TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH – TP – MP  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA MỘT SỐ LACTOBACILLUS SPP VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN HẠT CÀ PHÊ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiê ̣n : Nguyễn Phương Uyên Lớp : 13DSH01 MSSV : 1311100113 TP.HCM, tháng 07/2017 Đồ án tố t nghiê ̣p LỜI CAM ĐOAN Đồ án tố t nghiê ̣p này là công trıǹ h nghiên cứu của dưới sự hướng dẫn của Tiế n sı ̃ Nguyễn Hoài Hương khoa Công nghê ̣ sinh ho ̣c – Thực phẩ m – Môi trường của trường Đa ̣i Ho ̣c Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh Những kế t quả này hoàn toàn không chép từ các nghiên cứu khoa ho ̣c khác dưới bấ t kỳ hı̀nh thức nào Tp Hồ Chı́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiê ̣n Nguyễn Phương Uyên Đồ án tố t nghiê ̣p LỜI CẢM ƠN Đầ u tiên, em xin gửi lời cảm ơn đế n gia đıǹ h em Cảm ơn bố me ̣ đã nuôi nấ ng và ta ̣o điề u kiê ̣n cho em ho ̣c tâ ̣p để em có đươ ̣c thành quả ngày hôm Cảm ơn anh hai đã bên ca ̣nh và đô ̣ng viên em Trong suố t khoảng thời gian ho ̣c ta ̣i trường Đa ̣i Ho ̣c Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh, em đã đươ ̣c các Thầ y Cô Khoa Công Nghê ̣ Sinh Ho ̣c – Thực Phẩ m – Môi Trường đã hế t lòng hướng dẫn, giúp đỡ em quá trıǹ h ho ̣c tâ ̣p ta ̣i trường, cũng qua trıǹ h thực hiê ̣n đồ án Em xin chân thành cảm ơn đế n Thầ y Cô, nhờ có Thầ y Cô đã trang bi ̣ cho em kiế n thức để có thể thực hiê ̣n đồ án này Em cũng xin cảm ơn Thầ y Cô phòng thı́ nghiê ̣m và các ba ̣n cùng khóa đồ án đã quan tâm, giúp đỡ và ta ̣o điề u kiê ̣n để em hoàn thành đồ án tố t nghiê ̣p Đă ̣c biê ̣t, em xin chân thành cảm ơn Tiế n sı ̃ Nguyễn Hoài Hương đã tâ ̣n tıǹ h hướng dẫn, chı̉ bảo em suố t quá trıǹ h xây dựng đề cương và thực hiê ̣n đồ án Cuố i cùng, em xin cảm ơn các Thầ y, Cô Hô ̣i Đồ ng Phản Biê ̣n đã dành thời gian đo ̣c và nhâ ̣n xét đồ án tố t nghiê ̣p này Em xin gửi đế n Thầ y Cô lời chúc sức khỏe Trong quá trı̀nh làm đồ án, kinh nghiê ̣m còn thiế u và kiế n thức chưa đầ y đủ, nên có nhiề u thiế u sót, mong các Thầ y Cô bỏ qua Tp Hồ Chı́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiê ̣n Nguyễn Phương Uyên Đồ án tố t nghiê ̣p MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU 1 Tı́nh cấ p thiế t của đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 6.1 Phương pháp luận 6.2 Phương pháp xử lý số liệu Kết đạt đươ ̣c CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm sợi 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm tiết 1.1.2.1 Các lồi có khả sinh độc tố 1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin 1.1.2.3 Độc tố Patulin 1.1.2.4 Độc tố Fumonisin 1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố 1.1.3.1 Phương pháp vật lý học 1.1.3.2 Phương pháp hoá học 10 1.1.3.3 Phương pháp sinh học 11 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 14 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 14 i Đồ án tố t nghiê ̣p 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 14 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 16 1.2.2 Khả sinh chất kháng khuẩn 17 1.2.2.1 Bacteriocins 17 1.2.2.2 Các chất có khả kháng khuẩn khác 18 1.2.3 Khả kháng nấm ứng dụng sản phẩm vi khuẩn lactic 19 1.2.3.1 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 19 1.2.3.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 21 1.3 Tác ̣i của nấ m mố c lên ̣t cà phê 22 1.5 Chế biế n và bảo quản ̣t cà phê truyề n thố ng 23 1.5.1 Các phương pháp bảo quản cà phê thóc: 23 1.5.2 Các phương pháp bảo quản cà phê nhân: 25 1.6 Bảo quản ̣t cà phê bằ ng vi sinh vâ ̣t 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Điạ điể m nghiên cứu 27 2.2 Thời gian thực hiêṇ 27 2.3 Vâ ̣t liêụ nghiên cứu 27 2.3.1 Vật liê ̣u 27 2.3.2 Hóa chấ t và môi trường sử dụng 27 2.3.2.1 Hóa chấ t 27 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy 28 2.4 Thiết bị dụng cụ 28 2.4.1 Thiết bị 28 2.4.2 Dụng cụ 28 2.5 Phương pháp luận 29 2.5.1 Mục tiêu đồ án 29 2.5.2 Nội dung 29 2.6 Phương pháp nghiên cứu 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 ii Đồ án tố t nghiê ̣p 2.6.2 Khảo sát đă ̣c điểm hı̀nh thái, sinh hóa các chủng vi khuẩ n Lactobacillus spp 31 2.6.2.1 Nhuộm gram: 31 2.6.2.2 Thử nghiệm Catalase: 32 2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng: 32 2.6.3 Khảo sát sự phát triển của chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 33 2.6.4 Xây dựng đường chuẩ n tế bào của chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 34 2.6.5 Khảo sát khả đố i kháng trực tiế p của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 36 2.6.6 Ứng dụng dich ̣ nuôi cấ y các chủng Lactobacillus spp đố i kháng nấ m mố c Aspergillus sp HCP2 bảo quản ̣t cà phê 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hóa của các chủng vi khuẩ n lactic 40 3.1.1 Hı̀nh thái khuẩ n la ̣c 40 3.1.2 Nhuộm Gram 41 3.1.3 Thử nghiê ̣m catalase 41 3.1.4 Xác đinh ̣ hàm lượng acid tổ ng 42 3.2 Khảo sát sự phát triể n của chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 45 3.3 Xây dựng đường chuẩ n tế bào của chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 46 3.4 Khảo sát khả đố i kháng trực tiế p của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 47 3.6 Ứng du ̣ng dich ̣ nuôi cấ y các chủng Lactobacillus spp đố i kháng nấ m Aspergillus sp HCP2 bảo quản ̣t cà phê 49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 60 ̣ Kế t luâ ̣n 60 Kiế n nghi 61 ̣ TÀ I LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC iii Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC VIẾT TẮT LAB: vi khuẩ n sinh acid lactic ĐC: đố i chứng TN: thı́ nghiê ̣m NT: nghiê ̣m thức PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth MRS: de Man, Rogosa và Sharpe MRS agar: de Man, Rogosa và Sharpe agar SAS: Statistical Analysis Systems iv Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC HÌ NH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hoá học số loại độc tố Hın ̀ h 3.1 Hı̀nh thái khuẩ n la ̣c các chủng Lactobacillus spp 40 môi trường MRS Agar 40 Hın ̀ h 3.2 Tế bào Bacillus spp bắ t màu tım ́ , Gram dương (A) 41 Tế bào E coli bắ t màu hồ ng, Gram âm (B) 41 Hın ̀ h 3.3 Chủng Lactobacillus sp L3 bắ t màu tı́m, Gram dương 41 Hın ̀ h 3.4 Chủng vi khuẩ n Bacillus spp phản ứng dương tıń h với catalase, bên trái – Chủng Lactobacillus spp âm tıń h với catalase, bên phải (A) 42 Đố i chứng là nước cấ t phản ứng âm tıń h với catalase, bên trái - Chủng Lactobacillus spp âm tıń h với catalase, bên phải (B) 42 Hın ̀ h 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩ n Lactobacillus sp L3 theo thời gian 43 Hın ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấ y của các ̣ ̀ h 3.6 Acid lactic (%) và giá tri OD chủng Lactobacillus spp 44 Hın ̀ h 3.7 Khả phát triể n của chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 45 môi trường MRS Agar cải tiế n 45 Hın ̀ h 3.8 Đường chuẩ n nấ m mố c Aspergillus sp HCP2 47 Hın ̀ h 3.9 Khả đố i kháng trực tiế p bằ ng phương pháp cấ y hai đường của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 49 Hın ̀ h 3.10 Khả đố i kháng của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt 51 Hın ̀ h 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải) 54 Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiê ̣t (từ xuố ng dưới) 54 Hın ̀ h 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải) 58 Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 gia nhiê ̣t ở 80oC 15 phút (từ xuố ng dưới) 58 Hın ̣ nuôi cấ y gia nhiê ̣t và không gia nhiê ̣t các ̀ h 3.13 Khả đố i kháng của dich chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 theo dõi qua từng ngày 59 v Đồ án tố t nghiê ̣p DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chế khử nhiễm sinh học số chủng vi khuẩn 12 Bảng 1.2 Một số bacteriocins sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 18 Bảng 1.3 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB (Holzapfel cộng sự, 1995) 19 Bảng 1.4 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 20 Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá tri OD ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấ y của các ̣ chủng Lactobacillus spp 43 Bảng 3.2 Số liê ̣u dựng đường chuẩ n nấ m mố c Aspergillus sp HCP2 46 Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ ức chế chủng nấ m mố c Aspergillus sp HCP2 của các chủng Lactobacillus spp 48 Bảng 3.4 Khả đố i kháng của dich ̣ nuôi cấ y các chủng Lactobacillus spp với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 102 bt/g hạt cà phê) 50 Bảng 3.5 Khả đố i kháng của dich ̣ nuôi cấ y các chủng Lactobacillus spp gia nhiê ̣t o 80 C 15 phút với chủng nấ m Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 102 bt/g) 55 vi Đồ án tố t nghiê ̣p MỞ ĐẦU Tı́nh cấ p thiế t của đề tài Vê ̣ sinh an toàn thực phẩ m là vấ n đề xã hô ̣i cầ n giải quyế t kip̣ thời để bảo vê ̣ sức khỏe người Ở nước ta, với đă ̣c điể m khı́ hâ ̣u nhiê ̣t đới nóng ẩ m, đô ̣ ẩ m không khı́ thường cao, là điề u kiê ̣n rấ t thuâ ̣n lơ ̣i cho nấ m mố c phát triể n, gây nhiễm đô ̣c tố cho thực phẩ m và thức ăn chăn nuôi, gây đô ̣c cho người và gia súc, gây tổ n thương gan (ung thư gan…) Tıǹ h tra ̣ng phơi nhiễm của nấ m mố c ảnh hưởng đế n 25% mùa màng toàn thế giới, làm tổ n thấ t trung bıǹ h 418 triê ̣u đô và ảnh hưởng gia súc 472 triê ̣u đô mỗi năm (theo Bô ̣ Nông Nghiê ̣p Mỹ, 2009) Ta ̣i Viê ̣t Nam, mỗi năm bi ạ ̉ nh hưởng khoản 13 – 16% lươ ̣ng nông sản tùy loa ̣i Trước thực tra ̣ng đó, người đã và tı̀m kiế m những hoa ̣t chấ t sinh ho ̣c vừa có tác du ̣ng kháng nấ m, vừa không gây ̣i cho thể người Mô ̣t những chủng đươ ̣c nghiên cứu và ứng du ̣ng nhiề u nhấ t chıń h là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩ n da ̣ng này có hoa ̣t tı́nh sinh ho ̣c khá cao, an toàn, có khả tiêu diê ̣t vi sinh vâ ̣t có ̣i và là nguồ n vi sinh vâ ̣t hữu ıć h, trı̀ ̣ cân bằ ng vi khuẩ n đường ruô ̣t Từ lợi ích vi khuẩn lactic vấn đề ngộ độ thực phẩm hư hại nông sản nấm mốc gây năm Đây lí chọn để thực đề tài “Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin số Lactobacillus spp ứng dụng bảo quản hạt cà phê” Tình hình nghiên cứu Trên giới, có nhiều nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như: - Năm 2005, Johan Schnürer và Jesper Magnusson đã thực hiê ̣n nghiên cứu “Sự kháng nấ m ở vi khuẩ n lactic là chấ t bảo quản sinh ho ̣c” - “Tiề m kháng nấ m ở thực phẩ m của vi khuẩ n lactic” vào năm 2007 của S Rouse cùng cô ̣ng sự ... cứu Khảo sát khả kháng nấm chủng Lactobacillus spp phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống thử ứng dụng chúng bảo quản hạt cà phê Nội dung nghiên cứu Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh. .. thực phẩm hư hại nông sản nấm mốc gây năm Đây lí chúng tơi chọn để thực đề tài ? ?Khảo sát khả kháng nấm sinh aflatoxin số Lactobacillus spp ứng dụng bảo quản hạt cà phê? ?? Tình hình nghiên cứu Trên... khuẩn Lactobacillus spp Khảo sát phát triển chủng nấm Aspergillus spp HCP2 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus spp HCP2 Đồ án tố t nghiê ̣p Ứng