BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP - ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT LÊN MEN ĐẬU NÀNH NHẰM THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE GIẢM HIỆN TƯỢNG MÁU ĐƠNG Giáo viên hướng dẫn: TS Hồng Quốc Khánh HVCH Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Huỳnh Nguyễn Ngọc Ngân MSSV: 1311100467 Lớp: 13DSH06 Tháng 08 năm 2017 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Tác dụng Phòng chống bệnh cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp ) Làm xương, tiêu diệt vi trùng gây bệnh Phân giải sợi fibrin máu làm tan máu đông MỞ ĐẦU Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh chủng vi khuẩn từ mẫu Natto Nhật Bản Ứng dụng lên men vi khuẩn chất đậu nành Thu nhận enzyme thử hoạt tính tan huyết NỘI DUNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP PHẦN KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đậu nành Nguồn gốc Phân loại Giá trị kinh tế TỔNG QUAN TÀI LIỆU Natto Enzyme Nattokinase Enzyme Nattokinse Tác dụng enzyme Nattokinase Cơ chế làm tan huyết khối Nattokinase VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu Okame Kokusan Chu-Tsubu Natto (OKChu) Okame Gokuko Tsubu Mini Natto (OGMi) Mizkan Kinno Tsubu Toromame (MiKi) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quy trình thực thí nghiệm tổng quan Nguồn mẫu Cấy trãi môi trường MRS Nuôi ủ 370C 24 - 48 Nhuộm Gram Nhuộm bào tử Quan sát, chọn lọc khuẩn lạc riêng rẽ làm giống Thử nghiệm sinh hóa Ly trích thu nhận DNA Nhân đoạn gene phương pháp PCR Lên men đậu nành Định tính protease thử khả tan huyết khối dịch chiết enzyme Thu dịch enzyme thô VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp phân lập Sản phẩm Natto Phân lập Làm Giữ giống Nhuộm Gram Nhuộm Bào tử VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Định danh sinh học phân tử Tách chiết DNA Nhân vùng gene 16s rRNA Giải trình tự gene So sánh trình tự ngân hàng gene NCBI Dựng phát sinh loài 10 KẾT QUẢ Kết so sánh vùng gene ngân hàng liệu gene NCBI Chủng Mức độ tương đồng gene OGMi Staphylococcus hominis strain CKT-105 (100%) Staphylococcus hominis strain F-39 (99%) Bacterium 128 16S (99%) Staphylococcus hominis isolate OTU-c64 (100%) OKChu Staphylococcus hominis strain K23 (89%) Staphylococcus hominis strain BUR16B3 (99%) Staphylococcus hominis partial (99%) MiKi Staphylococcus hominis strain CAU6562 (99%) Bacterium UKR A11 (89%) Bacterium CulalenE36 (90%) 22 KẾT QUẢ Kết thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm Urease: dương tính Mơi trường chuyển từ màu vàng cam sang màu hồng cánh sen Thử nghiệm Catalase: dương tính Xuất bọt khí 23 KẾT QUẢ Kết thử nghiệm sinh hóa MiKi OKChu OGMi Thử nghiệm Oxidase: âm tính Khơng đổi màu 24 KẾT QUẢ Kết định tính protease theo phương pháp đục lỗ thạch môi trường Skim milk 1% Chủng Kích thước đường kính (cm) 24 48 72 OGMi 3,3 4,2 4,6 MiKi 3,8 5,4 OKChu 0 Hình 25 KẾT QUẢ Kết định tính Enzyme dựa vào khả tan huyết khối lợn  Kết thử nghiệm tan huyết khối lợn dịch chiết enzyme thu từ mẫu đậu ủ 24 Tên mẫu H2O OKChu OGMi MiKi Nồng độ 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 Khối lượng Khối lượng Khối lượng huyết ban huyết sau ủ huyết tan đầu (4 giờ) 3,11 3,01 0,1 2,27 1,78 0,49 2,03 1,65 0,38 2,36 2,14 0,22 2,07 1,65 0,5 2,53 2,1 0,43 2,95 2,45 0,42 2,32 1,77 0,55 2,46 1,97 0,49 2,01 1,63 0,38 26 KẾT QUẢ 100 10-1 10-2 H2O OGMi OKChu MiKi 27 KẾT QUẢ  Kết thử nghiệm tan huyết khối lợn dịch chiết enzyme thu từ mẫu đậu ủ 48 Tên mẫu H2O OKChu OGMi MiKi Nồng độ 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 Khối lượng Khối lượng Khối lượng huyết ban huyết sau huyết tan đầu ủ(4 giờ) 2,95 5,68 4,46 2,89 5,65 3,1 3,25 6,26 4,64 3,22 2,7 4,13 3,3 2,31 4,16 2,3 2,58 4,73 3,52 2,46 0,25 1,55 1,16 0,58 1,49 0,8 0,67 1,53 1,12 0,76 28 KẾT QUẢ 100 10-1 10-2 H2O OGMi OKChu MiKi 29 KẾT QUẢ  Kết thử nghiệm tan huyết khối lợn dịch chiết enzyme thu từ mẫu đậu ủ 72 Tên mẫu H2O OKChu OGMi MiKi Nồng độ 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 100 10-1 10-2 Khối lượng Khối lượng Khối lượng huyết ban huyết sau ủ huyết tan đầu (4 giờ) 3,15 2,05 2,64 3,59 2,87 2,88 2,66 2,08 2,36 2,95 1,53 2,15 1,71 2,15 2,12 2,2 1,99 1,52 1,87 0,2 0,52 0,49 0,29 1,44 0,75 0,68 0,67 0,56 0,49 30 KẾT QUẢ 100 10-1 10-2 H2O OGMi OKChu MiKi 31 KẾT QUẢ  Sơ đồ làm tan huyết khối dịch chiết enzyme chủng OKChu, OGMi MiKi ba hệ số pha loãng nồng độ (100, 10-1 10-2) 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận • Từ mẫu Natto Nhật Bản phân lập, làm chọn lọc chủng OKChu, OGMi MiKi Quan sát hình thái khuẩn lạc nhận thấy chủng vi khuẩn có hình tròn, lồi, bề mặt khuẩn lạc trơn màu trắng đục Quan sát hình nhuộm Gram kính hiển vị độ phóng đại 100X, chủng vi khuẩn bắt màu tím, Gram dương, nhỏ, hình cầu, đứng đơn lẻ, tụ lại tạo thành chùm chuỗi Kết hợp với kết hình thái học khuẩn lạc hình nhuộm Gram hình nhuộm bào tử kết luận sơ chủng vi khuẩn phân lập có khả thuộc chi Staphylococcus • Kết điện di sản phẩm ly trích gene DNA tốt • Kết PCR cho thấy chủng vi khuẩn có vạch nằm tương đương vị trí 1000 bp • Dựa vào kết thu nhận gene DNA nhân vùng gene chủng OGMi, OKChu MiKi với so sánh liệu gene chủng ngân hàng gen NCBI cho kết là: chủng OGMi có mức độ tương đồng với lồi Staphylococcus hominis strain CKT-105 100%, chủng OKChu có mức độ tương đồng với loài Staphylococcus hominis strain BUR16B3 99% chủng MiKi có mức độ tương đồng với loài Staphylococcus hominis strain CAU6562 99% 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận • Kết thử nghiệm sinh hóa: Dương tính với thử nghiệm urease, thử nghiệm catalase, âm tính thử nghiệm oxidase • Định tính enzyme Nattokinase sau 24 giờ, 48 72 nuôi ủ thông qua phương pháp tan huyết khối lợn đơng; định tính protease dịch chiết enzyme Nattokinase phương pháp đục lỗ thạch môi trường Skim milk cho kết quả: Dựa vào kết bảng thử hoạt tính protease mơi trường Skim milk cho thấy, chủng OGMi MiKi có khả phân giải hạt sữa gầy tạo vòng phân giải xung quanh lỗ thạch, chủng OKChu khơng có khả phân giải hạt sữa gầy Hoạt tính protease dịch chiết enzyme chủng OGMi, MiKi cao sau 72 nuôi cấy hoạt tính chủng MiKi (5,4 cm) cao OGMi (4,6 cm) Kết thử nghiệm tan huyết: dịch chiết enzyme Nattokinase sau 48 ni ủ có hoạt tính cao nhất, dịch chiết enzyme Nattokinase sau 24 nuôi ủ có hoạt tính thấp hoạt tính enzyme Nattokinase phân giải huyết khối giảm dần theo nồng độ pha lỗng (100, 10-1 10-2) • Từ kết thu cho thấy lồi Staphylococcus hominis có khả phân giải sợi fibrin làm tan huyết khối đông 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kiến nghị  Do lượng thời gian có giới hạn nên q trình nghiên cứu số vấn đề chưa thực Cần thực thêm số khảo sát: + Xây dựng quy trình sản xuất Natto + Tinh enzyme Nattokinase + Nâng cao phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme Nattokinase 35 ... định danh chủng vi khuẩn từ mẫu Natto Nhật Bản Ứng dụng lên men vi khuẩn chất đậu nành Thu nhận enzyme thử hoạt tính tan huyết NỘI DUNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP PHẦN KẾT QUẢ VÀ... dụng Phòng chống bệnh cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp ) Làm xương, tiêu diệt vi trùng gây bệnh Phân giải sợi fibrin máu làm tan máu đông MỞ ĐẦU Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định. .. lọc khuẩn lạc riêng rẽ làm giống Thử nghiệm sinh hóa Ly trích thu nhận DNA Nhân đoạn gene phương pháp PCR Lên men đậu nành Định tính protease thử khả tan huyết khối dịch chiết enzyme Thu dịch enzyme