TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TÔN PHÚ TÙNG THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts NGUYỄN THỊ THU THỦY 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TÔN PHÚ TÙNG THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts NGUYỄN THỊ THU THỦY 2017 ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Ts Nguyễn Thị Thu Thủy, giảng viên trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức tận tình giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ nhiệt tình tồn thể q Thầy Cơ mơn Hóa học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, người trang bị cho em kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi suốt năm học trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Đỗ Điền Trung chị Trang Hiền Nhân với Anh Chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm – Cơng ty TNHH Liên Nơng Việt Nam (Đức Hòa, Long An) Cơng ty Hóa sinh Á Châu tạo điều kiện toàn diện hóa chất lẫn máy móc, ln quan tâm dạy cho em kinh nghiệm quý giá để em hồn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Đạt cố vấn lớp hóa học K39 quan tâm theo dõi, dạy kiến thức chuyên môn lẫn kinh nghiệm xã hội cho chúng em Em xin cảm ơn quý Thầy, Cô hộ đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Đại học dành thời gian quý báu xem xét, góp ý sửa chữa giúp em hoàn thiện luận văn cách tốt Sau cùng, em xin vô cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè chỗ dựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, quan tâm chia sẻ em suốt thời gian qua để em hồn thành luận văn chương trình Đại Học Chân thành cảm ơn! TÔN PHÚ TÙNG Luận văn Đại Học iii TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc Bộ Mơn Hóa Học NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán hướng dẫn: Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DỊ UV-VIS” Sinh viên thực hiện: Tơn Phú Tùng MSSV: B1304130 Lớp: Hóa HọcKhóa: 39 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017 Cán hướng dẫn Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Luận văn Đại Học iv TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Trường Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc Bộ Mơn Hóa Học NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện:…………………………………………………………… Đề tài: “THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ UV-VIS” Sinh viên thực hiện: Tơn Phú Tùng MSSV: B1304130 Lớp: Hóa HọcKhóa: 39 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài: ……  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2017 Cán phản biện Luận văn Đại Học v TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS TÓM TẮT Việc sử dụng loại thuốc kích thích tăng trưởng nói chung Gibberellic acid nói riêng nơng sản ngày phổ biến Thị trường xuất ngày nhiều loại nơng dược có chứa Gibberellic acid chất lượng hàm lượng chưa thực quan tâm Do đó, việc xác định hàm lượng sản phẩm nông dược cần thiết Các phương pháp định lượng Gibberellic acid đa dạng; đó, phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò UV-VIS phổ biến Tuy nhiên, quy trình phân tích nhiều mặt hạn chế chưa thống nhiều mặt Từ thực tế đó, việc thẩm định tiêu chí tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ làm tăng độ tin cậy tính thống quy trình định lượng Kết thực thẩm định cho quy trình đảm bảo độ tin cậy cao với tính tuyến khoảng 25-200 mg/L Độ đạt khoảng 94-106% Độ xác với RSD < 2% Giới hạn phát 0,000355 mg/L, giới hạn định lượng 0.010764 mg/L Ứng dụng quy trình để thực xác định hàm lượng Gibberellic acid có mẫu nông dược lưu hành thị trường Trong đó, có mẫu đạt yêu cầu mẫu không đạt yêu cầu so với hàm lượng nhãn Từ quy trình định lượng Gibberellic acid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò UV-VIS kiến nghị để ứng dụng để thực xác định dư lượng Gibberellic acid có nơng sản, đảm bảo tính an tồn nơng sản sức khỏe người tiêu dùng Từ khóa: Gibberellic acid, quy trình định lượng, HPLC/UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu cao, quang phổ,… Luận văn Đại Học vi TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS LỜI CAM KẾT Tôi tên Tôn Phú Tùng, xin cam đoan số liệu sử dụng luận văn hoàn tồn nghiên cứu riêng tơi chưa sử dụng báo cáo cấp Cần Thơ, ngày tháng Cán hướng dẫn Sinh viên ký tên Ts Nguyễn Thị Thu Thủy Luận văn Đại Học năm Tơn Phú Tùng vii TƠN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS MỤC LỤC TÓM TẮT vi LỜI CAM KẾT vii DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH HÌNH xi DANH SÁCH PHỤC LỤC xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan quang phổ 2.1.1 Sơ lược đời lịch sử nghiên cứu quang phổ 2.1.2 Định luật hấp thu 2.1.3 Các yếu tố liên quan đến hấp thu 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu 2.1.5 Cơ sở lý thuyết số phương pháp trắc quang 2.1.6 Cấu tạo máy quang phổ UV-VIS 10 2.2 Tổng quan HPLC 12 2.2.1 Nguyên tắc 12 2.2.2 Các phận máy HPLC 13 2.2.3 Một số đại lượng đặc trưng cho sắc ký lỏng hiệu cao 15 2.3 Tổng quan Gibberellic acid 19 2.3.1 Sơ lược lịch sử phát Gibberellic acid 19 2.3.2 Cấu tạo, danh pháp, tính chất 19 2.3.3 Tính chất sinh lý Gibberellic acid 20 2.3.4 Độc tính 21 2.3.5 Tổng quan định lượng Gibberellic acid 22 2.4 Tổng quan thẩm định quy trình định lượng Gibberallic acid HPLC/UV-VIS 22 2.4.1 Định nghĩa 22 2.4.2 Mục đích 22 2.4.3 Các tiêu thẩm định quy trình phân tích 23 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 Luận văn Đại Học viii TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 2.5 Thời gian địa điểm thực 29 2.5.1 Thời gian thực 29 2.5.2 Địa điểm thực 29 2.6 Phương tiên thực 29 2.6.1 Hóa chất dung môi 29 2.6.2 Thiết bị dụng cụ 29 2.7 Đối tượng nghiên cứu 30 2.7.1 Quy trình định lượng GA3 HPLC/UV-VIS 30 2.7.2 Chất chuẩn đối chiếu 31 2.7.3 Mẫu Gibberrellic acid thị trường 31 2.8 Phương pháp nghiên cứu 32 2.8.1 Lựa chọn phương pháp 32 2.8.2 Thẩm định quy trình 32 2.8.3 ứng dụng phương pháp HPLC/UV-VIS để xác định hàm lượng mẫu nông dược thu 32 2.9 Phương pháp xử lý kết 33 CHƯƠNG THỰC HIỆN VÀ KẾT QUẢ 34 2.10 Xác định bước sóng hấp thu cực đại Gibberellic acid 34 2.10.1 Cách thực 34 2.10.2 Bước sóng hấp thu cực đại Gibberellic acid 34 2.10.3 Ý nghĩa bước sóng hấp thu cực đại 34 2.11 Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid HPLC/UV-VIS 35 2.11.1 Tính tuyến tính 35 2.11.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 36 2.11.3 Độ 37 2.11.4 Độ lặp lại 38 2.12 Định lượng mẫu thật 41 2.12.1 Phân tích chuẩn Gibberellic acid 41 2.12.2 Phân tích mẫu thị trường 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 2.13 Kết luận 47 2.14 Kiến nghị 47 Luận văn Đại Học ix TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Tổ hợp màu màu bổ sung Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (AOAC) 24 Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác 25 Bảng 3.1 Hàm lượng đăng ký mẫu thu gom thị trường 31 Bảng 4.1 Cách chuẩn bị dung dịch Gibberellic acid 35 Bảng 4.2 Kết hấp thu ABS GA3 bước sóng 206 nm 35 Bảng 4.3 Kết tính LOD LOQ 36 Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi 38 Luận văn Đại Học x TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.2 Thẩm định quy trình định lượng Gibberellic acid HPLC/UV-VIS 4.2.1 Tính tuyến tính Chuẩn bị dung môi : dung môi pha động (MeOH:H2O:H3PO4 = 35 :64,9 :0,1; theo thể tích) Chuẩn bị mẫu chuẩn : Pha dung dịch gốc 1000 mg/L: Cân xác lượng chất chuẩn chứa 20 mg Gibberellic acid, cho vào bình định mức 20 mL, thêm khoảng 15 mL dung dịch pha động Lắc đều, siêu âm 20 phút, bổ sung thêm dung dịch pha động đến vạch, lắc Từ dung dịch chuẩn Gibberellic acid chuẩn 1000 mg/L ta pha dung dịch với nồng độ tương ứng 25, 50, 100, 150, 200 mg/L Bảng 4.1 Cách chuẩn bị dung dịch Gibberellic acid Nồng độ (mg/L) 25 50 100 150 200 Thể tích chuẩn 1000mg/L(mL) 0,5 Thể tích định mức (mL) 20 20 20 20 20 Thực đo độ hấp thu quang học dung dịch bước sóng 206 nm Kết thu thể Bảng 4.2 Hình 4.2 Bảng 4.2 Kết độ hấp thu ABS Gibberillic acid bước sóng 206 nm Luận văn Đại Học Nồng độ (mg/l) Độ hấp thụ A 25 2.94729 50 2.98156 100 3.05124 150 3.12994 200 3.19578 35 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Tuyến tính GA3 3.25000 y = 0.0014x + 2.9105 R² = 0.9993 3.20000 3.15000 3.10000 3.05000 3.00000 2.95000 2.90000 50 100 150 200 250 Hình 4.2 Đường chuẩn Gibberellic acid bước sóng 206 nm Đường chuẩn cho thấy có tuyến tính Gibberellic acid khoảng nồng độ từ 25-200 mg/L, phương trình hồi quy y=0,0014x + 2,9105 với hệ số hồi quy tuyến tính R2=0,9993 thể hình 4.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát (LOD): Giới hạn định lượng (LOQ): Từ ta có bảng Bảng 4.3 Kết tính LOD LOQ Giá trị Gibberellic acid S (độ dốc) SD LOD (mg/L) LOQ (mg/L) 2,9105 0,003133 0,000355 0,010764 Như vậy, Gibberellic acid, giới hạn phát giới hạn định lượng 0,000355 mg/L 0,010764 mg/L Qua thấy Gibberrellic acid phân tích kể mẫu có nồng độ thấp Luận văn Đại Học 36 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.2.3 Độ Nguyên tắc: sử dụng phương pháp thêm chuẩn, thêm lượng mẫu đối chứng có nồng độ biết trước vào mẫu thử ta được: C(mg/L) = Cđối chứng (mg/L) + Cmẫu thử (mg/L) Pha dung dịch chuẩn: Cân xác lượng chất chuẩn chứa 0,020 g Gibberellic acid Hòa tan dung dịch pha động, lắc siêu âm, định mức đến 20 mL Pha dung dịch mẫu: Cân xác lượng mẫu có chứa 0,020 g Gibberellic acid Hòa tan dung dịch pha động, lắc siêu âm, định mức đến 20 mL Hút 0,5 mL dung dịch chuẩn 0,5 mL dung dịch mẫu cho vào vio mL Bơm vào máy HPLC tiến hành đo Thực trình lần ghi nhận kết bảng hình Hình 4.3 Kết xác định độ Luận văn Đại Học 37 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi Cân STT mẫu (mg) 19.2 20.9 20.6 21.3 20.4 18.8 Nồng Nồng Cân Vhút Vhút Hiệu độ độ Cm CSpike CObs chuẩn mẫu chuẩn suất mẫu chuẩn (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg) (mL) (mL) (%) (mg/L) (mg/L) 960 20 1000 0.5 0.5 480.00 500.00 971.131 94.23 1045 985 0.5 0.5 522.50 492.50 976.408 98.26 19.7 1030 955 0.5 0.5 515.00 477.50 970.152 103.17 19.1 1065 1005 0.5 0.5 532.50 502.50 975.794 94.19 20.1 1020 955 0.5 0.5 510.00 477.50 970.107 103.16 19.1 940 990 0.5 0.5 470.00 495.00 972.997 96.57 19.8 Trong đó: Vhút chuẩn: thể tích hút từ chuẩn (mL) Vhút mẫu: thể tích hút từ mẫu (mL) Cm: nồng độ mẫu ban đầu (mg/L) CSpike: nồng độ chuẩn ban đầu (mg/L) CObs: nồng độ đo (mg/L) Cm = Nồng độ mẫu * Vhút mẫu CSpike = Nồng độ chuẩn * Vhút chuẩn 𝐶𝑂𝑏𝑠 − 𝐶𝑚 𝐶𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒 𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 (%) = Qua kết thấy phương pháp có độ phục hồi cao đáp ứng yêu cầu khoảng 94-106% 4.2.4 Độ lặp lại Quy trình định lượng Gibberrellic acid Cục bảo vệ thực vật thực hai lần đo khác nhau, lần thực mẫu đối chứng mẫu chuẩn Mỗi mẫu thực lặp lại lần Kết chấp nhận %RSD kết lần đo lượng cân không vượt 2% Khi đó, phương pháp có độ lặp lại cao Luận văn Đại Học 38 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Hình 4.4 Kết kiểm tra độ lặp lại thực lần đo thứ Kết phân tích cho thấy lần đo thứ nhất, nồng độ mẫu chuẩn qua lần thực có độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) không vượt 2% Luận văn Đại Học 39 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS Hình 4.5 Kết kiểm tra độ lặp lại thực lần đo thứ hai Kết phân tích cho thấy lần thực thứ hai, nồng độ mẫu chuẩn qua lần thực có độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) khơng vượt q 2% Như vậy, phương pháp cho độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối thấp, không vượt 2% Luận văn Đại Học 40 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.3 Định lượng mẫu thật 4.3.1 Phân tích chuẩn Gibberellic acid 4.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân khoảng 0,020 g chất chuẩn Gibberellic acid xác đến 0,00001 g vào bình định mức 20 mL Hòa tan định mực đến vạch dung dịch pha động (dung dịch A) Lấy xác mL dung dịch A cho vào bình 20 mL định mức đến vạch dung dịch pha động Đuổi khí trước bơm vào máy Cân 0,020 chất chuẩn Thêm 15 mL dd pha động 15 mL dung dịch Lắc siêu âm 20 phút Định mức đến 20 mL dd pha động 20 mL dung dịch gốc Hút mL Định mức đến 20 mL dd pha động Dung dịch chuẩn Hình 4.6 Sơ đồ bước pha dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn bơm vào máy HPLC Thông số máy : Pha động : Methanol : Nước : Acid Phosphoric 35 : 64,5 Tốc độ dòng : mL/phút Bước sóng : 206 nm Lượng mẫu bơm vào : 20 µL Nhiệt độ cột : 40OC Luận văn Đại Học 41 : 0,1 (theo thể tích) TƠN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.3.1.2 Kết phân tích chất chuẩn Hình 4.7 Kết phân tích chuẩn GA3 HPLC/UV-VIS Kết cho thấy: GA3 có thời gian lưu trung bình 10,943 phút Hệ số đối xứng peak trung bình 1,006 (đáp ứng khoảng 0,9-1,2) Các thông số chiều cao peak diện tích peak lần đo khơng lệch 1% : ∆𝐻.𝑝𝑒𝑎𝑘 = ∆𝑆.𝑝𝑒𝑎𝑘 = Luận văn Đại Học |35098 − 34934| × 100 = 0,469% < 1% 34934 |658174 − 657150| × 100 = 0,156% < 1% 657150 42 TÔN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.3.2 Phân tích mẫu thị trường 4.3.2.1 Chuẩn bị mẫu Cân lượng mẫu thử có chứa 0,020 g hoạt chất Gibberellic acid xác đến 0,00001 g vào bình định mức 20 mL Hòa tan định mực đến vạch dung dịch pha động (dung dịch B) Lấy xác mL dung dịch B cho vào bình 20 mL định mức đến vạch dung dịch pha động Lọc qua màng lọc 0,45 µm đuổi khí trước bơm vào máy Nghiền mẫu Cân lượng mẫu chứa 0,020 g Gibberellic acid Thêm 15 mL dd pha động 15 mL dung dịch Lắc siêu âm 20 phút Định mức đến 20 mL dd pha động 20 mL dung dịch gốc Lắc siêu âm 20 phút Định mức đến 20 mL dd pha động Dung dịch mẫu Hình 4.8 Sơ đồ bước pha dung dịch mẫu Dung dịch mẫu bơm vào máy HPLC với điều kiện thông số máy hồn tồn tương tự điều kiện thơng số máy phân tích mẫu chuẩn Luận văn Đại Học 43 TƠN PHÚ TÙNG ĐỊNH LƯỢNG GIBBERELLIC ACID BẰNG HPLC/UV-VIS 4.3.2.2 Kết phân tích mẫu Gibber 4T Hình 4.9 Kết phân tích mẫu Gibber 4T (4%) Kết cho thấy: Mẫu có peak thời gian lưu 10,937 phút Hệ số đối xứng peak đạt 1,009 (đáp ứng khoảng 0,9-1,2) Chiều cao peak diện tích peak có %RSD nhỏ 20% Kết tính tốn mẫu có hàm lượng 3,980% (%RSD=1,162