BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC Họ tên sinh viên: Đào Thị Phương Lan Ngành: Dược Thú Y Niên khóa: 2004 – 2009 Tháng 09/2009 HẢO SÁT MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Escherichia coli PHÂN LẬP TỪ PHÂN GIA SÚC Tác giả ĐÀO THỊ PHƯƠNG LAN Khố luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ Thú Y chuyên ngành Dược Giáo viên hướng dẫn: TS VÕ THỊ TRÀ AN BSTY LÊ HỮU NGỌC i LỜI CẢM ƠN ™ Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM, ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi – Thú Y tồn thể thầy tạo điều kiện học tập truyền đạt kiến thức q báu cho tơi suốt thời gian khoá học ™ Em khắc ghi công ơn cô Võ Thị Trà An, người giáo viên tận tình dạy dỗ, hướng dẫn động viên em sống thời gian thực đề tài ™ Em chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc giúp đỡ, hướng dẫn, góp ý tạo điều kiện thật tốt để em hoàn thành đề tài ™ Em xin cảm ơn chị Bùi Thị Thu Trang anh Nguyễn Thanh Tùng truyền đạt kinh nghiệm giúp đỡ em thời gian qua ™ Xin cảm ơn đến bạn phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản Mơi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, em Minh Thành, chị Tuyền, bạn Trí Thức… an ủi giúp đỡ tơi nhiều ™ Để có ngày hơm nay, xin kính dâng lên ba mẹ lòng hiếu thảo lời Ba mẹ hy sinh chịu nhiều khổ cực Với con, ba mẹ người thầy dạy đứng lên sau lần vấp ngã người bạn lớn đời ™ Con thật may mắn có bên cạnh nhiều người quan tâm thương yêu bà Ngoại, bác Hát, chị hai… xin kính gửi người lời cảm ơn tình yêu thương ™ Và cuối cùng, xin cảm ơn đến tất bạn bè lớp Dược Y 30 Những người bên cạnh chia sẻ buồn vui, âu lo tơi Chúc cho tình cảm ln bền chặt đồn kết Đào Thị Phương Lan ii TÓM TẮT ĐỀ TÀI Đề tài ”Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân gia súc” tiến hành phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM thời gian từ tháng 05/2009 đến tháng 08/2009 Đề tài thực với mục đích góp phần cho việc chọn lựa liệu pháp điều trị kháng sinh số lồi gia súc (heo, bò) xây dựng sở liệu đề kháng kháng sinh lồi gia súc Tp Hồ Chí Minh tỉnh lân cận 100 gốc vi khuẩn phân lập từ phân gia súc (heo, bò) xác định độ mẫn cảm với 11 loại kháng sinh thử nghiệm phương pháp khuếch tán thạch Các gốc đề kháng với ceftazidime xác định emzyme β-lactamase phổ rộng phản ứng Double disc test AmpC disc test Kết thu sau: - Kháng sinh khả chống E coli (in vitro) ceftazidime, amoxicillin/clavulanic acid, norfloxacin với tỉ lệ gốc E.coli mẫn cảm 93%, 73% 66% - Các kháng sinh bị E coli đề kháng tetracycline, ampicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol với tỉ lệ đề kháng 77%, 70%, 69%, 60% - Các kháng sinh có tỉ lệ gốc E coli nhạy cảm trung gian cao bao gồm colistin (với 55% nhạy cảm trung gian 38% đề kháng), cephalexin (với 45% nhạy cảm trung gian 30% đề kháng); kanamycin (với 20% nhạy cảm trung gian 47% đề kháng), gentamicin (15% nhạy cảm trung gian 45% đề kháng) - Trong gốc vi khuẩn E coli đề kháng với ceftazidime, chúng tơi phát gốc (kí hiệu H5.2) có chứa enzyme β-lactamase phổ rộng Khơng tìm thấy gốc có chứa enzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình, biểu đồ viii CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược Escherichia coli 2.2 Những kiến thức kháng sinh 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Phân loại 2.3 Đề kháng kháng sinh 2.4 Biện pháp hạn chế đề kháng thuốc 2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh 2.6 Kháng sinh nhóm cephalosporin 2.7 Đề kháng với nhóm β-Lactam 12 2.8 Enzyme β-lactamase chất ức chế β-lactamase 13 2.8.1 Enzyme β-lactamase 13 2.8.2 Các chất ức chế β-lactamase 14 2.9 Các phương pháp khảo sát nhạy cảm vi khuẩn kháng sinh 15 2.9.1 Phương pháp định tính 15 2.9.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng 15 2.9.1.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh 16 2.9.2.3 Qui trình kiểm tra chất lượng 17 iv 2.9.2 Phương pháp định lượng 19 2.10 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 19 2.10.1 Trong nước 19 2.10.2 Ngoài nước 20 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 22 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.1.1 Thời gian 22 3.1.2 Địa điểm 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu 22 3.3.1 Đối tượng khảo sát 22 3.3.2 Thiết bị dụng cụ 24 3.3.3 Môi trường, hóa chất 24 3.4 Phương pháp tiến hành 25 3.4.1 Cách thực 25 3.4.2 Tăng sinh gốc vi khuẩn chuẩn bị làm kháng sinh đồ 26 3.4.3 Phương pháp kháng sinh đồ 29 3.4.4 Phản ứng xác định diện β–lactamse phổ rộng (Double Disc Test) 30 3.4.5 Phản ứng xác định diện β-lactamse phổ rộng nhóm AmpC 31 3.5 Chỉ tiêu theo dõi 31 3.6 Xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Xác định độ mẫn cảm gốc E coli với 11 loại kháng sinh thử nghiệm phương pháp kháng sinh đồ 32 4.2 Xác định emzyme β-lactamase phổ rộng gốc E coli phản ứng double disc test AmpC disc test 40 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 47 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ESLBL Extended-Spectrum Beta-Lactamase ATCC American Type Culture Collection BHI Brain Heart Infusion Broth EMB Agar Eosin Methylen Blue NA Nutrient Agar MHA Mueller – Hinton Agar MR Methyl Red VP Voges-Proskauer NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards PABA para-aminobenzoic acid PGA pteroylglutamic acid PBP penicillin binding protein vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc gốc vi khuẩn thu thập .23 Bảng 3.2: Nguồn gốc chủng vi khuẩn đối chứng .23 Bảng 4.1: Kết kháng sinh đồ chủng ATCC 25922 35218 32 Bảng 4.2: Kết kháng sinh đồ vi khuẩn E coli .34 Bảng 4.3: Tính nhạy cảm vi khuẩn E.coli theo nguồn gốc phân lập 39 Bảng 4.4: Kết phản ứng xác định enzyme β -lactamase phổ rộng 40 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Trang Hình Hình 2.1: cơng thức cấu tạo cephalosporin Hình 3.1: Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 24 Hình 3.2: Đĩa giấy tẩm loại kháng sinh .25 Hình 3.3: Khuẩn lạc tím ánh kim E coli mơi trường EMB 27 Hình 4: Kết phản ứng sinh hóa khuẩn E coli loại môi trường citrate (-), methyl red (+), Voges-Proskauer (-) 28 Hình 5: Khuẩn lạc E coli mọc môi trường thạch NA 28 Hình 3.6: Các kháng sinh đặt đĩa petri chứa mơi trường MHA .30 Hình 3.7: Phản ứng xác định enzyme β-lactamase phổ rộng 30 Hình 3.8: Phản ứng xác định enzyme β-lactamase nhóm AmpC 31 Hình 1: Vòng vô khuẩn vi khuẩn E coli với 11 loại kháng sinh đĩa MHA sau ủ 370C/ 24 33 Hình 4.2: Kết dương tính vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme βlactamase phổ rộng 41 Hình 4.3: Kết âm tính vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme βlactamase phổ rộng nhóm AmpC .42 Biểu đồ Biểu đồ 4.1: Tỉ lệ nhạy cảm E coli với loại kháng sinh .35 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ đề kháng E coli với loại kháng sinh 36 Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhạy cảm trung gian E coli với loại kháng sinh 38 viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Escherichia coli vi khuẩn cộng sinh chiếm ưu thế, tồn tự nhiên hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Tuy nhiên, có điều kiện thích hợp, số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng người gia súc, đặc biệt gia súc non Ngoài ra, E coli thải qua phân mơi trường bên ngồi dễ dàng trở thành ngun nhân gây nhiễm nước thực phẩm Khi có bệnh nhiễm trùng xảy kháng sinh ln nhắc đến phương pháp trị liệu đặc hiệu Để sử dụng kháng sinh có hiệu phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm, người sử dụng kháng sinh cần phải biết loại kháng sinh có mẫn cảm với chủng vi khuẩn gây bệnh hay không Muốn vậy, liệu nhạy cảm kháng sinh phải khảo sát áp dụng vi khuẩn gây bệnh cho ca bệnh khu vực địa lí Trong kháng sinh sử dụng cho gia súc gia cầm, kháng sinh nhóm βlactam, đặc biệt cephalosporin hệ III bắt đầu sử dụng rộng rãi Kháng sinh nhóm cephalosporin hệ III có phổ kháng khuẩn rộng vi khuẩn G+ G-, chúng lại có đặc tính dược động học tốt, dễ hấp thu phân bố khắp mô thể Việc đề kháng với kháng sinh nhóm chủng vi khuẩn gây khó khăn cơng tác điều trị Đặc biệt, vi khuẩn có khả sản sinh β-lactamase phổ rộng (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) chúng đề kháng với nhiều kháng sinh họ β-lactam Do đó, tầm sốt diện enzyme chủng vi khuẩn góp phần việc chọn lựa kháng sinh thích hợp cho điều trị Vì lí trên, chúng tơi tiến hành đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân gia súc” hướng dẫn TS Võ Thị Trà An, Bộ môn Nội Dược, Khoa CN-TY, giúp đỡ BSTY Lê Hữu Ngọc, Bộ môn Cơ Thể Ngoại Khoa, Khoa CN-TY Vi khuẩn E coli ATCC 25922 dùng vi khuẩn đối chứng kiểm tra mức độ nhạy cảm chất lượng đĩa kháng sinh Kết vòng vơ khuẩn loại kháng sinh chủng vi khuẩn nằm giới đường kính vòng vơ khuẩn chuẩn NCCLS (National Committee on Clinical Laboratory Standards) cung cấp Vi khuẩn E coli ATCC 35218 dùng vi khuẩn đối chứng kiểm tra mức độ nhạy cảm chất lượng đĩa kháng sinh chứa amoxicillin/clavulanic acid, chủng vi khuẩn có sản xuất enzyme β-lactamase, đường kính vòng vơ khuẩn vi khuẩn nằm giới hạn chuẩn Đây chủng vi khuẩn không gây bệnh Hình 4.1: Vòng vơ khuẩn vi khuẩn E coli với 11 loại kháng sinh đĩa MHA sau ủ 370C/ 24 Phản ứng kháng sinh đồ thực 100 gốc vi khuẩn thu thập (57 gốc phân lập từ phân heo, 27 gốc phân lập từ phân bò 16 gốc từ phân bê) với 11 loại kháng sinh Kết so sánh dựa chuẩn mực đường kính vòng vơ khuẩn cơng ty Nam Khoa cung cấp (phụ lục) Kết trình bày qua bảng 4.2 33 Bảng 4.2: Kết kháng sinh đồ vi khuẩn E coli Loại kháng sinh ampicillin (Am) amoxicillin/clavulanic Nhạy cảm Số lượng mẫu Số khảo sát lượng Tỉ lệ 100 21 21% Trung gian Số lượng Đề kháng 9% Số lượng 70 Tỉ lệ Tỉ lệ 70% 100 73 73% 11 11% 16 16% tetracycline (Te) 100 20 20% 3% 77 77% colistin (Co) 100 7% 55 55% 38 38% kanamycin (Kn) 100 33 33% 20 20% 47 47% gentamicin (Ge) 100 40 40% 15 15% 45 45% norfloxacin (Nr) 100 66 66% 23 23% 11 11% cephalexin (Cp) 100 25 25% 45 45% 30 30% 100 29 29% 2% 69 69% chloramphenicol (Cl) 100 34 34% 6% 60 60% ceftazidime (Cz) 100 93 93% 2% 5% acid (Ac) trimethoprim/ sulfamethoxazole (Bt) Qua bảng 4.2 nhận thấy 11 loại kháng sinh thử nghiệm, vi khuẩn E coli phân lập nhạy cảm cao với ceftazidime (93%), phối hợp amoxicillin/clavulanic acid (73%) norfloxacin (66%) Các loại kháng sinh lại, vi khuẩn khơng nhạy cảm cao với mức độ nhạy cảm là: gentamicin (40%), chloramphenicol (34%), kanamycin (33%), phối hợp kháng sinh trimethoprim/sulfamethoxazole (29%), cephalexin (25%), ampicilin (21%), tetracycline (20%) cuối colistin (7%) Kết cho thấy khơng có loại kháng sinh nào, vi khuẩn E coli có mức độ nhạy cảm hồn tồn (100%) Đa số loại kháng sinh (8/11 loại) có mức độ nhạy cảm E coli 50% Các kháng sinh nhóm mức độ nhạy cảm E coli tương đương ví dụ, kanamycin (33%) gentamicin (40%) Điều giải thích kháng sinh có chế tác động E coli có chế đề kháng với loại kháng sinh đề kháng với loại kháng sinh nhóm Có thể khắc phục nhược điểm cách phối hợp loại 34 kháng sinh nhóm khác với mục đích vừa mở rộng phổ kháng khuẩn, vừa làm giảm nguy ngộ độc thể, vừa làm giảm nguy kháng thuốc Điều dễ dàng nhận thấy qua công thức phối hợp kháng sinh nhóm β-lactam chất ức chế emzyne β-lactamase (amoxicillin/clavulanic acid) tính nhạy cảm E coli (73%) cao nhiều lần so với kháng sinh khác thuộc nhóm βlactam ampicillin (21%) Tính nhạy cảm E coli kháng sinh không cao, chí kể ceftazidime kháng sinh hệ khơng có nhạy cảm hồn tồn Điều hồn tồn xảy ra, số nghiên cứu gần giới vi khuẩn E coli khơng nhạy cảm cao với loại kháng sinh thông dụng kể kháng sinh hệ Như nghiên cứu Okesola Makanjuola (2009) Nigeria vi khuẩn E coli nhạy cảm với ceftazidime mức 65,6%, 62,5% với ceftriaxone 71,9% với cefotaxime Còn số kháng sinh thông thường khác gentamicin, amoxicillin/clavulanic acid, ciprofloxacin mức độ mẫn cảm E coli 50%, 37,5% 65,6% Tỉ lệ (%) 100 93 90 80 73 66 70 60 50 40 40 30 33 21 20 29 25 34 20 10 Am Te Co Kn Ge Nr Cp Ac Bt Cl Cz Biểu đồ 4.1: Tính nhạy cảm E coli với loại kháng sinh 35 Kháng sinh Biểu đồ 4.1 cho thấy cụ thể tỉ lệ nhạy cảm gốc E coli phân lập với 11 loại kháng sinh khảo sát Tỉ lệ nhạy cảm E coli ceftazidime 93%, tỉ lệ thấp so với nghiên cứu Nguyễn Hoàng Thanh (2009) 100% Đối với kháng sinh amoxicillin/clavulanic acid, tỉ lệ nhạy cảm E coli 73%, thấp so với nghiên cứu Nguyễn Hoàng Thanh (2009) 96,97%, Nguyễn Thị Trúc Ly (2006) 90,35%, Trần Thị Kiều Oanh (2006) 89,16%, Khổng Quang vũ (2006) 100% Kháng sinh norfloxacin có mức độ nhạy cảm E coli 66%, thấp nghiên cứu Nguyễn Hoàng Thanh (2009) 96,97% 83% nghiên cứu Trần Sỹ Trung (2000) Sự chênh lệch do: (1) gốc E coli phân lập từ nguồn mẫu khác (phân tiêu chảy, phân bình thường…) (2) Các gốc E coli nghiên cứu phân lập từ nhiều lồi gia súc (heo, bò, bê) khơng loài thú cụ thể nghiên cứu trước (3) Các gốc E coli phân lập từ vùng địa lý khác nhau, việc sử dụng kháng sinh phòng trị bệnh nhiễm khuẩn khơng giống dẫn đến thích nghi khác quần thể vi sinh vật (4) Thời gian phân lập mẫu khác Tỉ lệ (%) 90 80 70 77 70 69 60 60 47 50 45 38 40 30 30 16 20 11 10 Am Te Co Kn Ge Nr Cp Ac Bt Cl Cz Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ đề kháng E coli với loại kháng sinh 36 Kháng sinh Biểu đồ 4.2 trình bày mức độ đề kháng vi khuẩn E coli phân lập từ phân gia súc loại kháng sinh Vi khuẩn E coli đề kháng cao với loại kháng sinh: tetracycline (77%), ampicillin (70%), trimethoprim/sulfamethoxazole (69%), chloramphenicol (60%) Đề kháng mức trung bình thấp kháng sinh: kanamycin (47%), gentamicin (45%), colistin (38%), cephalexin (30%) Các kháng sinh lại mức đề kháng vi khuẩn không đáng kể Tỉ lệ đề kháng E coli với chloramphenicol 60%, chênh lệch đáng kể so với nghiên cứu trước: 62,5% Trần Sỹ Trung (2000), 69,3% Huỳnh Cơng Tuấn (2000) 51,52% Nguyễn Hồng Thanh (2009) E coli đề kháng với ampicillin 70%, khơng có chênh lệnh cao so với Nguyễn Hồng Thanh (2009) 65,15%, Huỳnh Công Tuấn (2000) 82,2% Kháng sinh có tỉ lệ đề kháng E coli cao tetracycline (77%) thấp so với kết Nguyễn Hồng Thanh (2009), 86,36%, Huỳnh Cơng Tuấn (2000) 96,8% 100% Khổng Quang Vũ (2000) Tuy nhiên, tất nghiên cứu cho kết tetracycline kháng sinh bị E coli đề kháng mạnh Đối với trimethoprim/sulfamethoxazole, E coli đề kháng 69% Kết tương đương với nghiên cứu Nguyễn Hoàng Thanh (2009) 68,18%, thấp so với 80,01% Trần Sỹ Trung (2000) Hai kháng sinh khác thuộc nhóm aminoglycoside có tỉ lệ đề kháng cao gentamicin (45%) kanamycin (47%) Tỉ lệ đề kháng E coli với gentamicin cao so với 21,21% Nguyễn Hoàng Thanh (2009) chênh lệch không cao so với 41,9% Huỳnh Công Tuấn (2000) 50% Trần Sỹ Trung (2000) Vi khuẩn E coli đề kháng với kanamycin 47%, cao kết Khổng Quang Vũ (2000) 35,2% Huỳnh Công Tuấn (2000) 27,4% Sự đề kháng vi khuẩn E coli loại kháng sinh tetracycline, ampicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol, gentamicin kanamycin kháng sinh sử dụng lâu dài chăn nuôi gia súc nên vi khuẩn trở nên đề kháng Ngồi ra, gốc E coli khác phân lập từ nguồn khác có đề kháng khác loại kháng sinh Muốn biết rõ nguyên nhân, tác động làm cho vi khuẩn kháng 37 thuốc, cần có nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu phát gen độc lực gen qui định đề kháng Ví dụ dùng kỹ thuật multiplex PCR để phát số gen độc lực (stx1, stx2, eae, hlyA…) vi khuẩn E coli phân heo, bò nghiên cứu Nguyễn Ngọc Tuân cộng tác viên (2005) Tỉ lệ (%) 60 55 50 45 40 30 23 20 20 15 11 10 Am Te Co Kn Ge Nr Cp Ac Bt Cl Cz Kháng sinh Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhạy cảm trung gian E coli với loại kháng sinh Biểu đồ 4.3 trình bày tỉ lệ nhạy cảm với kháng sinh E coli mức trung gian không đáng kể, đa số thấp 20% Chỉ có hai loại kháng sinh có mức nhạy cảm trung gian cao colistin (55%) cephalexin (45%) Trong thực tế, tỉ lệ nhạy cảm trung gian cao hiệu tĩnh khuẩn kháng sinh giảm Nghĩa vi khuẩn không bị tiêu diệt dùng liều điều trị thông thường, dùng liều cao đường toàn thân đường miễn kháng sinh tập trung vào ổ nhiễm khuẩn kháng sinh có tác dụng vi khuẩn (Trần Thị Thu Hằng, 2003) Do sử dụng kháng sinh thời gian dài, tình trạng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh điều khơng tránh khỏi Nhìn chung, tính nhạy cảm gốc E coli thay đổi loại kháng sinh thử nghiệm Mức độ nhạy cảm vi khuẩn phụ thuộc vào chất vi sinh vật (khả biến chủng), nồng độ, chất kháng sinh, thời gian sử dụng, chế tác dụng kháng sinh Tóm lại phụ thuộc vào cách sử dụng kháng sinh 38 phòng trị bệnh nhiễm khuẩn Điều thay đổi gốc E coli phân lập từ nguồn khác Do chúng tơi tiến hành phân tích mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn E coli theo nguồn gốc phân lập Kết trình bày qua bảng 4.3 Bảng 4.3: Tính nhạy cảm vi khuẩn E coli theo nguồn gốc phân lập Kháng sinh Mức độ nhạy cảm vi khuẩn E coli (số lượng và%) Phân heo (n = 57) Phân bò (n = 43) Am (8,77%) 16 (37,21%) Te (3,51%) 18 (41,86%) Co (7,02%) (6,98%) Kn (15,79%) 24 (55,81%) Ge 12 (21,05%) 28 (65,12%) Nr 26 (45,61%) 40 (93,02%) Cp 13 (22,81%) 12 (27,91%) Ac 37 (64,91%) 36 (83,72%) Bt (8,77%) 24 (55,81%) Cl (10,53%) 28 (65,12%) Cz 50 (87,72%) 43 (100%) Qua bảng 4.3 thấy tính nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ phân bò cao so với gốc vi khuẩn E coli phân lập từ phân heo Hầu hết tỉ lệ nhạy cảm với kháng sinh gốc vi khuẩn E coli phân lập từ phân heo thấp 20% tỉ lệ vi khuẩn E coli phân lập từ phân bò lớn 30% Sự chênh lệch đặc tính bệnh lý khác lồi thú dẫn đến thích nghi khác quần thể vi khuẩn, ví dụ heo dễ bị tiêu chảy giai đoạn theo mẹ cai sữa, heo bị bệnh hô hấp giai đoạn ni thịt Do việc sử dụng kháng sinh để điều trị trở nên thường xuyên Nghiên cứu Võ Thị Trà An cộng (2006) cho thấy đối tượng vật ni có áp lực sử dụng kháng sinh nhiều heo, gà đề kháng Salmonella phân lập từ chúng cao so với bò 39 4.2 Xác định emzyme β-lactamase phổ rộng gốc E coli phản ứng double disc test AmpC disc test Sau xác định nhạy cảm 100 gốc E coli với 11 loại kháng sinh, có gốc xuất đề kháng với ceftazidime Các gốc đề kháng phân lập từ phân heo trại heo tư nhân tỉnh Tiền Giang Tiến hành xác định diện emzyme β-lactamase phổ rộng gốc gốc đối chứng E1, E3 Đây loại emzyme giúp vi khuẩn đề kháng với hầu hết kháng sinh họ β-lactam Kết phản ứng trình bày qua bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết phản ứng xác định enzyme β -lactamase phổ rộng Kí hiệu gốc vi khuẩn Nguồn gốc E coli E1 Dịch mủ ngựa E3 Nơi phân lập Ngày phân lập Double disc test AmpC test Hà Lan 11/2003 + - Dịch khớp ngựa Hà Lan 05/2004 + - H3.4T Phân heo bình thường Tiền Giang 06/2006 - - H5.2 Tiền Giang 06/2006 + - H1.3 Phân heo theo mẹ tiêu chảy Phân heo tiêu chảy Tiền Giang 06/2006 - - 843 Phân heo tiêu chảy Tiền Giang 12/2008 - - 464 Phân heo tiêu chảy Tiền Giang 11/2008 - - Chủng E coli E1 E3 phân lập từ ngựa cho kết dương tính với Double disc test âm tính với AmpC disc test (Võ Thị Trà An, 2007) Gốc E coli có kí hiệu H5.2 phân lập từ phân heo theo mẹ bị tiêu chảy cho kết dương tính với Double disc test Điều có nghĩa gốc vi khuẩn có diện emzyme β-lactamase phổ rộng Gốc vi khuẩn đề kháng với 11 loại kháng sinh thử nghiệm (ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, tetracycline, colistin, gentamicin, kanamycin, norfloxacin, cephalexin, chloramphenicol, trimethoprim/sulfamethoxazole, ceftazidime) Theo số nghiên cứu gần emzyme β-lactamase phổ rộng có chủng E coli phân lập từ nhiều nguồn khác Theo nghiên cứu Neelam Taneja cộng (2006), Ấn độ có 31 chủng E coli xác định có diện emzyme βlactamase phổ rộng 77 chủng E coli phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiểu 40 người Emzyme β-lactamase phổ rộng tìm thấy nhiều vi khuẩn khác phân lập từ thú như: Klebsiella pneumoniae (Võ Thị Trà An, 2007), Pseudomonas aeruginosa (Neelam Taneja cộng sự, 2006) ceftazidime cefotaxime Clavulanic acid Hình 4.2: Kết dương tính vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme β-lactamase phổ rộng Cả gốc khảo sát cho kết âm tính với phản ứng xác định enzyme βlactamase phổ rộng nhóm AmpC Tuy nhiên emzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC xác định có vi khuẩn E coli số nghiên cứu gần Black ctv (2005) phát 44 chủng vi khuẩn (bao gồm K pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp, E coli P mirabilis) có diện emzyme βlactamase phổ rộng nhóm AmpC 100 chủng vi khuẩn khảo sát đạt tỉ lệ 31% Nghiên cứu Võ Thị Trà An (2007) xác định enzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC chủng E coli chủng vi khuẩn E coli phân lập từ ngựa Điều cho thấy diện emzyme β-lactamase nhóm AmpC vi khuẩn E coli hồn tồn xảy Có thể khảo sát thí nghiệm mức độ ngẫu nhiên gốc vi khuẩn nên chưa phát enzyme 41 cefoxitin Tris-EDTA Hình 4.3: Kết âm tính vi khuẩn E coli với phản ứng xác định enzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC Sự diện emzyme β-lactamase phổ rộng emzyme β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC lồi vi sinh vật nói chung vi khuẩn E coli nói riêng vấn đề quan trọng thú y Thông thường đề kháng cephalosporin hệ vi khuẩn phụ thuộc vào sản xuất β-lactamase phổ rộng β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC Có mang β-lactamase phổ rộng cho nguyên nhân gây đề kháng với penicillin, cephalosporin hệ I, II, III aztreonam (nhưng không đề kháng với cephamycin carbapenem) thường bị hạn chế chất ức chế β-lactamase clavulanic acid β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC có phổ đề kháng rộng (cả cephamycin) không bị phá vỡ chất ức chế β-lactamase thông thường (Võ Thị Trà An, 2007) Các nghiên cứu gần xác định diện emzyme βlactamase phổ rộng β-lactamase phổ rộng nhóm AmpC vi sinh vật phân lập từ nhiều loài thú gà, ngựa heo… vi sinh vật phân lập từ nhiễm trùng người (Neelam Taneja cộng (2006), Black cộng (2005)) Điều cho thấy enzyme β-lactamase phổ rộng vi khuẩn ảnh hưởng đến sức khoẻ thú nuôi mà ảnh hưởng đến người tiếp xúc với chúng Vì việc phát triển nghiên cứu vấn đề cần thiết Ngoài nên ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để hiểu rõ gen kháng thuốc 42 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian thực nghiên cứu mức độ mẫn cảm 11 loại kháng sinh với 100 gốc vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân gia súc, rút số kết luận sau: - Kháng sinh khả chống E coli (in vitro) ceftazidime, amoxicillin/clavulanic acid, norfloxacin - Các kháng sinh bị E coli đề kháng tetracycline, ampicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol - Các kháng sinh có nhạy cảm trung gian cao với E coli bao gồm colistin, cephalexin, kanamycin, gentamicin - Trong gốc vi khuẩn E coli đề kháng với ceftazidime phát gốc (kí hiệu H5.2) có chứa enzyme β-lactamase phổ rộng khơng tìm thấy gốc có chứa enzyme β-lactamase nhóm AmpC Tồn đề tài: thời gian thu thập gốc vi khuẩn khơng dài, số lượng gốc thu thập nên đánh giá hạn chế chưa phát gốc vi khuẩn cho phản ứng dương tính với phản ứng xác định enzyme β-lactamase nhóm AmpC 5.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhạy cảm E coli với kháng sinh giúp đưa phác đồ kháng sinh điều trị hợp lý cho trại Bên cạnh đó, cần nghiên cứu khả điều trị bệnh nhiễm trùng E coli kháng sinh lâm sàng Áp dụng Double disc test AmpC disc test để sàng lọc vi khuẩn có enzyme β-lactamase phổ rộng enzyme β-lactamase nhóm AmpC giúp định hướng sử dụng kháng sinh Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử giúp hiểu rõ gen kháng thuốc chế kháng thuốc vi khuẩn 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Võ Thị Trà An, 2007 Kháng sinh cho vật nuôi Nhà xuất Đà Nẵng 184 trang Tơ Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Đại học Nông Lâm Tp HCM 129 trang Trần Thị Thu Hằng, 2003 Dược lực học Tái lần thứ 738 trang Nguyễn Thị Trúc Ly, 2006 Khảo sát vi khuẩn E coli heo theo mẹ bị tiêu chảy tính nhạy cảm chúng với số loại kháng sinh thường dùng Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Trần Thị Kiều Oanh, 2006 Phân lập giám định vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy heo sau cai sữa Thử khả nhạy cảm chúng số kháng sinh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Huỳnh Thị Ngọc Phương, 2008 Bài giảng hóa dược Đại học Nơng Lâm Tp HCM 70 trang Nguyễn Hoàng Thanh, 2009 Phân lập, kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn E coli từ quầy thịt heo số sở giết mổ địa bàn Tp HCM Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Thị Thanh Hồ Huỳnh Quang Trí, 2000 Sử dụng kháng sinh hồi sức ngoại khoa Trang 87 – 107 Trần Sỹ Trung, 2000 Phân lập giám định nguồn Escherichia coli heo theo mẹ tiêu chảy thử khả nhạy cảm chúng số kháng sinh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM 10 Huỳnh Công Tuấn, 2000 Phân lập giám định vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy heo cai sữa Thử khả nhạy cảm chúng với số kháng sinh Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM 11 Nguyễn Ngọc Tuân cộng tác viên, 2005 Phát số gen độc lực E coli phân bò, heo kỹ thuật multiplex-PCR Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y, số 5: 18 – 25 12 Khổng Quang Vũ, 2006 Tìm hiểu khả đề kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli phân lập heo theo mẹ heo cai sữa Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm Tp HCM 44 13 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn; Cục Thú Y Danh mục thuốc thú y phép lưu hành Việt Nam Tháng 3/2009 14 Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thơn Danh mục thuốc, hố chất bị hạn chế sử dụng thú y, ban hành kèm thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009 Tài liệu tiếng nước 14 Black J.A., Moland E.S, and Thomson K.S., 2005 AmpC Disk Test for Detection of Plasmid-Mediated AmpC-lactamases in Enterobacteriaceae Lacking Chromosomal AmpC-lactamases Journal of clinical microbiology 43 (7): 3110-3113 15 Neelam Taneja, Pooja Rao, Jitender Arora, Ashok Dogra, 2006 Occurrence of ESBL & AmpC-lactamases & susceptibility to newer antimicrobial agents in complicated UTI Indian J Med Res 127: 85-88 16 Okesola A.O and Makanjuola O., 2009 Resistance to Third-Generation Cephalosporins and Other Antibiotics by Enterobacteriaceae in Western Nigeria American Journal of Infectious Diseases (1): 17-20 17 Quin PJ, Carter ME, Markey B, Carter G R., 1998 Clinical veterinary microbiology Wolfe, London Page 95 – 117 18 Vo T.T.A., 2007 Antibiotic resistance in Salmonella PhD Thesis Utrecht University The Netherlands 160 page 19 Vo T.T.A., Van Duijkeren E., Fluit A.C., Gaastra W., 2007 Characteristis of extended -spectrum cephalosporin – resistant Enterobacteria isolate from animal Verterinary Microbiology 124:248-55 20 Vo T.T.A., Van Duijkeren E., Fluit A.C., Gaastra W., 2006 Antibiotic resistance, intergrons and Genomic Island SGI1 among non-typhoid Samonella serovar in the Netherlands Int J Antimicrob Agents 28: 172- 179 45 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các chuẩn mực đường kính vòng vơ khuẩn theo NCCLS (nguồn: Công ty Nam Khoa) Đĩa kháng sinh Ký hiệu Đường kính vòng vơ khuẩn đo Hàm lượng mm đường tròn Kháng Trung gian Nhạy ampicillin Am 10 µg ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 amoxicillin/clavulanic acid Ac 20/10 µg ≤ 13 14 - 17 ≥ 18 cephalexin Cp 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 ceftazidime Cz 30 µg ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 gentamicin Ge 10 µg ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 kanamycin Kn 30 µg ≤ 13 14 - 17 ≥ 18 tetracycline Te 30 µg ≤ 14 15- 18 ≥ 19 norfloxacin Nr 10 µg ≤ 12 13 - 16 ≥ 21 trimethoprim/sulfamethoxazole Bt 1.25/23.75 µg ≤ 10 11 - 16 ≥ 16 chloramphenicol Cl 30 µg ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 ceftazidime Cz 30 µg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 colistin Co 30 µg ≤8 - 10 ≥ 11 Phụ lục 2: Thành phần số môi trường nuôi cấy E coli EMB Agar (Eosin methylen blue) Peptic digest of animal tissue 10 g/l Dipotassium phosphate g/l Lactose g/l Sucrose g/l Eosin-Y 0,4 g/l Methylene blue 0.065 g/l Agar 13,5 g/l pH cuối (250C) = 7,2 ± 0,2 46 NA (Nutrient Agar) Pancreatic Digest of Gelatin g/l Beff Extract g/l Agar 15 g/l pH cuối (250C) = 6,8 ± 0,2 MHA (Muller Hinton Agar) Beef, infusion from 300 g/l Casein acid hydrosate 17,5 g/l Starch 1,5 g/l Agar 17 g/l pH cuối (250C) = 7,3 ± 0,2 BHI (Brain Heart Infusion Broth) Calf brain, infusion from 200 g/l Beef, infusion from 250 g/l Proteose peptone 10 g/l Dextrose g/l Sodium chloride g/l Disodium phosphate 2,5 g/l pH cuối (250C) = 7,4 ± 0,2 Simmon citrate agar Magnesium sulphate 0,2 g/l Ammonium dihydrogen phosphate g/l Dipotassium phosphate g/l Sodium chloride g/l Bromo thymol blue 0,08 g/l Agar 15 g/l pH cuối (250C) = 6,8 ± 0,2 Clark Lubs (MR-VP) Buffered peptone g/l Dextrose g/l Dipotassium phosphate 1,5 g/l 47 ... đến biến dưỡng acid amin purin Do thi u PABA gây thi u purin, acid nucleic Điều giải thích vi khuẩn tự tổng hợp PABA đề kháng với sulfonamide thymin, purin, methionin, số acid amin khác lại đối... enzyme thay PBP liên quan đến đề kháng với methicillin Staphylococci, Streptococcus pneumoniae Cả methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis... hai chất không cần thi t Cephalosporin: - Staphylococcus thường nhạy cảm với cephalosporin trừ chủng đề kháng methicillin; nên báo cáo đề kháng phát - Đĩa kháng sinh cephalothin kết cho cefaclor,