nấm Paecilomyces sp loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) .30 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng loại chất khác lên phát triển nấm Paecilomyces sp 30 2.3.7 Ảnh hưởng thuốc trừ sâu, bệnh đến phát triển nấm Paecilomyces sp 31 2.3.8 Khảo sát khả kí sinh tuyến trùng Meloidogyne sp nấm Paecilomyces sp 35 2.3.9 Đánh giá tác động chế phẩm nấm Paecilomyces sp việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hồ tiêu 36 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 Kết hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp 38 Ảnh hưởng loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến phát triển Paecilomyces sp 39 iv 3.2.1 Ảnh hưởng loại thuốc trừ sâu đến phát triển Paecilomyces sp 39 3.2.2 Ảnh hưởng loại thuốc trừ nấm đến phát triển Paecilomyces sp 41 3.2.3 Khảo sát khả đồng sinh trưởng nấm Trichoderma sp Paecilomyces sp 43 Khảo sát ảnh hưởng loại mơi trường dinh dưỡng đến hình thành phát triển nấm Pacilomyces sp (môi trường lỏng) .44 3.3.1 Khảo sát môi trường tối ưu cho sinh trưởng phát triển nấm Paecilomyces sp 44 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến hình thành phát triển nấm Paecilomyces sp (môi trường rắn) 49 Khảo sát khả phòng trừ tuyến trùng hồ tiêu chế phẩm nấm Paecilomyces sp 52 3.4.1 Trong điều kiện phòng thí nghiệm 52 3.4.2 Trên đồng ruộng .55 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 Kết luận 58 Kiến nghị .58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tài liệu tiếng việt 59 Tài liệu tiếng anh 59 Tài liệu từ internet 61 PHỤ LỤC .1 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDB: Czapeck – Dox CMB: Complete Media NSC: ngày sau cấy NT: nghiệm thức PDA: Potato D – Glucose Agar SDAY1: Sabourand dextrose Yeast SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng vi DANH MỤC BẢNG Bảng Bố trí thí nghiệm .31 Bảng 2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ sâu .32 Bảng Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm .33 Bảng Bố trí thí nghiệm khả đồng sinh trưởng Trichoderma sp Paecilomyces sp 35 Bảng Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động chế phẩm Paecilomyces sp 37 Bảng Đường kính tản nấm Paecilomyces sp loại môi trường trừ nấm .40 Bảng Ảnh hưởng loại thuốc trừ nấm đến phát triển nấm Paecilomyces sp 40 Bảng 3 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp 41 Bảng Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế 41 Bảng Đường kính tản nấm Paecilomyces sp 43 Bảng Đường kính tản nấm Trichoderma sp cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp 43 Bảng Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp sau thời gian nuôi cấy môi trường lỏng lắc .44 Bảng Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp tính theo logarit 46 Bảng Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy 51 Bảng 10 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp nhân nuôi khay ngô mảnh gạo 52 Bảng 11 Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng Meloidogyne sp bị nấm Paecilomyces sp ký sinh .53 Bảng 12 Đánh giá cấp hại tuyến trùng hồ tiêu 55 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces sp nuôi môi trường PDA Hình 1.2 Nấm Paecilomyces sp, chụp kính hiển vi Hình 1.3 Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) Hình 1.4 Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật 15 Hình 1.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp 17 Hình 1.6 Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp phòng trừ tuyến trùng .22 Hình 3.1 Nấm Paecilomyces sp mơi trường PDA .38 Hình 3.2 Tản nấm Paecilomyces sp mơi trường PDA có bổ sung loại thuốc hóa học (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) 39 Hình 3.3 Nấm Paecilomyces sp mơi trường PDA có bổ sung loại thuốc hóa học (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42 Hình 3.4 Đĩa nấm cấy đồng thời Trichoderma sp Paecilomyces sp .44 Hình 3.5 Dịch ni cấy nấm Paecilomyces sp loại môi trường (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3) 45 Hình 3.6 Mật độ bào tử tính theo logarit bốn loại mơi trường lỏng 48 Hình 3.7 Hình nấm Paecilomyces sp nuôi cấy loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) 50 Hình 3.8 Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn loại môi trường 51 Hình 3.9 Nấm Paecilomyces sp nhân nuôi khay 52 Hình 3.10 Tỷ lệ tuyến trùng Meloidogyne sp bị chết ngày sau lây nhiễm Error! Bookmark not defined Hình 3.11 Nấm Paecilomyces sp cơng trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: tuyến trùng trước lây nhiễm nấm; C, E: tuyến trùng bị lây nhiễm nấm soi kính hiển vi; D, F: viii mang túi trứng tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp soi kính hiển vi sau nhuộm Methylene blue) 54 Hình 3.12 Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp tưới vào gốc hồ tiêu 56 Hình 3.13 Trước tưới .57 Hình 3.14 Sau tưới 57 ix Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.070887 7392 7554 7593 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.6090 SDAY3 B A 9.3109 SDAY1 B C 8.7888 CDB C 8.2753 CMB Ở thời điểm ngày The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels MTLONG Values CDB CMB SDAY1 SDAY3 Number of observations Mat tren MT long 6N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Corrected Total R-Square Squares Mean Square F Value Pr > F 0.44147837 32.39 0.0029 1.32443510 0.05452325 0.01363081 1.37895835 Coeff Var Root MSE 15 KQ Mean Đồ án tốt nghiệp 0.960461 1.278488 Source DF MTLONG 0.116751 Anova SS 9.131963 Mean Square 1.32443510 F Value 0.44147837 Pr > F 32.39 0.0029 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.013631 5375 5512 5564 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.6558 SDAY3 B A 9.3218 SDAY1 B C 8.9954 CDB C 8.5548 CMB Ở thời điểm ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square 2.70089446 0.90029815 0.84765622 Corrected Total 3.54855068 Coeff Var Root MSE 0.761126 5.187303 0.460341 MTLONG DF Anova SS 4.25 0.0980 0.21191406 R-Square Source F Value Pr > F 2.70089446 16 KQ Mean 8.874384 Mean Square 0.90029815 F Value Pr > F 4.25 0.0980 Đồ án tốt nghiệp Mat tren MT long 9N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 23 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.211914 1.278 1.306 1.313 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.5275 SDAY3 B A 9.1931 SDAY1 B A 8.8067 CDB B 7.9701 CMB Ở thời điểm 12 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square F Value Pr > F 0.20479350 32.58 0.0029 0.61438049 0.02514549 Corrected Total 0.00628637 0.63952598 R-Square Coeff Var Root MSE 0.960681 0.912709 0.079287 Source MTLONG Mat tren MT long 12N DF Anova SS 0.61438049 KQ Mean 8.686956 Mean Square F Value 0.20479350 16:55 Tuesday, January 6, 2004 28 17 Pr > F 32.58 0.0029 Đồ án tốt nghiệp The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.006286 3650 3744 3779 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N MTLONG A 9.05714 SDAY3 A 8.84903 SDAY1 B 8.45424 CDB B 8.38741 CMB Ở thời điểm 14 ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square F Value Pr > F 0.31737314 42.92 0.0017 0.95211943 0.02957659 Corrected Total 0.00739415 0.98169602 R-Square Coeff Var Root MSE 0.969872 1.034209 0.085989 Source DF MTLONG Anova SS Mat tren MT long 14N KQ Mean 8.314494 Mean Square 0.95211943 F Value 0.31737314 16:55 Tuesday, January 6, 2004 32 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ 18 Pr > F 42.92 0.0017 Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.007394 3959 4060 4098 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N MTLONG A 8.73951 SDAY1 A 8.55824 SDAY3 B 8.05880 CDB B 7.90142 CMB A.7 MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN TÍNH THEO LOGARIT Mat 16:44 Tuesday, January 6, 2004 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels MT Values Bap Cam Gao Lua Number of observations 12 Mat 16:44 Tuesday, January 6, 2004 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Corrected Total R-Square Squares Mean Square F Value Pr > F 0.97232857 269.93 F 269.93 F Anova SS KQ Mean 4.716667 Mean Square 0.48166667 0.48166667 F Value Pr > F 6.28 0.0663 18:36 Friday, January 16, 2004 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.076667 Number of Means Critical Range 6277 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N DK A 5.0000 DC A 4.4333 Tricho Ở thời điểm ngày Number of observations The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Squares Mean Square F Value Pr > F 4.50666667 22.92 0.0087 4.50666667 21 Đồ án tốt nghiệp Error 0.78666667 Corrected Total 0.19666667 5.29333333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.851385 7.825962 0.443471 Source DF DK The SAS System Anova SS KQ Mean 5.666667 Mean Square 4.50666667 4.50666667 F Value Pr > F 22.92 0.0087 18:36 Friday, January 16, 2004 12 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.196667 Number of Means Critical Range 1.667 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N DK A 6.5333 DC B 4.8000 Tricho Ở thời điểm ngày The ANOVA Procedure Dependent Variable: KQ Sum of Source DF Model Error Corrected Total Source Squares Mean Square 11.20666667 11.20666667 1.02666667 0.25666667 43.66 0.0027 12.23333333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.916076 7.307060 0.506623 DF F Value Pr > F Anova SS 22 KQ Mean 6.933333 Mean Square F Value Pr > F Đồ án tốt nghiệp DK The SAS System 11.20666667 11.20666667 43.66 0.0027 18:36 Friday, January 16, 2004 16 The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for KQ Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.256667 Number of Means Critical Range 1.905 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping B Mean N DK A 8.3000 DC B 5.5667 Tricho XỬ LÝ EXCEL B.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Tỷ lệ ức chế (%) 3NSC 5NSC 7NSC ĐC 100 100 100 Sherpa 29,17 29,03 30,07 Plutel 37,5 41,93 41,03 Oshin 12,5 0 8,3 3,23 5,13 ĐC 100 100 100 Sherpa 32 32,3 28,21 52 43,08 48,72 25EC 20WP Actara 25WG 25EC Plutel 23 Đồ án tốt nghiệp Oshin 24 4,62 17,95 4,62 2,56 ĐC 100 100 100 Sherpa 27,27 28,13 19,44 Plutel 50 46,87 30,5 Oshin 9,38 0 0 20WP Actara 25WG 25EC 20WP Actara 25WG B.2 ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU Tỷ lệ ức chế (%) NSC NSC NSC ĐC 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 Cup 2,9 SL 43,75 38,46 23,08 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 ĐC 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 Cup 2,9 SL 20 31,25 20,51 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 ĐC 0 Carbenzin 50WP 100 100 100 24 Đồ án tốt nghiệp Cup 2,9 SL 9,09 32,26 16,67 Saizole 5SC 100 100 100 Antracol 70WP 100 100 100 B.3 KHẢ NĂNG ĐỒNG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM PAECILOMYCES SP VÀ TRICHODERMA SP Đường kính tản nấm Paecilomyces sp (cm) ngày ĐC Pae 1,60 2,60 2,90 Pae 1,20 1,30 1,80 ĐC Pae 1,70 2,10 3,10 Pae 1,60 1,30 2,40 ĐC Pae 1,50 2,20 2,40 Pae 1,40 1,90 2,10 NSC NSC NSC DC 5,10 6,40 8,00 Tricho 4,00 4,10 4,80 DC 4,90 6,70 8,50 Tricho 4,70 5,10 5,90 DC 5,00 6,50 8,40 Tricho 4,60 5,20 6,00 Đường kính tản nấm Trichoderma sp (cm) B.4 MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG THEO LOGARIT CDB ngày ngày 8,21 8,44 8,86 8,86 25 Đồ án tốt nghiệp CMB 7,43 8,16 8,59 8,62 SDAY1 8,86 9,22 9,24 9,16 SDAY3 8,74 9,56 9,64 9,52 CDB 8,43 9,13 9,13 8,75 CMB 8,42 8,39 8,52 7,32 SDAY1 8,86 9,41 9,40 9,23 SDAY3 8,74 9,58 9,67 9,54 B.5 MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN Gao 20260000000 Bap 28400000000 Lua 5640000000 Cam 2300000000 Gao 23300000000 Bap 41300000000 Lua 5270000000 Cam 2170000000 Gao 26700000000 Bap 39500000000 Lua 5600000000 Cam 1830000000 B.6 SỐ LƯỢNG TUYẾN TRÙNG CÁI LÂY NHIỄM NẤM PAECILOMYCES SP Lần Lần Lần ngày 3 3 ngày 4 4 26 Đồ án tốt nghiệp ngày 7 ngày 8 C HÌNH ẢNH 27 Đồ án tốt nghiệp 28 Đồ án tốt nghiệp 29 ... chọn đề tài: Sản xuất nấm Paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại hồ tiêu Đồ án tốt nghiệp MỤC ĐÍCH Chọn mơi trường tốt cho sinh trưởng phát triển nấm Paecilomyces sp.. . mẫn cảm tuyến trùng, thực trước trồng, sau thu hoạch bảo quản Các nghiên cứu nước nhân ni sử dụng nấm Paecilomyces sp phòng từ tuyến trùng hại trồng Nấm gây bệnh cho tuyến trùng tuyến trùng tác... số lượng tuyến trùng trứng tuyến trùng bị nhiễm M Javanica tác nhân gây bệnh làm rễ sần to Nấm đạt hiệu cao nấm tuyến trùng nhiễm đồng thời nấm nhiễm trước tuyến trùng nhiễm sau Tuyến trùng trưởng