140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH – MIỄN DỊCH V/v Thực hành trypsin tế bào BHK-21 chai Rouxs 1.Mục đích: Thành thạo bước quy trình trypsin tế bào BHK21 từ chai T75 chai Rouxs 2.Thời gian, địa điểm: Thời gian: Ngày 10 tháng năm 2014 Địa điểm: Phòng tế bào mơn Hóa sinh – Miễn dịch 3.Người thực Người thực hiện: Trần Thị Nhuận Người hướng dẫn: Phạm Thị Nga 4.Cách tiến hành 4.1.Nguyên vật liệu: a.Tế bào: Tế bào BHK21 nuôi cấy ngày 140607, P18 140608, P18 Tế bào phát triển, tỉ lệ bám đáy 100% b Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm: MEM1x: Thành phần: NaHCO3……………… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…………… 50µg Nước cất vơ trùng vừa đủ lít 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT MEM 5% Thành phần: MEM1x……………….280ml FBS…………………….14ml FBS: Thành phần: PBS bột ………………… 9,55 gam Nước cất vơ trùng vừa đủ …….1 lít Trypsin – EDTA 10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml Trypan blue 0,4% c Dụng cụ an toàn sinh học Mũ, quần áo, trang, găng tay Chai xịt cồn 700 d.Dụng cụ hấp, sấy: STT Vật liệu Số lượng Cốc đựng thủy tinh 01 Ống ly tâm 50ml 01 Chai Rouxs 03 Hộp type 5ml 01 Hộp type 200µl 01 Type thủy tinh10ml 05 Chai Rouxs 03 Hộp giâý lau 01 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Số lượng 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Pipet 5ml 01 Pipet 100- 1000µl 01 Pipet điện 01 Cabinet 01 Máy ly tâm 01 Tủ ấm CO2 01 Tủ lạnh 40C 01 Tủ lạnh -200C 01 Buồng đếm tế bào 01 10 Kính hiển vi soi ngược 01 4.2.Các bước thực Bước 1: Chuẩn bị Cabinet đưa mơi trường nhiệt độ phòng Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet 15 phút Chuyển môi trường nhiệt độ phòng: Chuyển mơi trường bảo quản tủ lạnh đưa ngồi để tan đơng Bước 2: Quan sát tế bào Mục đích: quan sát mức độ phát triển tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy Cách tiến hành: Quan sát hai chai T75 tế bào BHK21 kính hiển vi soi ngược hình dạng tế bào, mức độ phát triển, tỷ lệ tế bào bám đáy Tế bào BHK21 sau ni cấy ngày thấy tế bào hình thn nhỏ, tỷ lệ bám đáy 100% Bước 3: Loại bỏ môi trường ni: Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường Chú ý: Cho đầu type xuống đáy chai, hút hết môi trường nuôi cấy Bước 4: Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết mơi trường sót lại Cách tiến hành: Thêm vào chai nuôi 15ml PBS- vào chai nuôi T75 Lắc ngang chai, hút bỏ PBS- Rửa tế bào lần với PBS- Bước 5: Trypsin tế bào Mục đích: tách tế bào khỏi đáy chai Cách tiến hành: Dùng pipet hút 3ml Trypsin cho vào mặt chai tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để tế bào đồng pha tách Quan sát tế bào sau trypsin kính hiển vi tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời tiến hành dừng trypsin Thời gian trypsin tế bào BHK21(140607, P18) chai phút, chai (140608, P18) phút Chú ý: Không lắc chai nuôi TB Bước 6: Trung hòa trypsin Mục đích: Dừng q trình trypsin Cách tiến hành: 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Vỗ mạnh chai đập chai nuôi để tế bào tách hồn tồn (tránh làm mơi trường bắn lên thành bình) Dùng pipet hút 7ml mơi trường MEM10% cho vào chai T75 để trung hòa trypsin Dùng pipet đảo môi trường, tưới lên mặt tế bào bám đáy, lắc nhiều lần để bong hết tế bào bám dính đáy chai Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm Bước 7: Ly tâm đánh tan cặn Mục đích: thu cặn tế bào Cách tiến hành: Cho ống fancol 50 ml chứa huyễn dịch tế bào đem ly tâm 700vòng/phút 10 phút Sau ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch phía trên, giữ lại cặn tế bào Hút 20 ml môi trường MEM5% cho vào ống, dùng pipet đảo rà đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào Chú ý : Khi hút dung dịch phía trên, khơng để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào hút lẫn cặn tế bào Bước 8: Đếm tế bào Mục đích: xác định lượng tế bào có 1ml huyễn dịch Cách tiến hành: Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl mơi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha lỗng 10 lần với 100µl trypan blue 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Dùng pipet hút lượng huyễn dịch tế bào sau nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào Đếm sô tế bào buồng đếm: Đếm tế bào góc, góc có 16 vng nhỏ, đếm số tế bào nằm khung 16 ô vuông nhỏ Đếm tế bào riêng lẻ đám tế bào Đếm theo hình zic zắc Đếm tế bào có kích thước tương đồng Không đếm tế bào chết bắt màu xanh, đếm tế bào sống Ước lượng số tế bào 1ml: số tế bào/1ml = (số tế bào đếm 4góc/4 )x x độ pha loãng tế bào x 104 Kết quả: Số tế bào BHK21 /1ml = (66/4) x2 x 105 = 3,3 106 cell Tổng số tế bào 20 ml huyễn dịch là: 66 106 cell Mỗi chai Rouxs cho 18.106 cell để sau ngày, tỷ lệ bám đáy 100% Vậy số ml huyễn dịch tế bào cho vào chai Rouxs 18 10 : 3,3 106 = 5,5 ml Bước 10: Ra chai ni Mục đích: Tiếp tục ni tế bào, để tế bào nhân lên Cách tiến hành: Hơ miệng chai Rouxs lửa đèn cồn Dùng pipet điện hút 90ml MEM10% cho vào chai Rouxs Dùng pipet lấy 5,5ml huyễn dịch cho vào chai nuôi Lắc nhẹ nhàng để tế bào trải khắp mặt đáy chai ni Đậy nắp cao su (khơng đóng chặt nắp chai) giấy bạc, chuyển vào tủ ấm CO2 Bước 11: Vệ sinh cabinet sau sử dụng Thu dọn rác, Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Bước 12: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tế bào tủ ấm 370C, 5% CO2 Hằng ngày quan sát tế bào phát triển đáy chai ni kính hiển vi soi ngược Nhận xét: Đã nắm thao tác trypsin tế bào từ chai T75 chai Rouxs Thao tác mật độ chai Rouxs chưa đều, chai mật độ thấp pipet hút không đủ lượng tế bào Nắp nút cao su chặt làm mơi trường trở nên kiềm tính. > Khắc phục: Mang chai Rouxs vào Cabinet vô trùng 30 phút, tiến hành nới lỏng nắp chai Thao tác cầm chai cho vào tủ ấm 5%CO2 không ý làm rơi rớt môi trường miệng chai, nắp giấy bạc Bảng theo dõi tế bào BHK21 nuôi chai Rouxs (1400610,BHK-21, P19) Ngày theo dõi Thao tác Mật độ Thời chai gian ni Tỉ lệ tế Tỷ lệ Hình bào tế bào bào bám chết đáy thái tế Màu môi trường 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT 10/06/ 2014 Trypsin 18.106 chai cell/chai Rouxs 11/06/ 2014 Quan sát tế bào 15h 12/06/ 2014 Quan sát tế bào 39h 13/06/ 2014 Quan sát tế bào 63h Môi trường đỏ hồng tím, Chai 1, 1-2% chai : 3540%, Chai 3: 20% Chai 1, 1-2% Chai 2: 6070% Chai 3: 40% Chai 1, 1-2% Chai 2: 9095% Chai 3: 5060% Tế bào hình Mơi ngắn, nhiều tế trường đỏ bào chết hồng tím, Tế bào hình thn dài, mượt, Chai có cụm tập trung nhiều tế bào Tế bào hình thn dài, mượt, chai có cụm tập trung nhiều tế bào Môi trường đỏ hồng, Môi trường đỏ hồng, Hà Nội, ngày 14 tháng 06 năm 2014 Người thực Trần Thị Nhuận ... gian trypsin tế bào BHK21( 140607, P18) chai phút, chai (140608, P18) phút Chú ý: Không lắc chai nuôi TB Bước 6: Trung hòa trypsin Mục đích: Dừng q trình trypsin Cách tiến hành: 140610 – Báo cáo thực. .. chết Cách tiến hành: 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21 – Nhuận TT Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường Chú ý: Cho đầu type xuống đáy chai, hút hết... 01 Chai Rouxs 03 Hộp type 5ml 01 Hộp type 200µl 01 Type thủy tinh10ml 05 Chai Rouxs 03 Hộp giâý lau 01 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Số lượng 140610 – Báo cáo thực hành bình Rouxs tế bào BHK21