BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt TS Lương Tấn Trung Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt TS Lương Tấn Trung Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phượng Hằng MSSV: 1151110009 Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn hướng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng Hằng LỜI CÁM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Ðại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt nãm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường anh chị, bạn bè nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khãn, nản lịng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Phượng Hằng Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục i Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng viii MỞ ĐẦU 1 Đặc vấn đề .1 Mục đích nghiên cứu .2 Nội dung nghiên cứu .2 Phạm vi nghiên cứu .2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Medinilla sp 1.1.1 Phân loại, nguồn gốc phân bố 1.1.1.1 Phân loại khoa học .3 1.1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp 1.2.3.1 Medinilla septentrionalis 1.2.3.2 Medinilla assamica .4 1.2.3.3 Medinilla lanceata 1.2.3.4 Medinilla nana 1.2.3.5 Medinilla fengi 1.2.3.6 Medinilla formosana .6 1.2 Một số thành phần hóa học thực vật 1.2.1 Carbohydrate 1.2.1.1 Khái niệm .6 1.2.1.2 Vai trò i Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Amino acid 1.2.2.1 Khái niệm 1.2.2.2 Vai trò 1.2.3 Alkaloid 1.2.3.1 Khái niệm 1.2.3.2 Vai trò 1.2.4 Glycoside 1.2.4.2 Saponin 1.2.4.3Glycoside tim 1.2.4.4Anthraquinone glycoside 10 1.2.4.5 Flavonoid anthoxyanosid 10 1.2.4.6 Tannin 10 1.2.4 Steroid 11 1.2.4.1 Khái niệm 11 1.2.4.2 Vai trò 11 1.2.5 Các hợp chất phenolic 11 1.2.5.1 Khái niệm 11 1.2.5.2 Vai trò 12 1.3 Tổng quan hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 12 1.3.1 Khái niệm 12 1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung 12 1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn thực vật 13 1.3.3.1 Alkaloid 13 1.3.3.2 Phenol đơn acid phenolic 14 1.3.3.3 Flavonoid 15 1.3.3.4 Tannin 16 1.3.3.5 Các hợp chất quinone 16 1.3.3.6 Terpenoid tinh dầu 17 ii Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.7 Saponin 18 1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam 19 1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn thực vật thê giới 19 1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật Việt Nam 20 1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum bactericidal concentration_MBC)21 1.4.4 Khái niệm, ý nghĩa MIC MBC 21 1.4.1.1 Khái niệm 21 1.4.1.2 Ý nghĩa 21 1.4.3 Sơ lược số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 22 1.4.3.1Phương pháp khuếch tán thạch (agar-diffusion methods) 22 1.4.3.2.Phương pháp pha loãng (Dilution methods) 22 1.4.4 Một số kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) thực vật 23 1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC giới 23 CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 25 2.1.2 Địa điểm thu mẫu 25 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 25 2.2.Vật liệu nghiên cứu 25 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2.2 Vi khuẩn thị 25 2.2.3 Môi trường 25 2.2.3.1 Môi trýờng nuôi cấy phân lập 25 2.2.3.2 Dụng cụ thiết bị 26 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp thu tách chiết hợp chất từ thực vật 26 iii Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật thị 27 2.3.3 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 27 2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27 2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 27 2.3.4 Phương pháp pha loãng vi sinh vật 28 2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28 2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn cao ethanol phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) 29 2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) môi trường lỏng bổ sung chất thị resazurin (broth dilution resazurin method) 30 2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc diffusion method) 31 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 32 2.4 Bố trí thí nghiệm 32 2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ Medinilla sp 33 2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết 33 2.4.1.2 Thuyết minh quy trình 33 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao ethanol 70% từ Medinilla sp phương pháp khuếch tán giếng thạch 34 2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định số MIC cao chiết ethanol 70% từ Medinilla sp 35 2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán giếng thạch 36 2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha lỗng môi trường lỏng bổ sung chất thị resazurin 37 2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao ethanol từ Medinilla sp 40 3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41 3.1.2 Đối với nhóm Salmonella spp 42 iv Đồ án tốt nghiệp 3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp 43 3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp 44 3.1.5 Đối với nhóm chủng vi sinh vật gây bệnh khác 45 3.2 Kết xác định số (MIC) cao chiết ethanol 70% từ Medinilla sp (MEE) 46 3.2.1 Xác định số MIC cao chiết phương pháp khuếch tán giếng thạch (WDA) 47 3.2.2 Phương pháp pha loãng môi trường lỏng bổ sung chất thị resazurin (MDR) 48 3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) 50 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………56 4.1 Kết luận………………………………………………………………………56 4.2 Kiến nghị…………………………………………………………………… 56 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT MEE: Medinilla sp ethanol extract: Cao chiết 70% từ Medinilla sp MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu MBC: Minimum Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu WDA: Agar well diffusion assay: Phương pháp khuếch tán giếng thạch MDR: Broth dilution resazurin menthod: Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng bổ sung chất thị resazurin DDA: Disc diffision assay: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán TSA: Trypticase Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth vi Đồ án tốt nghiệp Bảng B.11 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Shigella boydii Bảng B.12 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Shigella flexneri 70 Đồ án tốt nghiệp Bảng B.13 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Shigella sonnei Bảng B.14 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Vibrio alginolyticus 71 Đồ án tốt nghiệp Bảng B.15 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Vibrio cholerae Bảng B.16 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Vibrio harveyi 72 Đồ án tốt nghiệp Bảng B.17 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Vibrio parahaemolyticus Bảng B.18 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Pseudomonas aeruginosa 73 Đồ án tốt nghiệp Bảng B.19 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Staphylococcus aureus Bảng B.20 Kết xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn MEE (100 mg/ml) chủng Enterococcus feacalis 74 Đồ án tốt nghiệp 75 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ HÌNH ẢNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ CHỈ SỐ MIC BẰNG PHƢƠNG PHÁP CỦA MEE ĐỐI VỚI ĐẠI DIỆN CỦA NHÓM VI KHUẨN KHẢO SÁT Hình C.1 Kết hoạt tính kháng khuẩn MEE (100mg/ml) Staphylococcus aureus Shigella boydii Vibrio cholerae Escherichia coli Salmonella dublin 76 Đồ án tốt nghiệp Hình C.2 Kết số MIC MEE phương pháp WDA Escherichia coli O157:H7 Vibrio cholerae 77 Đồ án tốt nghiệp Salmonella enteritidis Hình C.3 Kết số MIC MEE phương pháp MDR Vibrio alginolyticus Pseudomonas aeruginosa 78 Đồ án tốt nghiệp Hình C.4 Kết số MIC MEE phương pháp DDA 100mg/ml 50mg/ml Shigella sonnei 100mg/ml 50mg/ml 25mg/ml 12,5mg/ml Vibrio alginolyticus 79 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ (MIC) CỦA CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ CÂY MEDINILLA SP Bảng D.1 Xác định số MIC cao chiết phương pháp WDA 80 Đồ án tốt nghiệp Đƣờng kính vừng ức chế (mm) STT Chủng 100 50 L1 L2 L3 L1 L2 Escherichia coli O157:H7 16,5 16 15 13 13 Escherichia coli 0208 13 13 13 11 11 Escherichia coli (K) 16 15 15 13,5 12,5 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 15 14 14,5 11 11 Listeria innocua 16,5 16 15,5 11 12 Listeria monocytogenes 15 13 15 12,5 12,5 Salmonella dublin 13 13,5 14 12 11,5 Salmonella enteritidis 15 16 15 12 12 Salmonella typhi 15 15,5 15,5 11,5 11 10 Salmonella typhimurium 15 16 16,5 11 12 11 Shigella boydii 16 17 16 11 12 12 Shigella flexneri 16 16,5 17 12,5 12 13 Shigella sonnei 16 15 16 11 11 14 Vibrio alginolyticus 16 17 16,5 12 12 15 Vibrio cholerae 15 17 15 11,5 11 16 Vibrio harveyi 15 14 16 11,5 11,5 17 Vibrio parahaemolyticus 13,5 12 14 12 10,5 18 Pseudomonas aeruginosa 15 14,5 16 12 11,5 19 Staphylococcus aureus 15 15 14 12 12 20 Enterococcus feacalis 14 12 11,5 10,5 10,5 Đường kính vịng ức chế bao gồm đường kính giếng thạch Bảng D.2 Xác định số MIC cao chiết phương pháp MDR 81 L3 12 11 13,5 11,5 12 12,5 11 12 11 13 11,5 12 12 13 12 12 11 12 11,5 12 L1 0 10,5 11,5 10 11 11 11 11,5 11,5 11,5 12 14,5 11 0 11,5 11,5 11 25 L2 0 11 10,5 11 11,5 11,5 10,5 10,5 9,5 11 11,5 11,5 0 0 11,5 12.5 L3 0 11,5 10,5 10.5 11 10,5 0 10,5 0 11,5 11 0 0 10,5 11 12,5 L1 L2 L3 0 0 0 9,5 0 10,5 9,5 11 0 0 0 0 0 0 11 11,5 11,5 0 10 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 11 Đồ án tốt nghiệp STT Chủng MIC- Ống nghiệm (+) 100 (+) (+) 50 (+) (+) Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 (+) (+) (+) (+) (+) Escherichia coli (+) (+) (+) (+) (+) ETEC (+) (+) (+) (+) (+) Listeria innocua (+) (+) (+) (+) (+) Listeria monocytogenes (+) (+) (+) (+) (+) Salmonella dublin (+) (+) (+) (+) (+) Salmonella enteritidis (+) (+) (+) (+) (+) Salmonella typhi (+) (+) (+) (+) (+) Salmonella typhimurium (+) (+) (+) (+) (+) 10 Shigella boydii (+) (+) (+) (+) (+) 11 Shigella flexneri (+) (+) (+) (+) (+) 12 Shigella sonnei (+) (+) (+) (+) (+) 13 Vibrio alginolyticus (+) (+) (+) (+) (+) 14 Vibrio cholerae (+) (+) (+) (+) (+) 15 Vibrio harveyi (+) (+) (+) (+) (+) 16 Vibrio parahaemolyticus (+) (+) (+) (+) (+) 17 Pseudomonas aeruginosa (+) (+) (+) (+) (+) 18 Staphylococcus aureus (+) (+) (+) (+) (+) 19 Enterococcus feacalis (+) (+) (+) (+) (+) 20 Bảng C.3 Xác định số MIC MEE phương pháp DDA 82 25 (+) (+) (+) (+) (-) 12,5 (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Đồ án tốt nghiệp STT Chủng Đƣờng kính vùng ức chế (mm) 100 1 Escherichia coli O157:H7 9,5 9,5 10 Escherichia coli 0208 9 Escherichia coli 11 10 12 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 10 10 Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin 10,5 10 Salmonella enteritidis 9 9 Salmonella typhi 8,5 8,5 10 Salmonella typhimurium 9.5 10 9,5 11 Shigella boydii 12 Shigella flexneri 9 10 8,5 13 Shigella sonnei 11,5 9,5 14 Vibrio harveyi 15 Vibrio alginolyticus 8,5 16 Vibrio cholerae 8,5 17 Vibrio parahaemolyticus 10 8,5 18 Pseudomonas aeruginosa 19 Staphylococcus aureus 10 10,5 20 Enterococcus feacalis 10 Đường kính vịng ức chế bao gồm đường kính giếng thạch (d = 6mm) 83 50 9 8 9 8,5 10 10 7,5 9 - 9 10 8,5 8,5 8 9,5 - 8,5 8,5 9 8,5 - 25 8,5 8,5 8,5 - 9 - 12,5 9,5 9,5 7,5 8 8 - Đồ án tốt nghiệp ... trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng đối tượng thực vật _ thuốc (có màu) lý để đề tài ? ?Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ Medinilla sp? ??... TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên... đích nghiên cứu Bước đầu xác định quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ Medinilla sp Nội dung nghiên cứu Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho cao chiết