Đồ án tốt nghiệp  LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Lê Minh Nhựt, sinh viên nghành Công Nghệ Sinh Học khóa 2011 trường Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Tơi xin cam đoan: ✓ Cơng trình nghiên cứu tơi thực ✓ Các số liệu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố nghiên cứu khác hay phương tiện truyền thơng Tơi xin hồn tòa chịu trách nhiệm kết nghiên cứu luận văn tốt nghiệp SINH VIÊN Lê Minh Nhựt Đồ án tốt nghiệp  LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành với quan tâm giúp đỡ nhiều thầy cô, anh chị bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ths Võ Minh Sơn, phòng Sinh Học thực nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II ln tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em thực hồn khóa luận tốt nghiệp Ts Hồng Quốc Khánh, Thầy Ngơ Đức Duy, anh Dũng, chị Loan phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Đại Học Công Nghệ TP.HCM truyền đạt kiến thức làm tảng vững cho em đủ khả thực đề tài Xin cảm ơn bạn 11DSH01, 11DSH02 quan tâm, giúp đỡ chia sẻ niềm vui nỗi buồn suốt trình học tập trường Và cuối xin cảm ơn Ba Mẹ ni nấng, chăm sóc, ln dạy điều hay lẽ phải tạo điều kiện cho ăn học nghiêm túc để trở thành người có ích cho gia đình xã hội Đồ án tốt nghiệp  MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hệ vi sinh vật nuôi trồng thủy sản 1.2 Các q trình chuyển hóa nitơ vô 1.2.1 Q trình nitrate hóa 1.2.2 Vai trò nhóm vi khuẩn nitrate hóa 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình nitrate hố 1.3 Nhóm vi khuẩn Nitrosomonas 11 1.3.1 Các thông số sinh lý vi khuẩn Nitrosomonas 13 1.3.2 Q trình nitrite hố Nitrosomonas 13 1.4 Nhóm vi khuẩn Nitrobacter 17 1.4.1 Sự phân bố điều kiện tồn 18 1.4.2 Những nghiên cứu vi khuẩn Nitrobacter 18 1.4.3 Q trình nitrate hố Nitrobacter 19 1.5 Nhóm vi khuẩn Bacillus 21 1.5.1 Đặt điểm sinh học Bacillus 21 1.5.2 Quá trình hình thành bào tử 21 1.5.3 Vai trò Bacillus thủy sản 22 1.6 Kỹ thuật PCR ứng dụng 26 i Đồ án tốt nghiệp  1.6.1 Kỹ thuật PCR 26 1.6.2 Kỹ thuật giải trình tự Nucleotide 27 1.6.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Mẫu phân lập 29 2.1.2 Điều kiện thực nghiệm 30 2.1.2.1 Hóa chất 30 2.1.2.2 Trang thiết bị 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Thu mẫu 32 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 32 2.2.3 Quan sát đặc điểm hình thái 32 2.2.4 Kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn 33 2.2.4.1 Thí nghiệm khả chuyển hóa Nitrite 33 2.2.4.2 Xác định hàm lượng nitrite Test kit 34 2.2.4.3 Xác định hàm lượng nitrite phương pháp Griess llosvay 35 2.2.5 Định danh sinh hóa test kit API 37 2.2.5.1 Định danh sinh hóa API 20E 37 2.2.5.2 Định danh vi khuẩn API 50CH 38 2.2.6 Định danh sinh học phân tử 39 2.2.6.1 Quy trình ly trích thu nhận DNA 39 2.2.6.2 Kiểm tra chất lượng DNA sau ly trích 40 2.2.6.3 Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rDNA 40 ii Đồ án tốt nghiệp  2.2.6.4 Định danh vi khuẩn dựa vùng gen 16S rDNA 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết phân lập kiểm tra hình thái học 42 3.1.1 Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc 42 3.1.2 Kết nhuộm Gram, quan sát tế bào nhuộm bào tử 43 3.1.2.1 Kết nhuộm Gram, quan sát tế bào 43 3.1.2.2 Kết nhuộm bào tử 44 3.1.3 Chọn lọc vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite 45 3.2 Kết định danh sinh hóa vi khuẩn 47 3.2.1 Định danh API 20E test kit 47 3.2.2 Định danh test API 50CHB 49 3.3 Kết định danh sinh học phân tử 51 3.3.1 Kết ly trích DNA gen 51 3.3.2 Kết khuếch đại đoạn gen kĩ thuật PCR chủng vi khuẩn 52 3.3.3 Kết giả trình tự chủng vi khuẩn 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC iii Đồ án tốt nghiệp  DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABIL Ammonia Binding Inoculum Liquid AMO Amonia Monooxygenase AOB Ammonia Oxydizing Bacteria BHI Brain Heart Infusion Agar CFU Colony Forming Unit ĐC Đối Chứng DNA Deoxyribomucleotide Acid DO Dissolved Oxygene FA Fluoresent Antibody FISH Fluorescent Insitu Hybridization HAO Hydroxylamine Oxireductase MPN Most Probable Number PCR Polymerase Chain Reaction RET Reverse Electron Transport TAE Tris- Acetic acid-Ethyleneamine-Tetraacetae TAN Total Ammonia Nitrogen iv Đồ án tốt nghiệp  DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Vòng tuần hồn nitơ (nguồn Boyd, 1998) Hình 1.2: Con đường vận chuyển điện tử Nitrosomonas (Prescoot, 2002) 16 Hình 1.3: Con đường vận chuyển điện tử Nitrobacter (Wallace, 1969) .19 Hình 2.1: Quy trình nghiên cứu .31 Hình 2.2: Sera NO2 Test Kit 34 Hình 2.3: Bảng so màu kiểm tra hàm lượng nitrite môi trường nước .35 Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc B1, B2 môi trường BHI 42 Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc B3, B4 mơi trường BHI 43 Hình 3.3: Hình dạng tế bào vi khuẩn B1, B2 (100 X) 43 Hình 3.4: Hình dạng vi khuẩn B3, B4 (100 X) 44 Hình 3.5: Kết nhuộm bào tử B1, B2 (100X) 45 Hình 3.6: Hình nhuộm bào tử B3, B4 (100X) 45 Hình 3.7: Kết kiểm tra hàm lượng nitrite 46 Hình 3.8: Kết kiểm tra nitrite Sera test sau 24 46 Hình 3.9: Kết test API vi khuẩn B4 49 Hình 3.10: Kết định danh B1 B2 API 50CHB .51 Hình 3.11: Kết điện di DNA tổng số gel agarose 1,5% 52 Hình 3.12: Kết khuếch đại đoạn gen chủng vi khuẩn kĩ thuật PCR 52 Hình 3.13: Cây phát sinh lồi chủng B1, B2 B4 với loài ngân hàng gen NCBI 54 v Đồ án tốt nghiệp  DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrite phương pháp Griess llosway .36 Bảng 2.2: Các tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn xác định kit API 20E .38 Bảng 3.1: Kết kiểm tra nitrite .47 Bảng 3.2: Kết phân tích số sinh lý sinh hóa chủng B4 kit API 20E .48 Bảng 3.3: Kết phân tích số sinh lý sinh hóa chủng B1 B2 kit API 50CHB .49  vi Đồ án tốt nghiệp  MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong ni trồng thủy sản tiêu mơi trường TAN, NO2 - NO3 – yếu tố quan tâm trực tiếp ảnh hưởng đến sinh trưởng loài sinh vật ao Theo De Silva et al., (2010) ni cá tra thức ăn viên công nghiệp thải môi trường 46,0 kg nitơ 14,0 kg phospho Môi trường ao nuôi ô nhiễm nguyên nhân làm cho tỷ lệ cá chết hao hụt nhiều (Cao Văn Thich, 2008) Trong ni thủy sản nói chung ammonia thải vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa ammonia thành nitrite (Huey Beitinger, 1980) Nitrite xem khí độc tồn môi trường ao làm ảnh hưởng đến sức khỏe cá hàm lượng tăng cao Ở cá nitrite tích trữ huyết tương nguyên nhân gây q trình oxy hóa Hb (Hemoglobin) thành MetHb (Methemoglobin) MetHb không vận chuyển oxy nên nitrite trở thành độc chất mức thấp chất gây độc cho nhiều loài cá (Huertas et al., 2002) Trong ao nuôi cá với mật độ thả cao lượng thức ăn sử dụng nhiều (Lam et al., 2009) dẫn đến chất thải từ phân cá thức ăn dư thừa nguồn gốc hình thành lượng lớn khí ammonia ao ni trở thành yếu tố bất lợi cho cá Chính khóa luận tiến hành phân lập bước đầu định danh phản ứng sinh hóa, kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định số chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa nguồn NO2 phục vụ cho ni trồng thủy sản Mục đích nghiên cứu ✓ Phân lập, chọn lọc định danh số chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite nước nuôi trồng thủy sản, nhằm tăng khả hấp thu nguồn gây độc thủy sản ✓ Tạo nguồn giống vi khuẩn chủng cho nghiên cứu chuyên sâu khả sử ứng dụng thực tế loài vi khuẩn định danh Đồ án tốt nghiệp  Nhiệm vụ nghiên cứu ✓ Phân lập chọn lọc số chủng vi khuần có khả chuyển hóa nguồn nitrite môi trường nuôi trồng thủy sản ✓ Định danh vi khuẩn hình thái học, sinh lí, sinh hóa phương pháp sinh học phân tử dựa trình tự gen 16S rDNA Phương pháp nghiên cứu ✓ Phân lập chọn lọc vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite thơng qua Sera Test Kit phương pháp Griess llosvay ✓ Định danh sinh lý, sinh hóa thông qua API Test Kit ✓ Định danh sinh học phân tử phương pháp PCR thông qua vùng gen 16S rDNA ✓ Ứng dụng phần mềm sở liệu sinh tin học như: ChromasPro, MEGA5, seaview4 4.32.0.0 ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.gov/ Kết đạt Sau trình nghiên cứu đề tài phân lập định danh chủng vi khuẩn Dựa nghiên cứu giới bước đầu nhận định có chủng vi khuẩn có khả sử dụng nguồn nitrite cao Kết cấu đề tài Đề tài gồm chương Chương 1: Tổng quan tài liệu Trình bày thơng tin liên quan tới vi sinh vật xử lý nước nuôi trồng thủy sản, vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter, Bacillus, q trình nitrate hóa thông tin phương pháp sinh học phân tử sử dụng định danh vi khuẩn Chương 2: Vật liệu phương pháp Trình bày tồn nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ q trình nghiên cứu tồn quy trình, thao tác thực nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Trình bày kết chi tiết tồn q trình thực nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp  CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Phân lập làm chủng vi khuẩn B1, B2, B3 B4 Thông qua so sánh lại đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào chọn chủng B1, B2 B4 bao gồm: chủng Gram dương B1 B2 có khả sinh nội bào tử chủng gram âm B4 không sinh bào tử Cả chủng có khả sử dụng nguồn nitrite sau 24 với tỉ lệ chuyển hóa B1, B2 B4 96,84%, 96,17% 95,57% Kết định danh vi khuẩn kit API 20E: chủng B4 thuộc loài Enterobacter cloacae với độ tương đồng đạt 94,1% Kết định danh vi khuẩn API 50CHB: hai chủng B1 B2 thuộc nhóm lồi Bacillus cereus với độ tương đồng 91,4%, 95,9% Kết định danh sinh học phân tử: - Chủng B1 thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus thuringensis, Bacillus anthracis với độ tương đồng đạt 100% - Chủng B2 thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus cereus, Bacillus thuringensis, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis với độ tương đồng 99% - Chủng B4 thuộc nhóm vi khuẩn Enterobacter cloacae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter luwigii với độ tương đồng đạt 99% Dựa vào mức độ tương đồng, hình thái học, kết định danh API 20E API 50CHB Test Kit chủng vi khuẩn, nhận diện chủng vi khuẩn: - Chủng B1 B2 thuộc loài Bacillus cereus - Chủng B4 thuộc loài Enterobacter cloacae 56 Đồ án tốt nghiệp  4.2 Kiến nghị Cần khảo sát đặc tính chủng phân lập nhằm tiến đến mục tiêu tạo sản phẩm chuyển hóa nitrite tốt cho ni trồng thủy sản Khảo sát độc tính chủng nhằm chọn chủng an tồn cho vật ni Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tối ưu hóa điều kiện ni cấy     57 Đồ án tốt nghiệp  TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cao Văn Thích, 2008 Chất lượng nước tích lũy vật chất dinh dưỡng ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) thâm canh quận Ơ Mơn thành phố Cần Thơ Luận văn Thạc sĩ Nuôi trồng Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử (tái lần 2) Nhà xuất Giáo dục, 301 trang Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Đăng Phúc Hải, Bùi Văn Đạt, Võ Văn Nha, 2009 Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic tạo chế phẩm ni tơm sú Tạp chí Khoa học Cơng nghệ trường Đại học kỹ thuật, 74: 113-117 Kiều Hữu Anh Ngô Tự Thành, 1985 Vi sinh vật học nguồn nước Dịch từ nguyên tiếng Đức Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Kiều Hữu Anh Ngô Tự Thành, 1985 Vi sinh vật học nguồn nước Dịch từ nguyên tiếng Đức Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lê Đức Trình, 2001, Sinh Học Phân Tử tế bào Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 266 trang Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dương Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh, Nguyễn Thị Ngọc Diệp Đinh Duy Kháng, 2005 Định loại chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dùng sản xuất biosubtyl trình tự gen 16S rRNA đánh giá XII thành phần kháng nguyên chủng Western Blot, Tổ Chức Y học dự phòng, số 77 năm 2005 Lê Văn Khoa, 1995 Môi trường ô nhiễm, Nhà xuất Giáo dục, trang 49105 Lê Xuân Phương, 2007 Vi sinh vật học môi trường Trường Đại học Kỹ thuật Đà Nẵng, 308 trang 10 Nguyễn Lân Dũng, 1983 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, 368 trang 11 Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Nguyễn Văn Thanh, Đặng Tố Vân Cầm, Vũ Hồng Như Yến, Trần Nguyễn Ái Hằng, 2010 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi 58 Đồ án tốt nghiệp  sinh từ dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio sp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển tôm sú Đề tài thuộc chương trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, thủy sản, 2008 – 2010, 124 trang 12 Phạm Thị Tuyết Ngân, Nguyễn Hữu Hiệp, 2010 Định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm phép thử sinh hóa kỹ thuật sinh học phân tử Kỷ yếu khoa học thủy sản lần 4, Đại học Cần Thơ, 2010, trang 42-54 13 Phan Cự Nhân, 2001, Di truyền học động vật, NXB KHKT, Hà Nội, 235 trang 14 Trần Nhân Dũng, 2011 Sổ tay thực hành sinh học phân tử Nhà xuất Đại học Cần Thơ, 169 trang 15 Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trương Hồng Vân, Lê Tấn Hưng Trần Thạnh Phong, 2004 Kết khảo nghiệm chế phẩm VEM BIOII ao nuôi tôm sú Tuyển tập Hội thảo Toàn Quốc nghiên cứu ứng dụng Khoa học Công nghệ nuôi trồng thuỷ sản taị Vũng Tàu, 22-24/12/2004: trang 257-266 Tiếng anh 16 Aleem, M.I.H and M Alexander, 1960 Nutrition and physiology of Nitrobacter agilis Appl Microbiol, 8: 80-84 17 Balcázar, J.L., T Rojas-Luna and D.P Cunningham, 2007 Effect of the addition of four potential probiotic strains on the survival of pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) following immersion challenge with Vibrio parahaemolyticus J Invertebr Pathol , 96 (2): 147-150 18 Banwart, G.J., 2000 Basic food microbiology Department of Microbiology The Ohio State University, 773p 19 Belser, L.W and E.L Schmidt, 1978 Diversity in the ammonium oxidising nitrification population of a soil Appl Environ Microbiol, 36: 584-588 20 Bock, E and H.P Koops, 1992 The genus Nitrobacter and related genera in Balows, Truper, Dsorkin, Harder and Schleifer The prokaryoites A Handbook on the Biology of Bacteria Ecophysiology isolation, Identification, Application, 2nd ed, Springer, Verlag, NewYork, 3: 2302-2309 21 Boyd, C.E., 1998 Water quality for pond aquaculture Alabama Agriculture experiment Station Auburn University Alabama Research and Development Series (Department of Fisheries and Applied Aquacultures Auburn University, Alabama 36849 USA) No 43, 37 p 59 Đồ án tốt nghiệp  22 Breed, R.S., E.G.D Muray and N.R Smith, 1957 Bergey’s manual of determinative bacteriology (7th ed.) Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 23 Cole J.A, 1994 Biodegradation of inorganic introgen compounds in “Biochemistry of microbial degradation” Ratledge C.kluwer Academic publishers: 487-512 24 Colliver, B B.; Stephenson, T., Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers Biotechnology Advances 2000, 219-232 25 Degramge, V and R Bardin, 1995 Detection and counting of Nitrobacter population in soil by PCR, Environ Microbiol, 61: 2093-2098 26 Degramge, V., R Lensi and R Bardin, 1997 Activity, size and structure of a Nitrobacter community as affected by organic carbon and nitrite in steeerile soil FEMS Microbiol Ecol, 24: 173-180 27 Driks, A., 1999 Bacillus subtilis spore coat Microbiol Mol Biol Rev 63: 120 28 Ehrlich, G G., 1975 Water quality: Analytical Methods - "Nitrifying bacteria (most probable number, MPN, method)" in: quality of water branch technical memorandum R J Pickering No 75, 13p 29 Engel, M.S., 1960 Morphology of Nitrosomonas europaea and classification of the nitrifying bacteria, In: Biology Division, Oak Ridge National Laboratory Oak Ridge Tennessee: 833-834 30 Graslund, S., K Holstrom and A Wahlstrom, 2003 A field survey of chemicals and biological products used in shrimp farming, Marin Pollut Bullet, 46: 81-90 31 Grommen, R., I Van-Hauteghem, M Van-Wabeke and W Verstraete, 2002 An improved nitrifying enrichment to remove ammonium and nitrite from freshwater aquaria systems Aquaculture, 211: 115-124 32 Grommen, R., I Van-Hauteghem, M Van-Wambeke, and W Vertraete, 2001a Use of a nitrifying culture to shorten the activation time of biofilters for the removal of ammonium and nitrite in freshwater aquaria.Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschappen, Gent, 66: 79-86 33 Gulliana, M., F Thompson and J Rodríguez, 2004 Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei Aquaculture, 233: 1-14 60 Đồ án tốt nghiệp  34 Hagopian, D S.; Riley, J G., A closer look at the bacteriology of nitrification Aquacultural Engineering 1998, 223-244 35 Herbert, R.A., 1999 Nitrogen cycling in coastal marine ecosystems FEMS Microbiology Reviews, 23: 563-590 36 Hesselsøe, M and J Sorenser, 1998 Microcolony formation as a viability index for ammonia oxidizing bacteria: Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp FEMS Microbiol Ecol, 28: 383-391 37 Hochheimer, J.N and F.W Wheaton, 1991 Understanding biofilters, practical microbiology for ammonia removal in aquaculture Proceeding of the Aquaculture Symposium, 4-6 April 1991, Cornell University, Ithaca, NY, USA: 57-83 38 Hooper, A.B., T Vannelli and D.M Bergmann, 1997 Enzymology of the oxidation of ammonia to nitrite by bacteria J.Gen Molec Microbiol, 71: 59-67 39 Huertas M., Gisbert, E., Rodríguez, A, Cardona, L., Williot, P and CastellóOrvay, F., 2002 Acute exposure of Siberian sturgeon (Acipenser baeri, Brandt) yearlings to nitrite: median-lethal concentration (LC50) determination, haematological changes and nitrite accumulation in selected tissues Aquatic Toxicology 57: 257–266 40 Huey David W and Thomas L Beitinger, 1980 Hematological Responses of Larval (Rana catesbiana) to Sublethal Nitrite Exposures Bull Environm Contam Toxicol 25: 574-577 41 Katz, E., and A.C Demain, 1977 The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible functions Bacteriol Rev, 41: 449-474 42 Koops H.P., B Bottcher, U.C Moller, A Pommerening-Roser and G Stehr, 1990 Description of a new species of Nitrosococcus Arch Microbiol, 154: 244248 43 Koops, H.P., and A Pommerening-Roser, 2001 Distribution and ecophysiology of the nitrifying bacteria emphasizing cultured species FEMS Microbiol Ecol, 37: 44 Losordo, T.M and M.B Timmons, 1994 An introduction to water re-use systems.In: Timmons, M.B., Losordo, T.M (Eds) Aquaculture water reuse systems: Engineering Design and management Elservier, Amterdam: 1-7 45 Meiklejohn, J., 1950 The isolation of Nitrosomonas europaea in pure culture J Gen Microbiol, 4: 185-190 61 Đồ án tốt nghiệp  46 Meunpol, O., K Lopinyosiri and P Menasveta, 2003 The effect of azone and probiotics on the survival of black tiger shrimp (Pemaues monodon) Aquacuture, 220: 437-448 47 Mirel, D.B., W.F Estacio, M Mathieu, E Olmsted, J Ramired and L.M Marquez-Magana, 2000 Environmental regulation of Bacillus subtilis σDDependent gene expresstion J Bacteriol, 182: 3055-3062 48 Moriarty D J W, O Decamp and P Lavens, 2005 Probiotics in aquaculture In AQUA Culture AsiaPacific Magazine | September/October 2005, 15: 1-3 49 Moriarty, D J W., 1999 Disease control in shrimp Aquaculture with probiotic bacteria Biomanagement system Pty Ltd., 315 Main road, Wellington point Quennsland 4160 Australia and Department of Chemical Engineering The University of Queensland Qld 4072 Australia 50 Parry, J.M., P.C.B Turbbull and J.R Gibson, 1983 A colour Atlas of Bacillus species Wolfe Medical Publication, Ltd., London, 272p 51 Phillips, C.J., E.A Paul and J.I Prosser, 2000 Quantitative analysis of ammoniaoxidising bacteria using competitive PCR FEMS Microbiol Ecol, 32: 167-175 52 Prangya P Rout, Puspendu Bhunia, Rajesh R Dash (2013) Analyzing Simultaneous Heterotrophic Nitrification and Anerobic Denitrification Potential of a Newly Isolated Bacterium, Bacillus cereus strain GS5 Institude of Reseach Engineers and Doctor DOI 10 15224/ 978-1-63248-030-9-166 53 Prescoot, L M., Microbiology ed.; McGraw−Hill: New York, 2002; p 1147 54 Q L Zhang, Y Liu, G M Ai, L L Miao, H Y Zheng, and Z P Liu, “The characteristics of a novel heterotrophic nitrificationaerobic denitrification bacterium, Bacillus Methylotrophicus strain L7,” Bioresour Technol vol 108, pp 35-44, 2012 55 Schmidt, E.L and L.W Belser, 1994 Autotrophic nitrifying bacteria In: Weaver, R.W., Angle, J.S., Bottomley, P.S (Eds) Methods of soil analyses Part 2: Microbiological and biochemical properties, soil science society of America, Madison: 159-177 56 Sena S De Silva, Brett A Ingram, Phuong T Nguyen, Tam M Bui, Geoff J Gooley and Giovanni M Turchini (2010) Estimation of Nitrogen and Phosphorus 62 Đồ án tốt nghiệp  in Effluent from the Striped Catfish Farming Sector in the Mekong Delta, Vietnam AMBIO Royal Swedish Academy of Sciences DOI 10.1007/s13280-010-0072-x 57 Skjermo, J and O Vadstein 1999 Techniques for microbial control in the intensive rearing of marine larvae Aquaculture, 177: 333-343 58 Stein Torsten, 2005 Bacillus subtilis antibiotic: structures, syntheses and specific functions Molecular Microbiology, 56 (4): 845-857 59 Stephen, J.R., A.E McCaig, Z Smith, J.I Prosser and T.M Embley, 1996 Radionuclides In: Hinchee, R.E., Means, J.L., Burris, D.R (Eds.), Bioremediation of inorganics Third International In Situ and On-Site Bioreclamation Symposium, no 10 Battelle Press Columbus, Ohio: 55-62 60 Stojanovic, B.J and M Alexander, 1958 Effect of inorganic nitrogen on nitrification Soil Sci, 86: 208-215 61 Straat, A.P and A Nason, 1964 Characterization of a nitrate reductase from the chemoautotrophy Nitrobacter agilis Biol Chem, 240: 1412-1426 62 Van-Breemen, N and H.F.G Van-Dijk, 1988 Ecosystems effects of atmospheric deposition of nitrogen in the Netherlands Environ Poll, 54: 249-274 63 Van-Hauteghem, I., G Rombaut and W Verstraete, 2000 Application of the liquid nitrifying culture ABIL aqua as inoculum for biofilters in aquaculture systems In: Abstracts of contributions presented at the International Conference AQUA 2000 Nice, France, 338p 64 Wagner, M., G Rath, R Amann, H.P Koop and K.H Schleifer, 1995 In situ identificaltion of ammonia-oxidazing bacteria Syst Appl Microbiol, 18: 251- 264 65 Wallace, W.; Nicholas, D J D., The biochemistry microorganisms Biotechnology Review 1969, 44, 359-391 of nitrifying 66 Wang, X.H., W.S Ji and H.S Xu, 1999 Application of probiotic in aquaculture Aiken Murray Corp, 2002p 67 Watson, H., C Pickard, K.G Lowe and G.W Hill, 1958 Selective cineangiocardiography with image intensification Brit Heart J, 20: 459-465 68 Watson, S W., and M Mandel 1971 Comparison of the morphology and deoxyribonucleic acid composition of 27 strains of nitrifying bacteria In Journal of Bacteriology 107 (2): 563-569 63 Đồ án tốt nghiệp  69 Watson, S.W., E Bock, H Harms, H.P Koops and A.B Hoper, 1989 Nitrifying Bacteria In Staley JT, Bryant MPP, Pfenning N, Holt JG, editors Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol III, Baltimore, MD: Wiliams and Wilkins, 1989: 1808-1834 70 Ziaei-Nejad, S., M.H Rezaei, G.A., Takami, D.L Lovett, A.R Mirvaghefi and M Shakouri, 2006 The effect of Bacillus spp bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus Aquaculture, 252: 516-522 71 Zimmerman, S.B; Schwartz, C.D; Monaghan, R.L; Pleak, B.A; Wiessberger, B; Gilfillan, E.C; Mochales, S; Hernandez, S; Currie, S A, Tejera, E and E.O Stapley, 1987 Difficidin and oxydifficidin: Novel broad spectrum antibacterial antibiotics produced by Bacillus subtilis J Antibiotics, 40(12): 1677-1681 64 Đồ án tốt nghiệp  PHỤ LỤC Môi trường Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Agar) + Calf brain 200 g/l + Beef heart 250 g/l + Proteo pepton 10 + Dextrose 2.0 g/l + Sodium cloride 5.0 g/l + Disodium phosphat 2.5 g/l g/l Hóa chất ➢ Thuốc nhuộm Gram - Dung dịch tím gentians: • Tím gentians nồng độ 1/10 cồn ethylic 950 10 ml • Acid phenic ml, nước cất 100 ml lắc đều, lọc qua giấy lọc - Dung dịch lugol: • Iod g + Kali iodid (KI) g + nước cất ml Nghiền tan cối sứ cho thêm nước cất đủ 200 ml - Fucshin kiềm: • Fucshin kiềm nồng độ 1/10 cồn 950 10 ml • Acid phenic ml + nước cất 100 ml lắc đều, lọc qua giấy lọc ➢ Thuốc nhuộm bào tử - Dung dịch lục malachite (C23H25N2Cl) 5% Hòa tan malachite vào cồn 950 , khấy cho tan, sau đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối có nút mài - Dung dịch safranin O (C20H19N4Cl = 350,80) 2,5%, trước dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5% Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin ziehl: fuchsin kiềm (C19H18N3Cl = 323,82) 1g, phenol Đồ án tốt nghiệp  g, ethanol, 90% 10 ml, nước cất 200 ml (hòa tan fuchsin với ethanol; hòa tan phenol với nước cất sau trộn lại) Kết giải trình tự chủng vi khuẩn: Chủng B1: CCCCTCGGTATCCGACTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGT TAGCGGCGGAGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA CCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTG TCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACG ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA GTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAG CTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAG TCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCA GAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGT GGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCT TTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCA AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCCTAGAGATAGGGGCCTTTCTTCCTTCGGGG AGCAGAGTGACAGGTTGGTGGCATGGATGGTCGTCAGCTCGGTTGTTCGGTGGAGAATGTGATG TGGGGGAATTAAAGAGCTC Chủng B2: TTCCGCTTTTTCCTATACATGCAGTCGAGCGAATGGATAAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCG GCGGAGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG GCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACT TATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGC GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGA TGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGG CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG TAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAG AGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCG AAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAG TGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCCACAAGCGGGTGGGAGCAATGTGGTTTTAATTTCGAAGGCAAAC GCGAAAGAAACTCTTTACCCAGGGTTCTTTGACCATCCCTCTGGACAAACCCCTAGGAGGATAG GGGGCTTCTCCCTATCCGGGGGAGCCAGAGTTGACCAGGTTGGGTGGCCAATGGGTTTGTTCGA TCCAGCCTTCCGTGTGTTCCCGGTTGAAGAGAATACATGTT Chủng B4: Đồ án tốt nghiệp  GCCTGGCTATCTGACTACCGTGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGCTTGCTGCTTCGCTGAC GAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAA CGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATC GGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTA GCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGA AGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATAACCTTATCAA TTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGG GGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAG GCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCC GGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA CCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTTCCAGAGATGGATTTGGTGCCTTCGGGGAACTCTGAGA CAGGGTGCTGCATGGGCTGTCGATCAGCCTTCGGTTGATTGATGAAATGCATGGAATTAAGTCC CCGGACAAAAACCC Đồ án tốt nghiệp  Đồ án tốt nghiệp  Đồ án tốt nghiệp  ... học phân tử nhằm xác định số chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa nguồn NO2 phục vụ cho nuôi trồng thủy sản Mục đích nghiên cứu ✓ Phân lập, chọn lọc định danh số chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite. .. Nhiệm vụ nghiên cứu ✓ Phân lập chọn lọc số chủng vi khuần có khả chuyển hóa nguồn nitrite mơi trường ni trồng thủy sản ✓ Định danh vi khuẩn hình thái học, sinh lí, sinh hóa phương pháp sinh học phân. .. vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite 45 3.2 Kết định danh sinh hóa vi khuẩn 47 3.2.1 Định danh API 20E test kit 47 3.2.2 Định danh test API 50CHB 49 3.3 Kết định danh