§¹I HäC KHOA HäC Tù NHI£N §¹I HäC QuèC GIA Hà NộI NGÔ GIANG LIÊN CÔNG NGHệ Tế BàO ( Bài giảng lưu hành nội bộ) hà nội 2004 Mục lục Nội dung Chương 1: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào Khái niệm công nghệ tế bào 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 1.1.1 Tế bào động vật 1.1.1.1 Phát minh phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 1.1.1.2 Các phương pháp nuôi cấy 1.1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào invitro tạo dòng tÕ bµo 1.2 TÕ bµo gèc 1.3 TÕ bµo thùc vật 1.4 Nuôi cấy tế bào mức độ công nghiệp Chương 2: Kỹ thuật tế bào trần 2.1 Kỹ thuật tế bào trần 2.1.1 Cấu tạo thành tế bào vi sinh vật 2.1.2.1 Thu nhận tế bào trần vi sinh vật 2.1.1.2.1 Thu nhận tế bào trần tõ vi khuÈn 2.1 2.2 Thu nhËn tÕ bµo trần từ nấm 2.1.1.2.3 Thu nhận tế bào trần từ xạ khuẩn 2.1.2 Sự phục hồi tế bào trần 2.1.3 ứng dụng kỹ thuật tạo tế bào trần 2.2 Dung hợp tế bào trần 2.2.1 Điều kiện để dung hợp tế bào trần 2.2.2 Kiểm tra dung hợp tế bào trần 2.3 Hiện tượng plasmid qúa trình tạo tế bào trần 2.4 Một số kết nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tế bào trần ViƯt Nam 2.5 Lai tÕ bµo soma 2.6 øng dơng tế bào lai Chương Chuyển gen 3.1 Giới thiệu chuyển gen 3.2 Chuyển gen động vật 3.3 Các nguyên lý trình chuyển gen 3.3.1 Mục đích yêu cầu 3.3.2 Biểu sản phẩm chuyển gen 3.4 Các bước tạo động vật chuyển gen 3.5 Xác định đánh giá gen phân lập mong muèn 82 Trang 1-22 1 1 12 13 20 2323 23 23 26 32 35 36 39 43 43 45 47 48 49 49 50 50 54 54 54 55 57 57 3.6 ThiÕt kÕ vµ biểu gen vào vật mang 3.6.1 Các loại vật mang ( nhân tố chuyển gen) 3.6.2 Chuyển gen vào vËt mang 3.7 Thu nhËn tÕ bµo 3.8 Chun vËt mang vào tế bào nhận 3.9 Phân tích hiệu việc chuyển gen 3.9.1 Phương pháp nhân gen 3.9.2 Phương pháp Southern blot 3.9.3 Phương pháp Dot blot v slot blot 3.9.4 Các phương pháp phát mARN 3.9.5 Các phương pháp phát protein 3.10 Taọ dòng động vËt chuyÓn gen 3.11 ChuyÓn gen b»ng kü thuËt vi tiêm 3.12 Điều kiện để thực vi tiêm 3.13 Quy trình tạo động vật chuyển gen 3.14 Những thiết bị yêu cầu cho thao tác vi tiêm 3.15 Các gen dùng để chuyển vào động vật 3.16 ứng dụng chuyển gen thông qua vi tiêm 3.17 khả ứng dụng Việt Nam 3.18 Chuyển gen ë thùc vËt 3.18.1.ChuyÓn gen qua Agrobacterim 3.18.2 ChuyÓn gen trực tiếp từ ADN Tài liệu tham khảo Mục lục 83 58 59 60 59 59 62 62 63 63 64 65 65 66 66 67 68 69 70 76 77 77 78 81 82-83 Chương 1: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào Khái niệm công nghệ tế bào Công nghệ tế bào kỹ thuật dùng tế bào làm đơn vị để tạo thể sản phẩm theo nhu cầu công nghiệp người Điển hình công nghệ nhân giống trồng nuôi cấy mô tế bào Ngoài kỹ thuật dung hợp tế bào trần, nuôi cấy hạt phấn, bao phấn, lai tế bào sản xuất kháng thể đơn dòng thành tựu công nghệ tế bào 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 1.1.1 Tế bào động vật 1.1.1.1 Phát minh phương pháp nuôi cấy tế bào động vật Từ năm 1907, Harison người nuôi cấy mảnh mô phôi ếch dịch bạch huyết Đến năm 1923, Carel hoànthiện phương pháp nuôi cấy tế bào bình thủy tinh, dễ tiệt trùng tạo điều kiện cho bế bào phát triển tốt Nhưng phải chờ đến năm 1960, hoàn thiện môi trường nuôi cấy nhân tạo kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật phát triển mạnh Trong ®iỊu kiƯn nu«i cÊy ng­êi ta cã thĨ nu«i bÊt kỳ tế bào thể chọn nhiều dòng tế bào phương pháp cấy chuyền theo mẻ Vấn đề quan trọng nuôi cấy tế bào động vật phải có môi trường dinh dưỡng đủ chất nhân tố sinh trưởng, đồng thời phải giải phóng sản phẩm trao đổi độc hại để tế bào sống phát triển Môi trường nuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng độ pH nồng độ muối ổn định - Môi trường hóa chất: Được sáng tạo từ năm 1950 thay cho dịch sinh học dịch chiết từ phôi gà huyết tương dễ bị nhiễm trùng Môi trường hóa chất xác định dễ tiệt trùng, tránh lây nhiễm cho mẻ cấy, dễ cất giữ, dễ thay thêm bớt chất cần thiết, điều chế hàng loạt với số lượng lớn + Công thức pha chế môi trường gồm phức hợp chất hydrat cacbon, c¸c axit amin, c¸c vitamin, c¸c muèi, c¸c hoocmon nhân tố sinh trưởng Ví dụ: môi trường Eagle môi trường Dulbecco Nồng độ muôi phải đẳng trương (isotonic) để trì cân thẩm thấu Người ta dùng bicacbonat để tạo hệ đệm (buffer system) kết hợp với hệ làm giàu CO môi trường (5 - 10% CO /95% không khí) tế bào nuôi Độ pH thích hợp 7,4 Người ta thường thêm đỏ phenol để pH Nếu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng cam tế bào mọc tốt, từ đỏ chuyển nhanh sang màu vàng nhạt môi trường bị nhiễm khuẩn Các chất glucoz ghutamin chất để cung cấp lượng thường có nồng độ cao, vitamin hoocmon cofactor nhân tố sinh trưởng có nồng độ thấp + Serum không cần serum Thường thường để nuôi cấy phát triển cần cho thêm serum vào môi trường (5 - 10% v/v), dùng serum có nhiều bất lợi serum chứa phức chất không xác định nên dễ bị thay đổi tùy mẻ cấy, serum chiết xuất từ phôi thai bò đắt tiền Vì vậy, nhà nuôi cấy tế bào có nhiều cố gắng tạo môi trường với serum không dùng serum Người ta dùng chất bổ trợ để thay serum dùng insulin, transferin, ethanolamin cho thêm vào môi trường + Các chất kháng sinh dùng với mục đích phòng chống nhiễm khuẩn vi nấm cho mẻ cấy Các kháng sinh thường dùng penicillin, streptomicin amphotericin B Dùng kháng sinh có điều bất lợi chúng có tính độc tố tế bào, phải kết hợp với kỹ thuật tiệt trùng thật chu đáo - Đặc tính tế bào động vật nuôi cấy Có thể sử dụng tế bào dạng tế bào tự bạch cầu, tế bào limpho, tế bào mô Mô cắt thành mảnh nhỏ cho vào môi trường tiệt trùng xử lý enzym (trypsin chẳng hạn) kết hợp với kỹ thuật nghiền mô (homogenisa - teur) để thu tế bào huyền phu Dùng kính hiển vi để khảo sát dạng tế bào Ví dụ fibroblast lúc đầu có dạng tròn, sau bám vào đáy bình trở thành dạng kéo dài Đa số tế bào mô phát triển bám vào bề mặt đáy thành lớp, còntế bào mô lỏng máu, bạch huyết phát triển dạng huyền phù lơ lửng Người ta dùng nguyên liệu tế bào mẻ cấy đầu cho mẻ cấy tiếp cách chích tế bào từ mẻ đầu cho vào môi trường Nếu mẻ bám phải sử dụng enzym để tách riêng tế bào Khi sử dụng enzym (trypsin) phải làm nhanh, không để 15 phút enzym gây hại cho tế bào + Đời sống tế bào động vật nuôi cấy Hayflick Moorhead (1961) nuôi cấy bào phôi người phát tế bào cấy chuyền qua 50 hệ vài tháng, sau chúng vào trình thoái hóa số lượng tế bào giảm dần Các tế bào động vật có vú thể đặc tính Thời gian sống tế bào tùy thuộc vào mô mà ta lấy tế bào Đối với mô phôi, khả sinh trưởng dài so với tế bào từ mô thể trưởng thành Tuy vật, nuôi cấy người ta tạo nên dòng tế bào bất tử, tức chúng sinh trưởng vô hạn định biến đổi di truyền, gọi chuyển dạng (transformation) trình dẫn tới tạo thành dòng tế bào liên tục Sự chuyển dạng làm cho tế bào có nhiều thay đổi độ nhạy cảm với tác nhân kích thích, đặc tính bám bề mặt,biến đổi trongbộ thể nhiễm sắc - lưỡng bội trở thành lệch bội (aneuploid) Sự chuyển dạng gây nên virut tác nhân gây đột biến, oncogen (gen gây ung thư gen myc, ras) Nhiều dòng tế bào chích từ mô ung thư phát triển in vitro, ví dụ tế bào HeLa (từ mô ung thư cổ chị Henrietta Lack) tế bào Namalawa (tế bào ung thư lymphomacủa chị Namalwa), dòng tế bào số động vËt cã vó nh­ chuét, chuét Hamster Trung Quèc, khØ xanh châu Phi + Sự sinh trưởng tế bào ®éng vËt in vitro Sù sinh tr­ëng in vitro tr¶i qua pha: + Pha chËm (lag phase): Lµ giai đoạn từ tế bào cho vào môi trường Thời gian tùy vào dạng mô chích tế bào tùy trạng thái chuyển hóa chúng + Pha tiến triển (exponential growth): Là giai đoạn tế bào nhân đôi liên tục - bình thường tế bào động vật nhân đôi qua thời gian 15 - 25giờ Sinh trưởng kéo dài nuôi cấy theo mẻ từ - 2x106 tế bào/cm3 nồng độ tế bào chuẩn môi trường ổn định + Pha dừng (stationary phase): Là giai đoạn sau pha sinh trưởng, giai đoạn số lượng tế bào không thay đổi, tức chất dinh dưỡng bị nghèo dần tích lũy sản phẩm trao đổi gây ức chế môi trường Xuất hiện tượng tự hoại tế bào (apoptosis) thể chỗ ADN bị đứt mảnh tạo thành blebs đặc trưng bề mặt tÕ bµo NÕu mn tÕ bµo tiÕp tơc sinh tr­ëng phải tiếp tục mẻ cấy chuyền với môi trường míi (xem H.2) Sè mỴ cÊy chun (pasage number) cđa dòng tế bào tính số mẻ cấy chuyền liên tục từ mẻ nuôi Số mẻ cấy chuyền có liên quan tới số hệ dòng tế bào, điều phụ thuộc vào tỷ lệ split (split ratio) số lần nuôi cấy triển khai giai đoạn cấy chuyền Trường hợp đơn giản mẻ nuôi kết hợp cấy chuyền thành mẻ mới, tức tỷ lệ split Trong trường hợp số hệ số mẻ cấy chuyền Như vậy: Sè thÕ hƯ = sã mỴ cÊy chun x tû lệ split/2 Trong nuôi cấy theo mẻ chất dinh dưỡng bị nghèo tích lũy chất độc Trong cấy chuyền liên tục môi trường đổi 1.1.1.2 Các phương pháp nuôi cấy Phương thức đơn giản nuôi cấy theo mẻ (batch culture), tế bào cho vào mẻ cấy giữ vài ngày sinh trưởng dừng lại Đây hệ thống nuôi cấy kín thêm vào lấy khỏi môi trường Điều kiện chuẩn: nuôi lượng tế bào 105 /cm3 nuôi ngày tế bào tăng tới 106/cm3 Cần khuấy lắc để huyền phù tế bào chất dinh dưỡng phân bố môi trường Tuy nhiên môi trường nghèo dần chất dinh dưỡng tích lũy chất độc (sản phẩm chuyển hóa tế bào), tế bào vào thoái hóa Người ta kéo dài thời gian số lượng tế bào tăng cao áp dụng phương thức nuôi cấy theo mẻ dinh dưỡng (fedbatch system), chất dinh dưỡng tiếp tế thêm vào môi trường qua thời gian,do tế bào có đủ chất dinh d­ìng ®Ĩ sinh tr­ëng, nh­ng ®Õn mét thêi gian định sinh trưởng dừng lại tích lũy độc tố ammonia lactat Phương thức nuôi cấy liên tục cấy chuyền giải vấn đề môi trường đổi chất độc bị loại bỏ tương tự in vitro Có hai cách nuôi cấy liên tục: cách thø nhÊt lµ dïng hƯ thèng tiÕp liƯu chÊt dinh dưỡng trì tế bào bình cấy đạt số lượng 107/cm3; cách thứ hai đồng thời thêm hệ thống liên tục rút bớt môi trường với tế bào khỏi bình cấy, hệ số tăng trưởng tế bào tỷ lệ với hệ số đổi dòng chảy vào ra, gọi hệ ổn hóa (chemostat) dạng nối lên men để nuôi cấy liên tục 1.1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào invitro tạo dòng tế bào * Sản xuất kháng thể đơn dòng Để cải tiến chất lượng sản phẩm vật nuôi, hướng sử dụng ADN tái tổ hợp đa dạng thường tập trung vào lĩnh vực sinh sản, bảo vệ sức khoẻ, tăng số lượng chất lượng sản phẩm vật nuôi Trong lĩnh vực có yêu cầu cấp thiết này, phương pháp nhằm tăng chức (như tăng miễn kháng); thay gen ( đa gen Booroola thể cừu để tăng sinh sản, theo Bindon, 1984); ghép gen vào thể nhận thành công hay không? Những phương hướng phương pháp tiến truyền thời đại, đồng thời kết thúc nhu càu cải thiện đời sống người, có nhièu sản phẩm hàng hoá chất lượng cao Tuy nhiên nước ta, bắt ®Çu tËp trung øng dơng kÜ tht gen, sư dơng ADN tái tổ hợp lĩnh vực vi sinh vật, lĩnh vực động vật cao cấp giai đoạn mở đầu * Tổng hợp hoocmôn sinh tr­ëng b»ng kü tht di trun HiƯu qu¶ thËt khổng lồ loại sản phẩm sinh học đặc hiệu, quan trọng, có hoạt tính sinh học cao mang tên somatostatin loại hoocmôn đặc biệt thường tổng hợp não động vật người, vùng đồ thị, với hàm lượng nhỏ bé somatostatin có vai trò điều hoà hoocmôn sinh trưởng insulin vào máu kiểm tra tổng hợp hai loại hoocmôn Năm 1977, Itakura, H.boyer(Nhật) thành công tổng hợp hoocmôn somatostatin tế bào vi khuẩn Dây truyền sản xuất loại sản phẩm sinh học đặc biệt quý bao gồm công đoạn chủ yếu sau đây: - Người ta tiến hành tổng hợp nhân tạo gen mã hoá somatostatin, tổng hợp ống nghiệm - Tiếp đó, cho gắn gen vào ADN vòng plasmit để dùng plasmit làm vectơ tách dòng, để chuyển gen vào nhà máy sản xuất, tức tế bào vi khuẩn nhận Plasmit ADN tái tổ hợp tức plasmit lai có mang gen somatostatin đa vào tế bào trực khuẩn đ7 kt cuối cần có điều kiện để tăng tần số hoà nhập ADN ngoại lai vào tế bào thể nhận Có vài nhân tố quan trọng nhất, là: • Nồng độ ADN tiêm: Nồng độ ADN tiêm nhân tố hạn chế hiệu hồ nhập Nồng độ tối ưu 1-2 ng/µl, tức khoảng 100-1000 đoạn ADN • Tạo đầu dính (non-blunt end): Một phân tử ADN mạch thẳng tiêm vào hiệu cắt enzym endonuclease tạo hai đầu dính • Vị trí tiêm ADN vào tế bào: Tiêm ADN ngoại lai vào nhân thường cho hiệu cao vào tế bào chất • Kiểu tế bào tiêm: Tiêm ADN lạ vào nhân trứng nhân tinh trùng làm thay đổi kiểu gen kiểu hình hợp tử trứng tinh trùng tạo Một cách khác cho hiệu cao tiêm vào nhân hợp tử Tuy nhiên, cách người ta tiến hành bò cừu hiệu đạt 2-2% Sau tiến thông báo lĩnh vực nghiên cứu tế bào cuống phôi (ES) nguyên bào tinh, ngun bào nỗn (PGC) Những dòng tế bào cho phép hoà nhập ADN lạ vào hệ gen động vật cách có hiệu cao • Nguồn vật liệu di truyền tạo phôi: Hiệu gắn kết ADN lạ vào genome phôi lai nòi cho hiệu cao vào genome phơi dòng cận huyết 3.13 Quy trình tạo động vật chuyển gen 67 (1) Gen có chức lựa chọn phân lập phòng thí nghiệm (2) Một vật cho gây siêu nỗn thu hoạch phơi từ ống dẫn trứng (3) Gen đưa vào trứng thụ tinh kỹ thuật vi tiêm (4) Phôi chuyển gen đưa vào vật nhận mà cho đời non có gen chuyển (5) Kiểm tra non gen chuyển, lai tạo để tạo non có tính ổn định di truyền tính trạng 3.14 Những thiết bị yêu cầu cho thao tác vi tiêm Gía thết bị cần thiết cho thao tác chuyển gen vi tiêm khoảng 50ngàn-80 ngàn USD bao gồm: • Hệ thống kính hiển vi độ phân giải cao với vật kính Nomarski Hoffman(Kính hiển vi soi ngược) với thị kính 10x-15x vật kính 20x 40x để quan sát nhân non 68 • Tủ ấm CO , để trì nhiệt độ 37-38oC với nồng độ CO 5%-6% • cặp vi thao tác Litz tương đương có tác dụng điều khiển kim vi tiêm kim giữ; • Cặp syringe điều khiển lượng dung dịch kim vi tiêm kim giữ • Thiết bị giữ điều khiển syringe, • Các thiết bị chế tạo gia cố kim • ống capillary dùng đế chế tạo kim vi tiêm, kim giữ kim nạp • Dầu parafin, agar hố chất cần thiết khác • Bàn chống rung, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật vi phẫu thuật, 3.15 Các gen dùng để chuyển vào động vật Cho đến nay, người ta chuyển nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người, động vật, thực vật vi sinh vật vào loại động vật chuột, thỏ, cá loại vật ni bò, cừ, dê, lợn , gà, chim chí vào muỗi Động vật Gen chức chúng nhận Cá -Gen sinh trưởng yếu tố sinh trưởng (fGH, hGH, bGH) δcrystallin (gà), β-gallactosidase, kháng hygromycine, protein chống đông lạnh, ÀP, α-globin, neomicine, phosphats-transferase, liciferase Lợn -Các loại gen hóc môn sinh trưởng yếu tố sinh trưởng (mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMT-hGF mMT-bGH 69 Chuột hGH, rGH, hGRF, gen mã hoá luciferase Cừu (mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMT-hGF ), smt-sGH5, sMT-sGH9 α1-antitripsin (trong điều trị viêm phổi), tạo albumin, yếu tố trình đơng máu Bò b-GH Dê 3.16 Ứng dụng chuyển gen thơng qua vi tiêm Ngày nay, chuyển gen nói chung vi tiêm ADN nói riêng cách mạng ngành chăn nuôi giới Mục tiêu chăn ni tăng khả sinh sản, tăng hiệu chăn nuôi, tăng suất sản phẩm tăng khả chống bệnh Do chuyển gen làm thay đổi cấu trúc vật chất di truyền nên tạo bước nhảy vọt vế khả vật ni mà tự nhiên khơng có Những thành tựu ứng dụng tạo động vật chuyển gen nhờ vi tiêm sau: Tăng cường khả sinh trưởng thay đổi đặc tính thể: Khả sinh trưởng chất lượng sản phẩm động vật cao kiểm soát gen tăng cường sinh trưởng Việc chuyển gen hoocmon Ví dụ chuột chuyển gen hormon sinh trưởng (theo Bringster R.L Hammer R.E) 70 sinh trưởng chuột người vào động vật tăng tỉ lệ kích thước thể lên hai lần Lợn chuyển gen tháng tuổi nặng 28% so với lợn không chuyển gen có mức hoocmon sinh trưởng gấp 50 lần dịch mã gen dung hợp MLP Tăng sản lượng chất lượng sữa: Machlin (1979) thấy tăng hoocmon sinh trưởng HGH có nguồn gốc ngoại sinh làm tăng 18% sản lượng sữa Nếu bò chuyển gen hoocmon sinh trưởng làm tăng lượng hoocmôn sinh trưởng thể tăng sản lượng sữa mà không gây tác dụng xấu tiêm nhiều hoocmon sinh trưởng Tạo biệt dược, mô phủ tạng thay cho người: Người ta tan cừu chuyển gen mà sữa chúng có chứa protein lactofein có tác dụng chất kháng sinh Một loài dê chuyển gen đũng tạo mà máu chứng chứa chất antitrombine ỉa loại ~glycoprotein có chức điều hồ đông máu Người ta cho phủ tạng linh trưởng nhóm gần người dùng ghép cho người thục tế khó khăn: Ngày dùng phủ tạng lợn dễ từn có kích thước tương tự người Tuy nhiên, người ta dùng phủ tạng lợn gặp khó khăn màng tế bào chứng có enzym galactose (người khơng có) làm trở ngại cho việc ghép Vì thế, nhà khoa học (1998) nghiên cứu tạo giống lợn khơng có galactose chuyển hai ba gen người cho lợn bước đầu giải khó khăn Tạo sản phẩm kinh tế khác: 71 Chuyển gen làm tăng hàm lượng systein, làm tăng tốc độ mọc lông, làm tăng tổng hợp collagen làm tăng độ bền da Người ta tạo giống cừu chuyển gen mà tự thay lông ăn loại thức ăn đạc biệt không cần cắt xén lông Một giống cừu chuyển gen khác có thời gian cho lơng 1/3 so với cừu không chuyển gen Tạo dược phẩm Sản xuất dược phẩm theo yêu cầu mức độ cao mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ thân nó; Chuyển khả sản xuất dược phẩm sang đời sau Các loại dược phẩm sử dụng gần có nguồn gốc từ động vật chuyển gen Động vật Dược Sử dụng chuyển phẩm/protein gen Máu hệ tuần hoàn Lợn Hemoglobin người Năm 1991, lợn chuyển gen tạo từ phôi ngày tuổi TTCNSH NewJersey Gen chuyển la tạo hemoglobin người, có khả vận chyển oxy bình thường Cừu, Lợn, Yếu Bò tố chống Điều trị bệnh ưa chảy máu giảm nguy phản đông máu VIII, ứng truyền máu IX Cừu, Bò Fibrinogen Bò Albumin Điều trị vết thương huyết Duy trì thể tích máu chống sốc máu 72 người Dê Chất chống đông Protein chống đơng máu nhóm III xuất máu nhóm III thường xun thể có vai trò đơng máu Công ty CNSH Massachusess tạo dê chuyển gen này, hàng năm tạo 500-800 lít sữa, lít chứa 28 g protein Cừu Alpha-1-anti Thiếu hụt dẫn tới hội chứng “Emphysema” tripsin Protein giúp tăng q trình vận chuyển qua màng dưỡng khí chất thải Các nhà KH Scottlen tạo cừu biến đổi gen sản xuất >35g alpha-1-antitripsin lít sữa=1/5 nhu cầu điều trị cho bệnh nhân/năm Tuy nhiên, vào tháng năm 2003, công ty phải từ bỏ cơng trình chi phí tốn cho việc tinh chế protein từ sữa cừu Cừu, lợn, Yếu tố hoạt hoá Enzyme chống đơng vón sử dụng điều trị số dê plasminogen bệnh tim mạch, ngẽn mạch mô bào Điều trị phòng chống lây nhiễm Dê Pro542 Dê, cừu Yếu Điều trị HIV tố chuyển vận xuyên màng Bò Alpha- Chống nhiễm trùng lactabumin Bò Colagen I II Sửa chữa mô bào, điều trị thấp khớp 73 Kháng thể Gà Kháng thể, Trứng với hàm lượng dinh dưỡng phù hợp với nhu máu, cầu người Protein dinh dưỡng Chuột Kháng thể người Kháng thể động vật có phản ứng mẫn kháng thể người tổng hợp từ chuột khơng Gà, bò, dê Kháng thể đơn Các loại vaccine tạo vaccine viêm gan dòng B Các loại khác Dê Protein chống Năm 1998, báo cáo cho rằng, sữa dê có chứa bệnh số rét loại protein giống với protein ký sinh trùng số rét, sữa dùng loại vaccine chống bệnh sốt rét Thỏ Alpha- Chống bệnh Pompe’s, bệnh rối loạn tế bào gan-> glucosidase khơng có khả chuyển hố glycogen –> đái đường Bò loại protein giúp vật non hấp thụ Fe2+, có Lactoferin tác dụng chống nhiễm khuẩn, chống thiếu máu, chống viêm khớp Dê Acide Glutamic Điều trị tiểu đường nhóm decarboxylase Chuột Hoocmơn sinh trưởng người 74 Giá trị thương mại Có khoảng 10-30% số trường hợp cấy chuyển gen chuột thành công, đó, có 5% số trường hợp Bò, dê, cừu thành cơng Việc tạo vật chuyển gen giai đoạn đắt (100.000 -200.000 USD năm 1999) hy vọng vài năm nữa, chi phí cho ca chuyển gen khoảng 5000 USD Nhưng hiệu đem lại cao, cơng ty Winscosin dự tính bò chuyển gen vòng đời tạo 200-300 triệu USD trị giá dược phẩm Giá số sản phẩm thuốc tạo công ty ‘Animal Pharming’ Thuốc Động vật Gía/Động vật/năm AAT (α-1 antitrypsin, thiếu hụt di truyền dẫn tới Cừu 15.000 USD hội chứng emphysema) TPA(tissue Plasminogen activator, điều trị đông Dê 75.000 USD máu) Yếu tố VIII ( yếu tố đông máu, điều trị ưa chảy Cừu 37.000 USD máu XI) Hemoglobin (máu thay thế) Lợn 3.000 USD Lactoferin (chất thay bỏ sung cho trẻ nhỏ) Bò 20.000 USD CFTR (Cystic fibrosis transmenbrane conductant Cừu, chuột, regulator, điều trị nang xơ 75.000 USD dê Human Protein C, chống đông máu, điều trị đông Lợn máu (giá thị trường thời sản xuất động vật) 75 1.000.000 USD 3.17 Khả ứng dụng Việt nam Động vât chuyển gen trở thành xu hướng nghiên cứu phát triển thay cung cấp thực phẩm đơn Việc nghiên cứu tạo động vật chuyển gen để tạo dược phẩm sản phẩm chúng thực nhiều nước giới Nhu cầu thị trường giới dược phẩm đặc hiệu tạo đường chuyển gen Việc chuyển gen tạo sản phẩm chuyển gen tỷ lệ thành cơng thấp, chi phí cao chi phí giảm nhiều năm gần giảm nhiều năm tới Động vật chuyển gen xu hướng phát triển tất yếu phục vụ nhu cầu ngày tăng người Triển vọng động vật chuyển gen khơng có giới hạn Tuy nhiên, để đạt tới tiềm dường trình lâu dài khó khăn số trường hợp, triển vọng thật rõ ràng ngày có nhiều đầu tư kinh phí chất xám vào lĩnh vực Lĩnh vực phát triển tạo động vật chuyển gen sản xuất thuốc, sản xuất protein quí qua đường tiết sữa Mặc dù ứng dụng động vật chuyển gen nơng nghiệp chưa khai thác, song tương lai hứa hẹn mang lại lợi nhuận không nhỏ Việc chuyển gen vào động vật làm nảy sinh vấn đề pháp luật đáo đức Trong tạo động vật chuyển gen mang lại nhiều lợi nhuận có quan điểm trái ngược, lo sợ tạo động vật chuyển gen đe dọa phá vỡ cân hệ sinh thái động vật chuyển gen có khả sinh sản thấp, lai với động vật tự nhiên làm giảm khả sinh sản, giảm số lượng, de dọa tồn lồi Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả kháng bệnh có 76 biểu bệnh lý Thêm vào đó, động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm không đạt nhiều ủng hộ tuyệt đại cơng chúng Có số quan điểm cho thực phẩm chuyển gen có tác hại người gây dị ứng Người ta lo lắng đến vấn đề sức khoẻ sử dụng loại thực phẩm Tuy nhiên, nay, quan quản lý thực phẩm thuốc Mỹ FDA (food Drug Administration) cho phép thực phẩm chuyển gen lưu hành thị trường với điều kiện sản phẩm phải dán nhãn sản phẩm chuyển gen để người tiêu dùng lựa chọn nhà sản xuất phải cam kết sản phẩm khơng gây dị ứng phản ứng tiêu cực Trong đó, ứng dụng y học động vật chuyển gen dễ dàng chấp nhận đối mặt với bệnh tật hiểm nghèo người ta lựa chọn giải pháp rủi ro Trong tương lai không xa, nhà khoa học hy vọng làm tăng nhận thức công chúng chấp nhận sản phẩm chuyển gen 3.18 ChuyÓn gen ë thùc vËt HiƯn nay, kü tht chun gen ë thực vật để tạo giống biến đổi gen thực phương thức chủ yếu: là, chuyển gen qua vi khuẩn đất Agrobacterium: hai là, chuyển gen ADN trực tiếp vào tế bào nhờ biện pháp vật lý hóa học 3.18.1 Chuyển gen qua Agrobacterim Agrobacterim tumefaciens vµ A.rhizogenes lµ loµi vi khuẩn gây bệnh có chứa plasmit Plasmit cấu tạo từ ADN có tế bào chất vi khuẩn tồn độc lập với nhiễm sắc thể cña vi khuÈn ADN plasmit mang mét sè gen quy định số tính trạng đặcthù vi khuẩn tính chống chịu thuốc kháng sinh Ngoài plasmit có 77 đặc tính chúng chuyển từ tế bào sang tế bào khác gắn nhập vào ADN hệ gen tế bào chủ Khi vi khuẩn Agrobacterim xâm nhiễm vào qua vết thương rễ đoan ADN plasmit vi khuẩn xâm nhập vào té bào ngoại vi vết thương, di chuyển đến tận nhiễm sắc thể gắn nhập vào ADN nhiễm sắc thể Về sau, gen ADN plasmit hoạt động, cho protein, enzym gen plasmit quy định, toạ nên bệnh mụn cổ rễ (trường hợp nhiễm A.tumefaciens), rễ tóc (trường hợp nhiễm A.rhizogenes) Lợi dụng tính chất chuyển gen qua Agrobacterim, nhà kỹ thuật gen tạo ADN plasmit mang gen có lợi gen chống chịu chất độc, chất thuốc, gen cố định đạm vào tế bào thực vật thông qua Agrobacterim để tạo nên giống biến đổi gen có đặc tính mong muốn Một mục tiêu quan trọng nhà tạo giống làtạo giống trồng không thuộc họ đậu lúa, ngô, có khả cố định đạm không khí (tức biến đổi N không khí hợp chất hữu chứa nitơ) phương pháp chuyển gen cố định đạm chứa plasmit vi khuẩn cố định đạm cộng sinh nốt sần rễ họ đậu vào tế bào chủ, từ tái sinh vi nhân giống giống lúa, ngô có khả nưang cố định đạm từ N không khí 3.18.2 Chuyển gen trực tiếp từ ADN Để chuyển ADN tái tổ hợp ngoại lai có mang gen thiết kế theo tính trạng mong muốn vào tế bào trần, ng­êi ta cã thĨ sư dơng c¸c biƯn ph¸p hãa häc nh­ sư dơng chÊt polytetylen glycol (PEG) v× chÊt biến đổi màng sinh chất tạo điều kiện cho ADN xâm nhập vào tế bào vào nhiễm sắc thể, sử dụng thể mỡ (liposome), tức hạt cầu có cấu tạo màng lipoproteit, chứa ADN tái tổ 78 hợp cần chuyển; hạt liposome dễ dàng xâm nhập qua màng sinh chất tế bào trần để vào tế bào gắn vào nhiễm sắc thể Một kỹ thuật tương đối có hiệu để đưa ADN trực tiếp vào tế bào chủ kỹ thuật điện đục lỗ, hay gọi điện thẩmthấu, kỹ thuật cho tập hợp tế bào trần nuôi cấy chịu loại xung động điện thời gian ngắn với điện cao, điện trường làm biến đổi màng sinh chất, tạo nên lỗ siêu vi để phân tử ADN xâm nhập vào tế bào qua lỗ, sau màng khôi phục lại trạng thái ban đầu cctế bào chuyển ADN có khả sống phát triển Kỹ thuật chuyển gen áp dụng có kết cho nhiều dạng trồng lúa, lúa mì, ngô, thuốc lá, cà chua để tạo giống biến đổi gen Để chuyển gen vào tế bào mô in vitro, mà không cần tạo tế bào trần, người ta sử dụng phương pháp bắn đạn ADN trực tiếp xuyên qua vách xenluloz màng sinh chất vào tế bào Đạn ADN viên bi nhỏ vàng tungsten bao bọc ADN cần chuyển Phương pháp chuyển dễ dàng ADN vào trực tiếp mô mà không gây hủy hoại cho tế bào nhận, phép nghiên cứu hiểu biểu gen lạ nhận mô khác nhau, chuyển ADN trực tiếp vào mô sẹo nuôi cây, từ tái sinh biến đổi gen Phương pháp bắn đạn ADN trực tiếp vào mô thực có kết nhiều loại trồng đậu tương, ngô, lúa, mì, ngô Ngoài ra, nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nghiên cứu áp dụng phương pháp vi tiêm, siêu âm mô, thấm mô 79 Với ký thuật chuyển gen, nhà tạo giống tạo hàng loạt giống biến đổi gen có suất cao, phẩm chất tốt, đáp ứng nhu cầu ngày cao thị trường, đến mức ngày nghe đến thuật ngữ sản phẩm biến ®ỉi gen”, ng­êi ta võa mõng võa lo Mõng lµ dùng sản phẩm ngon, rẻ, nhiều,nhưng lo liệu sản phẩm biến đổi gen có hại đến sức khoẻ trước mắt lâu dài không, có số trường hợp sau ăn sản phẩm biến đổi gen (ví dụ bánh bột ngô chuyển gen) bị dị ứng mỏi phải tới bệnh viện điều trị Tuy nhiên, mặt khoa học y học chưa có công trình chứng minh chắn sản phẩm biến đổi gen có hại cho sức khoẻ, số sản phẩmbiến đổi gen có chứa số protein đặc biệt mà hệ enzym tiêu hóa không phân giải được, vào máu gây dị ứng tác động chúng giống tác nhân gây dị ứng khác có sản phẩm bình thường Đây số trường hợp trồng biến đổi gen điển hình áp dụng vào sản xuất: lúa (kháng virut); ngô (kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, kháng rirut, bất thụ đực, hàm lượng axit amin; lyzin triptophan cao); lúa mì (kháng thuốc trừ sâu); cải dầu (kháng thuốc diệt cỏ, thay đổi thành phần axit béo axit amin lyzn, metionin, bất dục đực, sản xuất enkephalin); hướng dương (thay đổi thành phần axit amin; metionin, zystein, kháng thuốc diệt cỏ); đậu tương (kháng thuốc diệt cỏ, thay đổi thành phần axit amin; metionin, xystein); cải củ (kháng thuốc diệt cỏ vi rút); khoai tây (kháng sâu, virut, kháng thuốc diệt cỏ, tăng hàm lượng tinh bột, sản xuất anbumin huyết người); cà chua (kháng sâu, virut, chín chậm); rau diếp (kháng vi rut); dưa chuột (kháng virut); dưa tây (kháng virut thuốc diệt cỏ, chín chậm); thuốc (kháng sâu, thuốc diệt cỏ rirut, sản xuất globulin miễn dịch), cỏ linh lăng (kháng virut, thay đổi thành phần axit amin: 80 metionin); hồng (thay đổi màu sắc cánh hóa); cúc (thay đổi màu sắc canh hoa); liễu (kháng thuốc diệt cỏ) Tài liệu tham khảo Andrea Satre, 2002, Transgenic Animals and Pharmaceutical production, Sience and Education Transgenic Animal Sicence: Principles and Methods, Breekveldt J Jongerden J ,1998, Transgenic Animal inpharmaceutical production, Biotechnology and Development mornitor No 36: 19-22 http://www.pharming.com Santanu Banik 2003 Animal pharming-protential and applications.Theory Manual- Genome analysis using molecular markers in farm animals Kaul Gautam 2003 Transgenesis: Technology and application.Theory Manual- Genome analysis using molecular markers in farm animals H.Lodish and all 2000 Molecular cell Biology th Ed Scientific American book Inc.New York T.A Brown 1999 Genomes John Whiley& Sons (ASIA) PTELTD Singapo, New York 81 ... Chương 1: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào Khái niệm công nghệ tế bào Công nghệ tế bào kỹ thuật dùng tế bào làm đơn vị để tạo thể sản phẩm theo nhu cầu công nghiệp người Điển hình công nghệ nhân... 1.1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào invitro tạo dòng tế bào 1.2 Tế bào gốc 1.3 Tế bào thực vật 1.4 Nuôi cấy tế bào mức độ công nghiệp Chương 2: Kỹ thuật tế bào trần 2.1 Kỹ thuật tế bào trần 2.1.1 Cấu tạo... lục Nội dung Chương 1: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào Khái niệm công nghệ tế bào 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 1.1.1 Tế bào động vật 1.1.1.1 Phát minh phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 1.1.1.2