BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - TRẦN MINH QUÍ BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Plasmodium spp HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM - TRẦN MINH QUÍ BẢO TỒN CHỦNG KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Plasmodium spp HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG TP HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Luận văn Thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày tháng … năm … Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT Họ tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện Phản biện Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau Luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP HCM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc TP HCM, ngày … tháng… năm 20 … NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRẦN MINH Q Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1991 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học MSHV: 1541880009 I- Tên đề tài: Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp hướng ứng dụng II- Nhiệm vụ nội dung:  Thu thập bảo tồn nguồn chủng KST SR cách nuôi cấy chủng KST SR bảo quản chủng KST SR Nitơ lỏng  Giải trình tự đoạn gene KST SR mẫu thu thập III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: V- Cán hướng dẫn: PGS.TS, NGUYỄN TIẾN THẮNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp hướng ứng dụng” cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng Đề tài thực khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh Các số liệu, kết quả, đánh giá đưa luận văn chưa công bố luận văn trước Những kết nghiên cứu, số liệu tác giả khác trích dẫn luận văn điều thích đầy đủ Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm với nhà trường cam đoan Học viên thực Luận văn (Ký ghi rõ họ tên) ii LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành cảm ơn: Trường Đại học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh; Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Ni cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Cơn trùng thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt trình học tập hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng người Thầy trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành luận văn Các anh chị đồng nghiệp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Ni cấy – Miễn dịch, bạn bè, gia đình động viên, giúp đỡ em q trình hồn thành luận văn (Họ tên Tác giả Luận văn) iii TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng Plasmodium spp gây ra, bệnh thường gặp nước thuộc khu vực nhiệt đới Bệnh truyền từ người bệnh qua người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) Hiện nay, có lồi ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium knowlesi Bệnh SR vấn đề y tế ảnh hưởng đến sức khỏe, điều kiện kinh tế người dân sống vùng sốt rét lưu hành Trong năm gần đây, tình hình KST SR có chiều hướng giảm mạnh, việc bảo tồn chủng KST SR Plasmodium spp vấn đề quan trọng để phục vụ cho nghiên cứu đến KST SR sau Đề tài “Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp hướng ứng dụng” tiến hành từ tháng 2/2017 đến tháng 8/2017 Mục tiêu nghiên cứu đề tài là: Bảo tồn nguồn chủng KST SR, bước đầu xây dựng ngân hàng Gene KST SR hướng ứng dụng Đồng thời tiến hành nuôi cấy chủng KST SR phòng thí nghiệm Đề tài tập trung vào nội dung sau:  Thu thập, lưu trữ bảo tồn nguồn chủng KST SR Nitơ lỏng + Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng phòng thí nghiệm nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum Plasmodium vivax đơn thu thập từ thực địa + Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ mẫu thu thập nghiên cứu, thử nghiệm,  Giải trình tự đoạn gene KST SR mẫu thu thập + Chạy PCR định danh mẫu máu nhiễm KST SR + Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho loài KST SR iv + Giải trình tự đoạn Gene kháng thuốc artemisinin chủng Plasmodium falciparum Phương pháp thực đề tài: Đề tài tiến hành thu thập mẫu tỉnh Bình Phước, vùng dịch tể SR lưu hành nặng khu vực Nam - Lâm Đồng nước Với kích cỡ mẫu 30 mẫu khẳng định dương tính với KST SR kỹ thuật nhuộm Giêm – sa Chúng định danh lại chủng thu thập kỹ thuật Nested – PCR, giải trình tự Các chủng xác định nhiễm P falciparum, P vivax đơn kỹ thuật Nested – PCR tiến hành nuôi cấy dài ngày chủng KST SR phương pháp ni bình nến Trager Jensen (1976) với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết AB điều kiện nồng độ 5% CO2 O2 thấp, nhiệt độ 37°C Kết nghiên cứu: Trong trình tiến hành đề tài, thu thập 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30 mẫu KST SR kỹ thuật Nested – PCR giải trình tự mẫu thu thập phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, với 14 chủng KST SR nhiễm P falciparum đơn phân lập, chúng tơi tiến hành giải trình tự phát 9/14 chủng KST SR P falciparum đơn thu thập Bình Phước có đột biến cánh quạt K13 liên quan đến kháng artemisinin (chiếm 64,3% chủng P falciparum đơn thuần) Với tần suất xuất điểm đột biến K13 cánh quạt liên quan đến kháng artemisinin sau: C447G có chủng chiếm 7,1%; I543T có chủng chiếm tỉ lệ 7,1%; P553L có chủng chiếm 21,4%; C580Y có chủng chiếm 28,6% Trong đột biến C580Y có tần suất xuất cao Bình Phước, nghiên cứu khác khu vực Cam-pu-chia, Myanmar công bố v ABSTRACT Background: Plasmodium spp is caused of malaria disease, a common disease in the tropical countries Disease is spreaded from patient to person healthy by mosquito (Anopheles spp.) Currently, there are five species of malaria parasites infecting human: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale and Plasmodium knowlesi Malaria disease is the issues affecting health and economic conditions of people living in malaria endemic areas In recent years, the situation of malaria tends to decline, so conservation species malaria Plasmodium spp is very important to help malaria researchers in the future Study "Conservation of species Plasmodium spp and applications" was conducted from February to August in 2017 The objective of this research is conservation malaria species, building initially the bank Gene malaria and applications Simultaneously, malaria species are cultured in the Laboratory The subject focuses on the following:  Collecting, storing and conserving strains of Plasmodium spp in liquid nitrogen + Culturing Plasmodium strains to produce pure strains on blood at Labratory, such as: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax isolated from patients + Plasmodium strains from this research are stored  Analyzing the gene of malaria parasites from the samples collected + Using PCR method to identify Plasmodium spp + Anlayzing the gene translation to 18S Ribosomes for each species Plasmodium + Anlayzing the resistant artemisinin gene of P Falciparum strains vi Methods: Our study collected samples in Binh Phuoc province, it is the endemic malaria epidemiology in the South Vietnam - Lam Dong We found 30 samples positive with malaria by staining Giem - sa We will identifize strains by Nested – PCR method And then, the strains of Plasmodium spp are cultured at Labratory by candle jar method of Trager and Jensen (1976) with human erythrocytes, RPMI 1640 medium, 10% serum concentrations AB, in terms 5% of CO2 and O2 low, at a temperature 37°C Finally, storing on liquid nitrogen Results: In this study, we have collected 30 blood samples were positive for Plasmodium spp by staining Giem – sa method, identification 30 samples of malaria by Nested PCR method and analyzing DNA of samples at Labratory With 14 cases injected P falciparum, we conducted to analyzing DNA to detected P falciparum malaria species on 9/14 samples collected in Binh Phuoc has mutant K13 propeller involving artemisinin resistance (accounting for 64.3% of the isolates of P falciparum samples) With the point mutatant of K13 propeller involving artemisinin resistance as: C447G strains accounted for 7.1%; strains I543T proportion of 7.1%; P553L strains accounted for 21.4% 3; C580Y strains of 28.6% C580Y have high frequency appearance in Binh Phuoc, as well as in other studies in Cambodia, Myanmar has been published • Lactac máu > mmol/l  Khoảng cách lọc: Lọc máu hàng ngày hay cách ngày phụ thuộc mức độ thừa dịch, tình trạng người bệnh e) Xử trí thiếu máu huyết tán xuất huyết:  Truyền khối hồng cầu Hematocrit < 20% hemoglobin < 7g/dl  Truyền khối tiểu cầu tiểu cầu < 20.000/ml máu không làm thủ thuật xâm lấn < 50.000/ml làm thủ thuật xâm lấn  Không truyền Plasma PT < 50% mà cần làm thủ thuật xâm lấn nên truyền f) Xử trí hạ đường huyết:  Duy trì ăn qua ống thơng dày liên tục nhiều bữa  Nếu có hạ đường huyết tiêm tĩnh mạch chậm 30-50 ml Glucose ưu trương 20% (trẻ em 1-2 ml/kg), sau truyền trì Glucose 10% liên tục 24 đặc biệt người bệnh có vàng da, suy gan cấp (mỗi 5-6 gam glucose) để tránh hạ đường huyết tái phát, ngược lại có tăng đường máu >10 mmol/l truyền insulin tĩnh mạch liên tục liều thấp 1-2 đơn vị /giờ (duy trì đường huyết khoảng 8-10 mmol/l) g) Xử trí đái huyết cầu tố:  Dấu hiệu triệu chứng thường gặp sốt rét đái huyết cầu tố sốt rét điển hình có vàng da-niêm mạc nước tiểu màu nước vối hay cà phê đen Cần hỏi kỹ bệnh sử đái huyết cầu tố, loại thuốc dùng gần đây, xét nghiệm máu tìm ký sinh trùng sốt rét thử nước tiểu tìm hemoglobin, số lượng hồng cầu nhiều lần (trong đái huyết cầu tố số lượng hồng cầu giảm nhanh) xét nghiệm G6PD có điều kiện  Xử trí: + Truyền Natri clorua 0,9% dịch khác trì lượng nước tiểu ≥ 2500 ml/24 giờ, 10-12 ml/kg/24 với trẻ em + Truyền khối hồng cầu Hematocrit < 25% hemoglobin < 7g/dl + Nếu dùng Primaquin Quinin mà xuất đái huyết cầu tố ngừng thuốc thay thuốc sốt rét khác + Nếu người bệnh bị suy thận xử trí suy thận sốt rét ác tính Chú ý: Hiện tượng đái huyết cầu tố thường gặp người thiếu G6PD, gặp tác nhân gây xy hóa thuốc, nhiễm khuẩn số loại thức ăn Vì cần hỏi kỹ tiền sử, xét nghiệm máu nhiều lần để xác định đái huyết cầu tố ký sinh trùng sốt rét loại trừ đái huyết cầu tố nguyên nhân khác h) Điều chỉnh rối loạn nước điện giải, kiềm toan  Cân người bệnh hàng ngày (nếu có điều kiện) tính lượng dịch vào-ra đầy đủ  Dấu hiệu nước: Giảm đàn hồi da, môi khô, mạch nhanh, huyết áp hạ, giảm độ căng nhãn cầu, nước tiểu  Xử trí: + Dùng dịch truyền đẳng trương khơng q 2,5 lít/ngày với người lớn 20ml/kg 1-2 đầu trẻ em theo dõi xét nghiệm điện giải đồ, huyết áp nước tiểu + Nếu người bệnh có toan huyết (HCO3-