BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN ĐA GIÁ TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ ESCHERICHIA COLI TRÊN VỊT Ở CÁC NHIỆT ĐỘ BẢO QUẢN KHÁC NHAU Sinh viên thực : PHẠM NGỌC NHUNG Ngành : Thú Y Lớp : TC03TYTP Khóa : 2003 - 2008 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng - 2009 ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN ĐA GIÁ TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ ESCHERICHIA COLI TRÊN VỊT Ở CÁC NHIỆT ĐỘ BẢO QUẢN KHÁC NHAU Tác giả PHẠM NGỌC NHUNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN BSTY PHÙNG DUY HỒNG HÀ Tháng - 2009 i CẢM TẠ • Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ người thân yêu thương, dạy dỗ động viên để có kết ngày hơm • Em xin chân thành cám ơn ThS.Trần Thị Bích Liên, giảng viên Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM TS Trần Xn Hạnh, Phó Tổng Giám Đốc Công ty Thuốc Thú Y Trung Ương (NAVETCO) BSTY Phùng Duy Hồng Hà, cán nghiên cứu thuộc Phòng Nghiên cứu vi trùng Cơng ty Thuốc Thú Y Trung Ương (NAVETCO) Đã hết lòng quan tâm, bảo cho em kiến thức, kinh nghiệm suốt thời gian thực tập đề tài giúp em hồn thành khóa luận tốt nghiệp • Em xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Ban Chủ nhiệm khoa Chăn nuôi – Thú y Cùng tồn thể thầy khoa Chăn ni – Thú y Đã tận tình giảng dạy cho em năm học vừa qua • Em xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Công ty Thuốc Thú Y Trung Ương Các cô chú, anh chị thuộc Bộ môn Nghiên cứu vi trùng, phân xưởng vi trùng sở Thạnh Lộc thuộc Phòng Kiểm nghiệm Cơng ty Thuốc Thú Y Trung Ương tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ cho em trình thực tập Cơng ty • Cuối cùng, cám ơn tất bạn bè quan tâm động viên suốt năm học vừa qua ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “ Đánh giá hiệu lực vacxin đa giá tụ huyết trùng E.coli vịt nhiệt độ bảo quản khác nhau” tiến hành Bộ môn nghiên cứu vi trùng – Trung tâm nghiên cứu thuốc thú y thuộc Công ty thuốc thú y Trung Ương, thời gian từ 11/2008 đến 05/2009 Vacxin đa giá tụ huyết trùng E.coli thí nghiệm vịt với kết thí nghiệm sau: - Hai lơ vacxin sau sản xuất đạt tiêu chuẩn vật lý vô trùng - Khi tiêm vacxin cho vịt với liều gấp đôi liều quy định Sau 10 ngày, tất vịt thí nghiệm ăn uống bình thường, sống khỏe mạnh Kết hai lô vacxin đạt tiêu chuẩn an tồn - Vịt tiêm vacxin sau 21 ngày có khả tạo miễn dịch tốt Kết vịt miễn dịch bảo hộ với tỷ lệ sống 100%, vịt đối chứng chết hết - Khi bảo quản vacxin – 8oC sau tháng, tháng tạo miễn dịch tốt vịt với tỷ lệ sống vịt miễn dịch từ 80 – 100%, vịt đối chứng chết hết - Vacxin sau sản xuất để nhiệt độ phòng (25 – 30oC) đảm bảo chất lượng tính chất vật lý hiệu lực sau ngày iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục .iv Danh sách bảng vii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU .2 1.2.1 Mục đích 1.2.2.Yêu cầu .2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Những hiểu biết bệnh tụ huyết trùng gia cầm .3 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Lịch sử nghiên cứu 2.1.3.Vi khuẩn Pasteurella multocida .3 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái .3 2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy .4 2.1.3.3 Đặc tính sinh hóa 2.1.3.4 Cấu trúc kháng nguyên 2.1.3.5 Sức đề kháng 2.1.4 Truyền nhiễm học 2.1.5 Triệu chứng 2.1.6 Bệnh tích 2.1.7 Chẩn đoán phòng trị bệnh 2.1.7.1 Chẩn đoán .9 2.1.7.2 Phòng trị bệnh .9 2.1.8 Một số nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 2.2 Những hiểu biết bệnh Escherichia coli vịt 10 iv 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu 10 2.2.2.Vi khuẩn Escherichia coli .10 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái 10 2.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy .10 2.2.2.3 Đặc tính sinh hóa .11 2.2.2.4 Cấu trúc kháng nguyên .11 2.2.2.5 Sức đề kháng 12 2.2.3 Truyền nhiễm học 12 2.2.4 Triệu chứng 13 2.2.5 Bệnh tích 13 2.2.6 Chẩn đốn phòng trị bệnh .13 2.2.6.1 Chẩn đoán 13 2.2.6.2 Phòng trị bệnh 14 2.2.7 Một số nghiên cứu Escherichia coli vịt 14 2.3 Những hiểu biết miễn dịch 14 2.3.1 Miễn dịch học 14 2.3.1.1 Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) 14 2.3.1.2 Miễn dịch thu (miễn dịch đặc hiệu) 15 2.4 Vacxin .17 2.4.1 Vacxin nguyên lý tác dụng .17 2.4.2 Thành phần vacxin 18 2.4.3 Tiêu chuẩn vacxin 18 2.4.4 Những điều cần lưu ý sử dụng vacxin 18 CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .21 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 21 3.1.1 Thời gian 21 3.1.2 Địa điểm thực 21 3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 21 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 21 3.3.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 21 3.3.2 Môi trường hóa chất 21 v 3.3.3 Động vật thí nghiệm 22 3.3.4 Giống vi khuẩn cường độc liều công cường độc 22 3.3.5 Vacxin dùng thí nghiệm 22 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .22 3.4.1 Phương pháp kiểm tra chất lượng vacxin sau sản xuất 22 3.4.1.1 Phương pháp kiểm tra vật lý vacxin sau sản xuất 22 3.4.1.2 Phương pháp kiểm tra vô trùng vacxin sau sản xuất .23 3.4.1.3 Phương pháp kiểm tra an toàn vacxin sau sản xuất .23 3.4.1.4 Phương pháp kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất 24 3.4.2 Phương pháp kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC 25 3.4.3 Phương pháp kiểm tra chất lượng vacxin sau 1, 2, 3, 4, ngày để nhiệt độ 25 – 30oC 26 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 29 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 4.1 Kết kiểm tra chất lượng vacxin sau sản xuất 30 4.1.1 Kết kiểm tra vật lý vô trùng vacxin sau sản xuất 30 4.1.2 Kết kiểm tra an toàn vacxin sau sản xuất 31 4.1.3 Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất 32 4.2 Kết kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC 32 4.3 Kết kiểm tra chất lượng vacxin thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày nhiệt độ 25 – 30oC 33 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC .40 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT E coli: Echerichia coli P multocida: Pasteurella multocida NAVETCO: National Veterinary Company TSB: Tryptone Soya Broth TSA: Tryptone Soya Agar CFU: Colony Forming Unit MD: Miễn dịch ĐC: Đối chứng MLD: Minimum Lethal Dose vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Pasteurella multocida Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra an toàn vacxin sau sản xuất .24 Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất .25 Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC 26 Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực vacxin sau 1, 2, 3, 4, ngày để nhiệt độ 25 – 30 oC 28 Bảng 4.1: Kết kiểm tra vật lý, vô trùng sau sản xuất 31 Bảng 4.2: Kết kiểm tra an toàn vacxin sau sản xuất 31 Bảng 4.3: Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất 32 Bảng 4.4: Kết kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC 33 Bảng 4.5: Kết kiểm tra vật lý vacxin thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày nhiệt độ 25 – 30oC .34 Bảng 4.6: Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau bảo quản nhiệt độ 25 – 30oC 35 viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm qua, chăn nuôi gia cầm góp phần đáng kể vào việc cải thiện thu nhập, nâng cao mức sống người dân, người dân vùng nông thôn Đồng sông Cửu Long Tuy nhiên, ngành chăn nuôi gặp không khó khăn, khó khăn tình hình dịch bệnh gia súc gia cầm phức tạp trầm trọng Một bệnh nguy hiểm làm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm nước ta thường gặp phải kể đến bệnh tụ huyết trùng vi khuẩn Pasteurella multocida bệnh vi khuẩn Escherichia coli (E coli) gây Bệnh tụ huyết trùng chiếm 40,56% tình hình dịch bệnh đàn vịt ni ĐBSCL (Nguyễn Đức Hiền, 2004) Theo số liệu Nguyễn Xuân Bình, 2002 tỷ lệ nhiễm E coli vịt 3-15 ngày tuổi 20-60% Để giảm thiểu thiệt hại bệnh gây việc sử dụng vacxin phòng bệnh phương pháp mang lại hiệu kinh tế Vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng vịt dùng Việt Nam nhiên vacxin phòng bệnh E coli vịt phải dùng vacxin nhập từ nước ngồi phí cao Trong năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu thú y - Công Ty Thuốc Thú Y Trung Ương tiến hành nghiên cứu chế tạo vacxin tụ huyết trùng ghép với E coli TS Trần Xuân Hạnh làm chủ trì Vacxin đa giá có ưu điểm mũi vacxin phòng ngừa hai bệnh, thuận lợi cho việc sử dụng vacxin, không gây tác động nhiều lần đến đàn vịt nuôi Tuy nhiên, thực tế sản xuất, nhiều lý khác nhau, số vùng đặc biệt vùng sâu, vùng xa khơng có điều kiện bảo quản vacxin Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định tỷ lệ bảo hộ (tỷ lệ sống vịt thí nghiệm tiêm vacxin tổng số vịt công cường độc) - Đánh giá kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau công cường độc - Tiến hành mổ khám khảo sát bệnh tích 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU Do thí nghiệm tiến hành khảo sát ghi nhận kết nên không dùng phương pháp xử lý số liệu 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết kiểm tra chất lượng vacxin sau sản xuất Vacxin sau sản xuất đạt chất lượng đạt yêu cầu vật lý, vơ trùng, an tồn hiệu lực 4.1.1 Kết kiểm tra vật lý vô trùng vacxin sau sản xuất Chúng tiến hành kiểm tra hai lơ vacxin tính chất vật lý vơ trùng Kết trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết kiểm tra vật lý, vô trùng sau sản xuất Kiểm tra vô trùng Kiểm tra vật lý Lô vacxin Số chai mẫu kiểm tra Số chai Số chai đạt/số chai mẫu kiểm tra Kết luận đạt/số chai mẫu kiểm Kết luận tra 3/3 Đạt 3/3 Đạt 3/3 Đạt 3/3 Đạt Kết bảng 4.1 cho thấy: Kết kiểm tra vật lý: - Khơng có tượng tách lớp sau ly tâm sau để điều kiện nhiệt độ khác 30 - Kiểm tra nước đá lạnh: giọt đầu tan, giọt sau không tan hình thành chấm tròn, ổn định bề mặt nước đá Như , hai lô vacxin đạt tiêu chuẩn vật lý Kết kiểm tra vô trùng: Vacxin sau kiểm tra vật lý đạt tiến hành kiểm tra vô trùng Mỗi lô vacxin kiểm tra ống nước thịt dinh dưỡng, ống thạch máu, ống mơi trường yếm khí, ống mơi trường thạch nấm Kết cho thấy tồn mơi trường cấy sau ngày khơng có diện loại vi khuẩn , nấm Như vậy, hai lô vacxin kiểm tra đạt tiêu chuẩn vô trùng 4.1.2 Kết kiểm tra an toàn vacxin sau sản xuất Trong sản xuất vacxin, tiêu an toàn đặt lên hàng đầu Một sản phẩm khơng an tồn tiêm cho vịt gây phản ứng đơi gây chết vịt Hai lơ vacxin đạt tiêu chuẩn vơ trùng tiến hành kiểm tra an tồn vịt khỏe mạnh Theo dõi triệu chứng lâm sàng, tỷ lệ chết sau 10 ngày Kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết kiểm tra an tồn vacxin sau sản xuất Số Lơ Số vịt Liều vacxin vacxin (con) (ml/con) 10 10/10 100 Đạt 10 10/10 100 Đạt sống/tổng Tỷ lệ sống số (%) Kết luận Quan sát vịt sau tiêm vacxin với liều gấp đôi liều quy định, khơng thấy có phản ứng xảy vịt, cụ thể vị trí tiêm thấy khơng bị sưng, vịt không bị đau sờ nắn chỗ tiêm Sau 10 ngày theo dõi, tất vịt thí nghiệm ăn uống bình thường, sống khỏe mạnh Kết cho thấy hai lơ vacxin đạt tiêu chuẩn an tồn 4.1.3 Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất Hai lô vacxin sau kiểm tra đạt tiêu chuẩn an toàn tiến hành kiểm tra hiệu lực vacxin 31 Sau 21 ngày tiêm vacxin, vịt miễn dịch vịt đối chứng (không tiêm vacxin) thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida E.coli cường độc tương ứng, liều MLD/con, tiêm da Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau sản xuất Liều Lô vacxin Lô Số vịt tiêm Liều công cường (con) vacxin độc (ml/con) MD ĐC - MD ĐC - (250 1.106 – 1,2 106) CFU/con MD: Miễn dịch Số thú Tỷ lệ sống/số sống thú công (%) 5/5 100 5/5 100 5/5 100 5/5 100 ĐC: Đối chứng Ghi chú: 250 CFU vi khuẩn Pasteurella multocida 1.106-1,2.106 CFU vi khuẩn E.coli Kết theo bảng 4.3 cho thấy: Sau thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida E.coli cường độc tương ứng, liều MLD/con vịt tiêm vacxin có khả tạo miễn dịch chiếm tỷ lệ sống 100% Vịt đối chứng chết Với tỷ lệ vịt sống 100% sau thử thách với vi khuẩn cường độc chứng tỏ hai lô vacxin sản xuất đạt yêu cầu hiệu lực 4.2 Kết kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC Một vacxin tốt việc đạt u cầu vật lý, vơ trùng, an tồn hiệu lực xét tới độ dài bảo quản vacxin Vacxin đa giá tụ huyết trùng E.coli vịt đạt tiêu chuẩn vật lý, vô trùng, an toàn, hiệu lực dùng để kiểm tra độ dài bảo quản Vacxin bảo quản – 8oC sau thời gian – tháng dùng gây miễn dịch cho vịt Sau 21 ngày tiêm vacxin,vịt miễn dịch vịt đối chứng (không tiêm vacxin) 32 thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida E.coli cường độc tương ứng với liều MLD/con, tiêm da Kết trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết kiểm tra độ dài bảo quản vacxin sau – tháng bảo quản nhiệt độ – 8oC Thời Lô vacxin Liều gian bảo Lô quản 6 Số thú tiêm Số vịt công sống/số vacxin (con) cường thú độc công (ml/con) (tháng) Liều MD ĐC - MD ĐC - MD ĐC - MD ĐC - MD: Miễn dịch (250 1.106 – 1,2 106) CFU/con Tỷ lệ sống (%) 4/5 80 0/3 5/5 100 0/3 5/5 100 0/3 5/5 100 0/3 ĐC: Đối chứng Ghi chú: 250 CFU vi khuẩn Pasteurella multocida 1.106-1,2.106 CFU vi khuẩn E.coli Kết cho thấy lô vacxin bảo quản sau tháng, tháng đạt hiệu lực với tỷ lệ sống vịt miễn dịch từ 80 - 100% vịt đối chứng chết 4.3 Kết kiểm tra chất lượng vacxin thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày nhiệt độ 25oC – 30oC Vacxin sau sản xuất bảo quản nhiệt độ 2oC – 8oC, sau lấy để nhiệt độ 25 – 30oC Sau thời gian 1, 2, 3, 4, ngày, vacxin kiểm tra mặt vật lý Kết trình bày bảng 4.5 33 Bảng 4.5: Kết kiểm tra vật lý vacxin thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày nhiệt độ 25oC – 30oC Lô vacxin Số chai Kiểm tra vật lý mẫu kiểm tra/ngày Số chai đạt/số chai mẫu kiểm tra Kết luận 3/3 Đạt 3/3 Đạt Sau ngày, 30 chai mẫu kiểm tra lô vacxin đạt mặt vật lý Kết kiểm tra vật lý bảng 4.5 cho thấy: - Lọ vacxin có ngun vẹn khơng rạn nứt, đủ nhãn, có ghi rõ số lơ kiểm tra, liều dùng, hạn dùng, cách chích - Vacxin khơng đổi màu, có màu trắng đục sữa, khơng có tượng tách lớp dầu nước, nhuyễn đồng nhất, … Như vậy, vacxin đạt yêu cầu mặt vật lý Vacxin sau đạt tiêu chuẩn vật lý tiến hành kiểm tra hiệu lực Kết trình bày bảng 4.6 34 Bảng 4.6: Kết kiểm tra hiệu lực vacxin sau bảo quản nhiệt độ 25 – 30oC Thời Lô gian bảo vacxin quản Liều Lô (ml/con) (ngày) 2 vacxin Liều công Số vịt cường (con) độc Số thú sống/số thú công Tỷ lệ sống (%) MD 5/5 100 ĐC - 0/3 MD 5/5 100 ĐC - 0/3 MD 4/5 80 ĐC - 0/3 MD 4/5 80 ĐC - 0/3 MD 5/5 100 ĐC - 0/3 MD 5/5 100 ĐC - 0/3 MD 4/5 80 ĐC - 0/3 MD 5/5 100 ĐC - 0/3 MD 4/5 80 ĐC - 0/3 MD 5/5 100 ĐC - 1/3 67 (250 1.106 – 1,2 106) CFU/con MD: Miễn dịch ĐC: Đối chứng Ghi chú: 250 CFU vi khuẩn Pasteurella multocida 1.106-1,2.106 CFU vi khuẩn E.coli 35 Kết bảng 4.6 cho thấy: Tỷ lệ bảo hộ vịt miễn dịch (đã tiêm vacxin) lô vào ngày thứ thứ 80% Tỷ lệ bảo hộ vịt miễn dịch (đã tiêm vacxin) lô vào ngày thứ thứ 80% Chúng nhận thấy, tỷ lệ bảo hộ vịt miễn dịch (đã tiêm vacxin) khác nhau, nguyên nhân tính cá thể vịt khác vịt chết sức đề kháng yếu Hai lô vacxin kiểm tra hiệu lực cách công cường độc vi khuẩn Pasteurella multocida E.coli tương ứng liều 1MLD/con, tiêm da cho vịt miễn dịch (đã tiêm vacxin 21 ngày) với vịt đối chứng (không tiêm vacxin) Theo dõi thời gian 10 ngày, vịt đối chứng chết hết (100% chết) vịt miễn dịch sống (60% sống) vịt đối chứng chết (67% chết) vịt miễn dịch sống (100% sống) lơ vacxin đạt tiêu chuẩn Như vậy, theo kết thí nghiệm, vacxin để nhiệt độ 25 – 30oC thời điểm 1, 2, 3, 4, ngày đạt hiệu lực 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau tiến hành kiểm tra chất lượng hai lơ vacxin mặt vật lý, vơ trùng, an tồn hiệu lực Chúng rút số nhận xét sau: Vacxin đa giá tụ huyết trùng E.coli vịt Công ty Thuốc Thú Y TW NAVETCO sản xuất đạt tiêu chuẩn vật lý, vô trùng, an toàn hiệu lực Vacxin bảo quản – 8oC trì hiệu lực sau tháng tháng Vacxin để nhiệt độ phòng (25 – 30oC) đạt hiệu lực sau thời gian ngày 5.2 Đề nghị Theo dõi thêm thời gian bảo quản vacxin nhiệt độ – 8oC thời gian tháng, 12 tháng Tiến hành thí nghiệm độ dài bảo quản vacxin thời điểm 6, 7, 8, 9, 10 ngày lâu để người dân vùng sâu, vùng xa sử dụng vacxin tiện lợi hơn, đáp ứng nhu cầu ngày tăng số lượng chất lượng người chăn nuôi khắp nước 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Xuân Bình, 2002 Bệnh vịt biện pháp phòng trị NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Xn Bình, 1994 Tỷ lệ nhiễm bệnh tụ huyết trùng gia cầm theo lứa tuổi mùa vụ Long An Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y Tập I, số trang 67-71 Tơ Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Bài giảng vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Sa Đình Chiến, 2001 Nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng Sơn La, số đặc tính Pasteurella multocida phân lập được, biện pháp phòng trị Luận án tiến sĩ Nơng Nghiệp, Hà Nội Đào Trọng Đạt, 1995 Bệnh đường tiêu hóa gia súc gia cầm Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Phùng Duy Hồng Hà, Nguyễn Xuân Bình, 1995 Xác định serotype chủng Tụ huyết trùng gia cầm phân lập Long An Tạp chí khoa học Thú Y, tập II, số Phùng Duy Hồng Hà, 1990 Nghiên cứu sản xuất vacxin tụ huyết trùng gia cầm dạng nhũ dầu Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y Số Trương Thị Hoa, 2005 Khảo sát tình hình nhiễm vi khuẩn E coli vịt trại chăn nuôi tỉnh Đồng Nai Báo cáo tốt nghiệp Trường Trung học kỹ thuật nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Lê Văn Hùng, 1998 Giáo trình Miễn dịch học Tủ sách trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Đức Hiền, 2004 Sổ tay hướng dẫn kỹ thuật thú y, chăn nuôi vịt Chi cục thú y tỉnh Cần Thơ 11 Lê Hoàng Long, 2007 Khảo sát độ an toàn hiệu lực vacxin phòng tụ huyết trùng Escherichia Coli vịt thị xã Tân An, tỉnh Long An Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Ngành Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 38 12 Trần Thu Lâm, 2007 Đánh giá chất lượng vacxin tụ huyết trùng heo sản xuất từ chủng phân lập Việt Nam Luận văn tốt nghiệp BSTY Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 13 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2000 Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia cầm Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Như Pho, 2000 Bệnh E coli heo gia cầm Tủ sách trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc Nhà xuất nông thôn 16 Nguyễn Trọng Phước, 1998 Tỷ lệ nhiễm E coli vịt TP Hồ Chí Minh số vùng lân cận Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Chăn nuôi Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 17 Phan Thị Ngọc Sương, 2007 Đánh giá an toàn hiệu lực vacxin đa giá tụ huyết trùng, Escherichia Coli vịt phòng thí nghiệm điều kiện sản xuất Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y Trường Đại Học Cần Thơ 18 Lê Văn Tạo, Hồng Ngọc Cao, Cừu Hữu Phú, Nguyễn Bích Thủy, 2001 Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia cầm Nơng Cống (Thanh Hóa) lựa chọn vacxin phòng bệnh Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập VIII, số 19 Nguyễn Mạnh Thắng, 2003 Sử dụng Montanide – 50 làm chất bổ trợ miễn dịch cho vacxin tụ huyết trùng gia cầm vô hoạt Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông Nghiệp Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI 20 Carter G.R, 1955 Studies on Pasteurella multocida I.A Haemagglutination test for identification of serological types.IN American Journal of Veterinary Research, 1995 Pages 481 – 484 21 Namioka S, Murata M., 1961 Serological studies on Pasteurella mutocida II Characteristics of somatic “O” antigen of organism Cornell Veterinarian 51 Pages: 507 – 521 22 Rimler R.B., Glisson J.R., 1997 Diseases of poutry Tenth edition Pages: 368371 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn nhằm pha liều cơng cường độc thích hợp Phương pháp nhằm xác định số lượng vi khuẩn 1ml canh trùng để pha liều cơng cường độc vịt thí nghiệm Bước 1: Mở ống giống Pa1 giống GV13 Giống Pasteurella multocida chủng Pal đông khô giống E coli ( chủng GV13) : công ty Navetco cung cấp Sát trùng đầu ampul giống, bẻ đầu giống Dùng kim tiêm hút 0,2 ml canh dinh dưỡng TSB cho vào ống đơng khơ Lắc để hồn ngun ống giống Bước 2: Nuôi cấy canh trùng nguyên Nuôi cấy hỗn hợp tủ ấm 37oC / 5-6 Nhỏ 1-2 giọt giống lên bề mặt hai đĩa thạch máu Dùng que cấy ria mặt thạch máu sau cho vào tủ ấm 37oC / 24 Sau chọn 2-3 khuẩn lạc Pasteurella multocida 2-3 khuẩn lạc E.coli cấy vào ống môi trường canh dinh dưỡng TSB nuôi cấy 37oC / 6giờ (vi khuẩn Pasteurella multocida), nuôi cấy 37oC / 4giờ (vi khuẩn E.coli) Ta hỗn hợp canh trùng nguyên Bước 3: Xác định độ đục canh khuẩn Bước 4: Pha loãng Lấy ml canh trùng nguyên cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước sinh lý tiệt trùng, sau trộn để có huyễn dịch tương đối đồng nhất, pha lỗng ban đầu (10-1) Tiếp tục pha loãng theo sơ đồ sau để có độ pha lỗng thích hợp 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1ml + 9ml 4,5ml 4,5ml 4,5ml 4,5ml 4,5ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha loãng ban đầu 40 Bước 5: Kiểm tra độ khiết canh khuẩn Bước 6: Xác định số lượng tế bào vi khuẩn phương pháp đếm đĩa petri Pha loãng vi khuẩn từ 10-1 đến 10-6 sau trang 0,1 ml canh trùng pha lỗng nồng độ 10-6 lên đĩa thạch máu (Pasteurella multocida) đĩa thạch TSA (E coli) Cho đĩa vào tủ ấm 37oC / 24 Sau 24 đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa Số lượng vi khuẩn ml canh trùng tính theo công thức: X = a x N x 10 Trong đó: X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình ml canh nguyên N: hệ số pha lỗng a: Số vi khuẩn có 0,1ml canh khuẩn pha lỗng ( số khuẩn lạc trung bình đĩa thạch máu) Đơn vị tính: CFU/ml (CFU : Colony forming unit) 41 Phụ lục 2: Hình ảnh bệnh tích đại thể vịt bị cơng cường độc Hình 1: Bao tim tích nước vàng Hình 2: Tim xuất huyết, tụ huyết Hình 3: Màng bao tiêm viêm dính Hình 4: Gan sưng, hoại tử trắng Hình 5: Da tím ngắt Hình 6: Gan sưng, túi mật căng to 42 Hình 7: Gan sưng, có lớp chất tiết trắng bao phủ bề mặt gan Hình 8: Ruột non chứa dịch nhờn, xuất huyết Hình 9: Chân vịt viêm khớp 43 ... TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ ESCHERICHIA COLI TRÊN VỊT Ở CÁC NHIỆT ĐỘ BẢO QUẢN KHÁC NHAU Tác giả PHẠM NGỌC NHUNG Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ ngành Thú y Giáo viên hướng dẫn ThS TRẦN