BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella Họ tên sinh viên : ĐẶNG THỊ LÊ HÂN Ngành : DƯỢC THÚ Y Niên khóa : 2004-2009 i Tháng 9/2009 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella ĐẶNG THỊ LÊ HÂN Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp bác sĩ thú y chuyên ngành Dược thú y Giáo viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI ii Tháng 9/2009 LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình hướng dẫn truyền đạt cho nhiều kiến thức quý báu trình thực đề tài Tơi xin chân thành cám ơn cô Nguyễn Thị Thu Năm – giảng viên môn Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y trường Đại học Nơng Lâm giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt đề tài Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cha mẹ tôi, người động viên, quan tâm, chăm sóc, tạo điều kiện tốt cho tơi học tập hồn thành đề tài Chân thành cám ơn bạn Lâm, Hải, Thảo, Nhân, Dung, Trâm, T Vân, K Vân giúp đỡ động viên tơi q trình làm đề tài Đặng Thị Lê Hân iii TĨM TẮT Đề tài « ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella » thực vòng tháng (từ 2/2009 – 6/2009) nhằm mục đích đánh giá khả đối kháng Bacillus subtilis loài vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella Phương pháp nghiên cứu Phân lập định danh Bacillus subtilis Kháng sinh đồ khuyếch tán thạch Kết thu Bacillus subtilis phân lập từ đất Phần lớn chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất thể khả đối kháng chống lại Staphylococcus aureus (21/24 chủng), số chủng phân lập có khả đối kháng với Escherichia coli (11/24 chủng) Salmonella (5/24 chủng) Các chủng Bacillus subtilis kiểm tra thể khả đối kháng mạnh với Staphylococcus aureus khả yếu Escherichia coli Salmonella Tác động kháng khuẩn Bacillus subtilis chịu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, tác động mạnh Bacillus subtilis trải qua 24 nuôi cấy giảm dần 36 48 nuôi cấy Sự diện vi khuẩn khác đóng vai trị yếu tố dẫn dụ cho sản xuất hợp chất kháng khuẩn Bacillus subtilis iv MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN…… …………………………………………………… ……….i TÓM TẮT……………………………………………………………………… ii MỤC LỤC………………………………………………………………… … iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………….vi DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………….vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .ix DANH MỤC SƠ ĐỒ…………………………………………………………… x DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………… xi Chương PHẦN MỞ ĐẦU…………………………………………………… 1.1 Đặt vấn đề…………………………………………………………………… 1.2 Nội dung đề tài……………………………………………………………1 1.3 Mục tiêu đề tài…………………………………………………………….2 Chương TỔNG QUAN……………………………………………………… 2.1 Sơ lược Bacillus subtilis………………………………………………… 2.1.1 Lịch sử………………………………………………………………………3 2.1.2 Đặc điểm phân loại………………………………………………………….3 2.1.3 Đặc điểm phân bố………………………………………………………… 2.1.4 Đặc điểm hình thái………………………………………………………… 2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy………………………………………………………… 2.1.6 Kháng sinh Bacillus subtilis tổng hợp………………………………… 2.1.7 Tính đối kháng Bacillus subtilis……………………………………… v 2.1.8 Ứng dụng Bacillus subtilis…………………………………………… 2.2 Sơ lược Staphylococcus aureus………………………………………… 11 2.2.1 Đặc điểm hình thái…………………………………………………………11 2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………12 2.2.3 Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus chế tác động chúng…………………………………………………………………………… 12 2.3 Sơ lược Escherichia coli………………………………………………….13 2.3.1 Tổng quan………………………………………………………………….13 2.3.2 Đặc điểm hình thái…………………………………………………………13 2.3.3 Đặc điểm ni cấy…………………………………………………………13 2.3.4 Khả gây bệnh……………………………………………………… 13 2.4 Sơ lược Salmonella……………………………………………………….14 2.4.1 Đặc điểm hình thái…………………………………………………………14 2.4.2 Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………14 2.4.3 Khả gây bệnh Salmonella……………………………………….15 Chương VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM……………………………………………………………………… 16 3.1 Thời gian địa điểm thực hiện…………………………………………… 16 3.2 Vật liệu thí nghiệm………………………………………………………… 16 3.2.1 Đối tượng khảo sát…………………………………………………………16 3.2.2 Dụng cụ - Thiết bị………………………………………………………….16 3.2.3 Môi trường nuôi cấy……………………………………………………….16 3.3 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………17 vi 3.4 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………….17 3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất………………………………….17 3.4.2 Đánh giá khả đối kháng Bacillus subtilis Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella………………………………………… 19 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………… 26 4.1 Kết phân lập Bacillus subtilis……………………………………………26 4.2 Kết thí nghiệm 1…………………………………………………………28 4.3 Kết thí nghiệm 2…………………………………………………………33 4.4 Kết thí nghiệm 3…………………………………………………………38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………40 5.1 Kết luận………………………………………………………………………40 5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….41 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………42 PHỤ LỤC……………………………………………………………………… 44 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony forming unit TSST-1: Toxine Responsable du Choc toxique CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité ETEC: Escherichia coli enterotoxinogene EPEC: Escherichia coli enteropathogene EIEC: Escherichia coli enteroinvasif EHEC: Escherichia coli enterohemorragique LT: Toxine thermolabile ST: Toxine thermostable TSA: Tryptone Soya Agar TSB: Tryptone Soya Broth NB: Nutrition Broth d: Diamètre de zones d’inhibitrice C: Concentration t: Temps viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Phân loại Bacillus subtilis Bảng 3.1: Các phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát tính kháng vi khuẩn kiểm nghiệm dịch canh nuôi cấy chung B subtilis vi khuẩn kiểm nghiệm Bảng 4.1: Kết phân lập B subtilis từ đất Bảng 4.2: Kết thí nghiệm đánh giá khả đối kháng thạch Bacillus subtilis chống lại Staphylococcus aureus Bảng 4.3: Kết thí nghiệm đánh giả khả đối kháng thạch Bacillus subtilis chống lại Escherichia coli Bảng 4.4: Kết thí nghiệm đánh giá khả đối kháng thạch Bacillus subtilis chống lại Salmonella Bảng 4.5: Tác động kháng khuẩn thạch Bacillus subtilis vi khuẩn kiểm nghiệm theo thời gian Bảng 4.6: Tác động kháng khuẩn thạch Bacillus subtilis vi khuẩn kiểm nghiệm Bảng 4.7: Đường kính vịng vơ khuẩn tạo theo thời gian dịch canh ly tâm Bacillus subtilis thạch phết Staphylococcus aureus Bảng 4.8: Đường kính vịng vơ khuẩn tạo theo thời gian dịch canh ly tâm Bacillus subtilis thạch phết Escherichia coli Bảng 4.9: Đường kính vịng vơ khuẩn tạo theo thời gian dịch canh ly tâm Bacillus subtilis thạch phết Salmonella ix Bảng 4.10: Tác động kháng khuẩn dịch canh khuẩn ly tâm Bacillus subtilis vi khuẩn kiểm nghiệm Bảng 4.11: Tác động đối kháng Staphylococcus aureus dịch canh khuẩn ly tâm nuôi cấy chung B subtilis Staphylococcus aureus Bảng 4.12: Tác động đối kháng E coli dịch canh khuẩn ly tâm nuôi cấy chung B subtilis E coli x 5.2 ĐỀ NGHỊ (1) Đánh giá tác động Bacillus subtilis lên vi khuẩn gây bệnh khác để có thêm hiểu biết phổ kháng khuẩn Bacillus subtilis (2) Tìm kiếm đánh giá điều kiện thuận lợi (như môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH…) cho khả kháng khuẩn Bacillus subtilis nói chung cho tiết kháng sinh B subtilis nói riêng (3) Xác định thành phần hàm lượng kháng sinh tiết Bacillus subtilis thời điểm khác (4) Thực nghiên cứu in vivo để đánh giá khả kháng khuẩn B subtilis lâm sàng 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đặng Ngọc Phương Uyên [2007] Phân lập Bacillus subtilis từ đất nghiên cứu tác động kháng khuẩn chống lại Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo Nguyễn Thanh Thủy [2007] Nuôi cấy Bacillus subtilis, thu alpha-amilase ứng dụng sản xuất Dextrine Nguyễn Quỳnh Nam [2006] Phân lập Bacillus subtilis từ phân heo đánh giá tác động kháng khuẩn chống lại Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy heo Tài liu nc ngoi Aicha Mhammedi, Franỗoise Peypoux, Franỗoise Besson et Georges Michel [1982] Baillomycin F, a new antibiotic of inturin group: isolation and characterization Al-Ajlani, Sheikh, Ahmad, Hasnain [2007] Production of surfactin from Bacillus subtilis MZ-7 grown on pharmamedia commercial medium Antoine Danchin , Frank Kunst, Dusko Ehrlich [1997] Le génome de Bacillus subtilis entièrement sequencé Babasaki, K., T Takao, Y Shimonishi et K Kurahashi [1985] Subtilosin A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168 : isolation, structureal analysis and biogenesis B Peiffer [1999] Toxi-infections alimentaires (intoxination) Staphylocoques Bushra Jamil, Fariha Hasan, A Hameed, Safia Ahmed [2006] Isolation of Bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production, Publisher dans Pak J Pharm Sci., 2007, Vol 20(1) 26-31 B Zouatni (Institut national d’hygiène) Antibiogramme réalisation Josienita Borlongan (www.ehow.com) How bacteria multiply ? J.Tournut [1989] Introduction générale sur les probiotiques Que doit on savoir? 10 Kenneth Todar [2008] Gram-positive, Aerobic or Facultative Endospore-forming Bacteria (formerly, "The Genus Bacillus") 11 Keneth Todar [2005] Salmonella and salmonellosis 12 Keneth Todar [2008] Staphylococcus aureus and staphylococcal disease 13 Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger, Winn [1997] Color Atlats and Textbook of Diagnostic Microbiology 14 Marchal, Bourdon, Richard Les milieux de culture pour l’isolement et l’identification biochique des bactéries 15 Monica Boirivant et Warren Strober [2007] The Mechanism of Action of Probiotics 16 Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu, Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa et Kozo Ochi [2001] Bacilysocin,,a novel phospholipids antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 17 P Courvalin, F.Goldstein, A.Philippon, J.Sirot [1985] L’antibiogramme 18 Paik, S H., A Chakicheria et J N Hansen [1998] Identification and characterization of the structural and transporter genes for, and the chemical and biological properties of, sublancin 168, a novel antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 19 Pierre Raibaud Jean–Pierre Raynaud [1989] Écologie de flore microbienne du tractus gastro-intestinal et generalites sur le mode d’action des probiotiques 20 Zuber, Nakano et Marahiel [1993] Peptide antibiotics PHỤ LỤC I THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 56 I.1 Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) - Soy peptone 15g - Tryptone peptone 5g - NaCl 5g - Agar 18g - Nước cất 1000ml - pH 7,1 – 7,5 I.2 Môi trường Trypticase Soya Broth (TSB) - Soy peptone 15g - Tryptone peptone 5g - NaCl 5g - Nước cất 1000ml - pH 7,1 – 7,5 I.3 Môi trường Eosil Methylen Blue Agar (EMB) - Lactose 10g - Peptone 10g - Dipotassium 2g - Agar 13.5g - Methylen Blue 0.065g - Nước cất 1000ml - pH 7.2 - Tiệt trùng 121oC/ 20 phút I.4 Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) - Chiết thịt bò 1.0g - Casein 5.0g - Peptone 5.0g - NaCl 75.0g - D Mannitol 10g 57 - Phenol Red 0.025g - Agar 15g - Nước cất 1000ml - pH 7.4 ± 0.2 - Tiệt trùng 121oC/ 15 phút I.5 Môi trường Bismuth Sulfite Agar (BSA) - Peptone 10g - Chiết thịt bò 5g - Glucose 5g - Na2HPO4 4g - FeSO4 0.3g - Bismuth sulfite 8g - Brillant Green 0.025g - Agar 15g - Nước cất 1000ml - pH 7.6 ± 0.2 Môi trường không khử trùng, đun sôi đổ đĩa II CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 2.1 Phản ứng catalase ** Chuẩn bị: - Dung dịch H2O2 30% - Lame - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết phết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: có tượng sủi bọt - Phản ứng âm tính: khơng có tượng sủi bọt 58 2.2 Phản ứng lecithinase ** Chuẩn bị: - Môi trường lòng đỏ trứng - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng lấy sinh khối vi khuẩn cho lên đĩa mơi trường lịng đỏ trứng Sau đem ủ tủ ấm 37oC/ 24 ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: có vịng đục xung quanh khuẩn lạc - Phản ứng âm tính: khơng có vịng đục xung quanh khuẩn lạc 2.3 Phản ứng khử nitrate ** Chuẩn bị: - Môi trường nitrate - Dung dịch thuốc thử giess A, giess B - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy thẳng, thao tác vô trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường nitrate Sau đem ủ tủ ấm 37oC/ 24 Sau 24 giờ, nhỏ vào ống nghiệm 2-3 giọt giess A, sau nhỏ tiếp 2-3 giọt giess B ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ cam - Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng Phản ứng Voges – Proskauer (VP) ** Chuẩn bị: - Môi trường Clark Lubs - Thuốc thử NaOH 40%, - -naphtol 10% - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường Clarks Lubs Sau đem ủ tủ 59 ấm 37oC/ 24 Sau 24 giờ, nhỏ vào ống nghiệm 3-5 giọt NaOH 40% 3-5 giọt naphtol 10% Đọc kết sau 15 phút ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: mơi trường có màu đỏ - Phản ứng âm tính: mơi trường có màu vàng 2.5 Phản ứng sử dụng nitrate ** Chuẩn bị: - Môi trường Simmon Nitrate - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm chứa mơi trường Simmon Nitrate Sau đem ủ tủ ấm 37oC/ 24 ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển sang màu xanh dương - Phản ứng âm tính: mơi trường có màu xanh mạ non 2.6 Phản ứng lên men đường maltose ** Chuẩn bị: - Môi trường maltose - Bacillus subtilis ** Tiến hành: Dùng que cấy vòng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường maltose Sau đem ủ tủ ấm 37oC/ 24 ** Kết quả: - Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển sang màu vàng - Phản ứng âm tính: mơi trường có màu đỏ III PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM 60 ** Mục đích: dùng phân biệt vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm ** Thực hiện: - Chuẩn bị vết bơi: nhỏ lên lame kính giột nước cất vơ trùng Dùng que cấy vịng lấy sinh khối vi khuẩn mọc mơi trường hịa vào giọt nước cất dàn - Cố định vết bôi: hơ lame kính qua lại (nhanh) đèn cồn cho vết bơi khơ Mục đích để giết chết vi khuẩn, làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame - Nhuộm tiêu bản: - Đặt giấy lọc lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm Crystal Violte lên miếng giấy lọc (sao cho đủ thấm xuống vết bôi) Để khoảng phút, sau rửa nước - Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bơi nhuộm, để khoảng phút sau rửa nước Sau đó, tẩy nhanh cồn 96o khoảng 15 giây sau rửa nước - Đặt miếng giấy lọc khác lên vết bơi nhỏ thuốc nhuộm Fuschin lỗng lên miếng giấy lọc (vừa đủ thấm ướt vết bôi) Để khỏang phút sau rửa nước - Hơ nhanh lame kính (có vết bơi vừa nhuộm) đèn cồn để làm khô tiêu - Quan sát tiêu kính hiển vi, vật kính dầu, độ phóng đại 1000 lần - Vi khuẩn Gram dương (Gr+): bắt màu tím Crystal Violet - Vi khuẩn Gram âm (Gr-): bắt màu hồng Fuschin loãng IV DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ ĐỤC 0.5 Mc FARLAND - Để chuẩn mực hóa độ đục vi khuẩn thử nghiệm phải đạt 108 tế bào/ml, người ta dùng huyễn dịch BaSO4 tương đương độ đục 0.5 Mc Farland hay huyễn dịch khác tương đương (huyễn dịch latex) - Cách pha: 0.5 ml dung dịch BaCl2 0.048M pha với 99.5 ml dung dịch BaSO4 0.18M Sau cho dung dịch vào ống thủy tinh suốt - Pha độ đục chuẩn dựa nguyên tắc phản ứng: H2SO4 + BaCl2 Ỵ BaSO4 ↓ + HCl ** Cách chuẩn bị ống huyễn dịch có nồng độ tương đương 108 tế bào/ml: - Cho vào ống nghiệm tiệt trùng 9ml NaCl 0.9% - Dùng que vấy vịng, thao tác vơ khuẩn lấy sinh khối vi khuẩn cho vào ống nghiệm 61 - Lắc ống nhiệm để huyễn dịch vi khuẩn đồng - Lưu ý: vi khuẩn sử dụng không 24 nuôi cấy ** Cách so sánh độ đục: - So độ đục ống huyễn dịch chứa vi khuẩn ống chuẩn McFarland tờ giấy trắng có kẻ vạch đen sậm - Nếu ống huyễn dịch vi khuẩn đục McFarland 0.5 , ta nhỏ thêm NaCL 0.9% vô trùng vào ống huyễn dịch vi khuẩn độ đục ống - Nếu ống huyễn dịch vi khuẩn nhạt McFarland 0.5, ta cho thêm vi khuẩn (từng một) vào ống huyễn dịch vi khuẩn độ đục ống V XỬ LÝ THỐNG KÊ Thí nghiệm 1.1 Khả đối kháng với S aureus theo thời gian One-way ANOVA: Bacillus subtilis >< Staphylococcus aureus Analysis of Variance for d1 Source DF SS temps 34.3 Error 69 1110.6 Total 71 1144.9 Level 24 36 48 N 24 24 24 Mean 7.180 7.271 5.764 Pooled StDev = MS 17.1 16.1 StDev 4.259 3.925 3.839 4.012 F 1.07 P 0.350 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) ( -* ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 4.5 6.0 7.5 9.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0192 Critical value = 3.39 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 -2.867 2.686 48 -1.359 4.193 36 -1.269 4.283 62 1.2 Khả đối kháng với E coli theo thời gian One-way ANOVA: Bacillus subtilis >< E coli Analysis of Variance for d2 Source DF SS temps 0.42 Error 69 134.79 Total 71 135.21 Level 24 36 48 N 24 24 24 Mean 0.778 0.965 0.861 Pooled StDev = MS 0.21 1.95 StDev 1.347 1.438 1.406 1.398 F 0.11 P 0.897 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+( -* ) ( -* -) ( * -) -+ -+ -+ -+0.40 0.80 1.20 1.60 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0192 Critical value = 3.39 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 -1.155 0.780 48 -1.050 0.884 36 -0.863 1.071 1.3 Khả đối kháng với Salmonella theo thời gian One-way ANOVA: Bacillus subtilis >< Salmonella Analysis of Variance for d3 Source DF SS temps 1.32 Error 69 106.34 Total 71 107.67 Level 24 36 48 N 24 24 24 Pooled StDev = Mean 0.757 0.541 0.430 MS 0.66 1.54 StDev 1.570 1.132 0.936 1.241 F 0.43 P 0.652 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( * ) ( * -) ( * -) + -+ -+ -+ -0.00 0.40 0.80 1.20 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0192 Critical value = 3.39 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 63 36 -0.643 1.075 48 -0.532 1.186 -0.748 0.970 1.4 Khả đối kháng B subtilis loại vi khuẩn kiểm nghiệm One-way ANOVA: L’effet antibactérien de Bacillus subtilis contre bactéries testées (Ghi : 1- Staphylococcus aureus, 2-Escherichia coli, 3-Salmonella) Analysis of Variance for d Source DF SS MS bacterie 72.484 36.242 Error 1.508 0.251 Total 73.992 Level N 3 Mean 6.7367 0.8677 0.5760 Pooled StDev = StDev 0.8470 0.0937 0.1663 0.5013 F 144.22 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) (-* ) ( * ) -+ -+ -+ -+ 0.0 2.5 5.0 7.5 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0220 Critical value = 4.34 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 4.6129 7.1251 4.9046 7.4167 -0.9644 1.5477 Thí nghiệm 2.1 Khả đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis S aureus theo thời gian One-way ANOVA: Analysis of Variance for d1 Source DF SS MS temps1 67.58 33.79 Error 15 15.04 1.00 Total 17 82.63 Level 24 36 48 N 6 Pooled StDev = Mean 11.333 9.750 6.667 StDev 1.169 0.612 1.125 1.001 F 33.70 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( * -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+ -6.0 8.0 10.0 12.0 Tukey's pairwise comparisons 64 Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0203 Critical value = 3.67 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 0.083 3.084 48 3.166 6.167 36 1.583 4.584 2.2 Khả đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis E coli theo thời gian One-way ANOVA: Analysis of Variance for d2 Source DF SS MS temps1 81.293 40.647 Error 15 6.467 0.431 Total 17 87.760 Level 24 36 48 N 6 Mean 5.1667 3.1333 0.0000 Pooled StDev = StDev 0.7528 0.8524 0.0000 0.6566 F 94.28 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( * ) -+ -+ -+ -+ 0.0 2.0 4.0 6.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0203 Critical value = 3.67 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 1.0496 3.0171 48 4.1829 6.1504 36 2.1496 4.1171 2.3 Khả đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis Salmonella theo thời gian One-way ANOVA: Analysis of Variance for d3 Source DF SS MS temps1 21.778 10.889 Error 15 1.833 0.122 Total 17 23.611 F 89.09 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean 65 Level 24 36 48 N 6 Mean 2.3333 0.0000 0.0000 Pooled StDev = StDev 0.6055 0.0000 0.0000 0.3496 Based on Pooled StDev + -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+-0.00 0.80 1.60 2.40 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0203 Critical value = 3.67 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 24 36 1.8095 2.8571 48 1.8095 2.8571 36 -0.5238 0.5238 2.4 Khả đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis loại vi khuẩn kiểm nghiệm One-way ANOVA: Analysis of Variance for d Source DF SS Bacterie 117.79 Error 28.41 Total 146.21 Level N 3 Mean 9.250 2.767 0.777 Pooled StDev = MS 58.90 4.74 StDev 2.370 2.604 1.345 2.176 F 12.44 P 0.007 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* -) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+ 0.0 4.0 8.0 12.0 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0.0500 Individual error rate = 0.0220 Critical value = 4.34 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 1.030 11.936 3.020 13.926 -3.463 7.443 66 Thí nghiệm đánh giá khả đối kháng dịch canh khuẩn nuôi cấy chung Bacillus subtilis vi khuẩn kiểm nghiệm 3.1 Tác động chống S aureus dịch canh khuẩn nuôi cấy chung B subtilis S aureus Two-way ANOVA: Analysis of Variance for d1 Source DF SS t 119.58 c 236.50 Interaction 86.25 Error 32 47.33 Total 47 489.67 t 12 24 36 48 Mean 12.38 12.04 10.54 8.38 c -3 -2 -1 Mean 8.92 12.92 13.17 8.33 MS 39.86 78.83 9.58 1.48 F 26.95 53.30 6.48 P 0.000 0.000 0.000 Individual 95% CI -+ -+ -+ -+-( * -) ( -* ) ( -* ) ( * ) -+ -+ -+ -+-9.00 10.50 12.00 13.50 Individual 95% CI + -+ -+ -+( -* ) ( * ) ( * ) ( * -) + -+ -+ -+9.00 10.50 12.00 13.50 3.2 Tác động chống E coli dịch canh khuẩn nuôi cấy chung B subtilis E coli Two-way ANOVA: Thí nghiệm Bacillus subtilis >< Escherichia coli Analysis of Variance for d2 Source DF SS t 19.141 c 16.307 Interaction 107.130 Error 32 24.167 Total 47 166.745 t 12 24 36 48 Mean 2.54 2.46 2.92 4.04 MS 6.380 5.436 11.903 0.755 F 8.45 7.20 15.76 P 0.000 0.001 0.000 Individual 95% CI -+ -+ -+ -+ -( * -) ( * ) ( -* ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 67 2.10 c -3 -2 -1 Mean 3.71 3.42 2.46 2.38 2.80 3.50 4.20 Individual 95% CI -+ -+ -+ -+-( * -) ( * -) ( * -) ( * -) -+ -+ -+ -+-2.40 3.00 3.60 4.20 68 ... « ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella » thực vòng tháng (từ 2/2009 – 6/2009) nhằm mục đích đánh giá. .. dẫn Phó giáo sư tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải chúng tơi thực đề tài « ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella. ..Tháng 9/2009 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus, Escherichia coli Salmonella ĐẶNG THỊ LÊ HÂN Khóa luận