ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHQGHN BÁO CÁO TÔNG KÉT KÉT QUẢ THựC HIỆN ĐÊ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacìllus amylolique/aciens Mã số đề tài: QG.13.12 Chủ nhiệm đề tài: TS Trịnh Thành Trung Hà Nội, 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CKQG8 N BÁO CÁO TỎNG KẾT KÉT QUẢ THỰC HIỆN ĐÈ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus am ylolique/aciens Mã số đề tài: QG.13.12 Chủ nhiệm đề tài: TS Trịnh Thành Trung Hà Nộị, 2016 PHẢN I T H Ô N G T IN CHƯNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn B acillus am ylolique/aciens 1.2 Mã số: QG.13.12 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên TS Trịnh Thành Trung Ths Trịnh Thị Vân Anh "ĩ i K.S Hà Thị Hàng CN Nguyễn Thị Anh Đào KS Nguyễn Mạnh Hùng Đơn vị công tác Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vai trò thực đề tài Chủ nhiệm đề tài Thư ký Thành viên Thành viên Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật Cơng nghệ Sinh học 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo họp đồng: 24 tháng từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 05 năm 2015 1.5.2 Gia hạn (nếu có): 12 tháng đến tháng 05 năm 2016 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 09 năm 2016 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quà nghiên cíni to chức thực hiện; Nguyên nhân; Y kiến cùa Cơ quan qrì lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 160 triệu đồng PHÀN II TỎNG QUAiN K É T QUẢ NG H IÊN c u Viết theo cấu trúc báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo đăng tạp chí khoa học ĐHQGHN sau đề tài nghiệm thu), nội dung gồm phần: Đặt vấn đề Sử dụng phân bón vơ CO' loại thuốc hóa học phịng trừ sâu bệnh sàn xuất nông nghiệp gày tác động tiêu cực đến độ mầu mỡ cùa đất, hủy hoại môi trường sống làm ành hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh bền vững vấn đề tất yêu quốc gia phân bón hữu CO' sinh học giải pháp ưu thê nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ứng dụng rộng rãi toàn thê giới (Bhardwaj et al., 2014) Phân bón hữu sinh học khơng chi cung cấp loại chất dinh duững nhàm trì ổn định độ phi nhiêu cho đất mà cung cấp loại vi sinh vật có lợi cho phát triển trồng Các vi sinh vật thường bồ sung vào phàn bón hữu sinh học bao gồm Rhizobium (vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh), Aiospirillum (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), Bacillus (vi khuẩn phân giải phosphate khó tan sàn sinh chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas Trichoderma (vi khuân nấm sợi sàn sinh chất phòng trừ bệnh cây) (Fravel, 2005) Chi Bacillus nhóm lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi hệ sinh thái Bacillus có khà sinh nội bào tử, dạng nghi tế bào để giúp vi khuẩn chổng chịu tồn trước điều kiện bất lợi cúa môi trường khô hạn thiếu dinh duởng Theo hệ thống phân loại nay, chi Bacilhis có khoảng gần 300 loài loài phụ ioải (Parte, 20 i 4) Trơng số đó, Bacillus velczensìs (hay gọi B amỵlolique/aciens subsp planturum, B methylotrophicus B oryzicolà) tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis (Rooney et al., 2011; Dunlap et a l, 2015) Đây loài vi khuân an toàn, sỏ' hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sàn sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sàn sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm cùa loại vi sinh vật gây bệnh (Chovvdhury et al., 2015; Shao et a i, 2015; Li et al., 2015) Do sở hữu đặc tính quý, nhiều chủng vi khuẩn B velezensis phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đấu tranh sinh học bổ sung vào loại phân bón hữu sinh học Một số chủng B velezensis FZB42 sàn xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học chế phẩm phòng trừ bệnh (Chowdhury et al., 2015) Nhiều báo cáo công bố hiệu quà sử dụng chửng B veleiem is phòng trừ làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh mức độ nhiễm bệnh vi khuẩn nấm gây bệnh gây (Chen et al., 2014; Huang et al., 2014; Wu et al., 2015; Kang et a i, 2015) Sàn lưọng thu hoạch tăng lên 30% bồ sung chủng B veleiensis FZB42 vào phàn bón (Yao et al., 2006) Nhằm tìm kiếm chủng vi khuẩn có tiềm nãng ứng dụng sàn xuất chế phẩm làm phân hữu CO' sinh học, nghiên cứu này, trọng tâm nghiên cứu đặc tính có lợi cho trồng từ chủng vi khuẩn B velezensis có sưu tầm vi khuân Bacillus thu thập vùng Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Cơn Đảo Ngồi ra, chùng vi khuẩn B velezensis SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng Liên sử dụng Bacillus velezensis số tám loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sublilis (Rooney et al., 2009) Đây loài vi khuẩn an toàn, sỏ' hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh (Chovvdhury et al., 2015; Shao et al., 2015; Li et al., 2015) Do sờ hữu đặc tính quv, vi khuẩn B velezensis nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu cấp độ từ giái mã hệ genome đến nghiên cứu chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng nhà kính ngồi thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B velezensis phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đâu tranh sinh học đê phòng ngừa loại dịch bệnh hại trồng B velezensis sán sinh nhiều loại chất trao đồi bậc hai có hoạt tính kháng nâm kháng vi khuẩn gây bệnh Các chất trao đổi bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias et a i, 2009; Huang et al., 2014) Lipopeptide cấu tạo từ chuỗi peptide liên kết với acid béo, tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhờ có mặt nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) Giải mã hệ gene chủng B velezensis cho thấy 9% hệ genome vi khuẩn mang gene tham gia sinh tổng hợp lipopeptide (Chovvdhury et al., 2015) Dựa vào cấu trúc phân tứ đặc tính sinh học, lipopeptide sản sinh từ Bacillus Paenibacillus chia thành nhóm lipopeptide mạch vịng mang điện tích dương, lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương (Cochrance, Vederas, 2014) Surfactin, iturin fengycin lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương thường tìm thây dịch ni cấy cùa lồi B subtilis (Stein, 2005; Ongena, Jacques, 2008) Bên cạnh đó, nhiều chùng B velezensis cịn có khả sàn sinh đồng thời polyketide difficidin, bacillaene macroìactin (Argueiles-Arias et u i, 2009; Yuan et a i, 2012) Trong trình tìm kiếm chùng vi khuẩn có khả ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh hại cây, phân lập chủng B velezensis CP 1604 dất nông nghiệp gần vườn Quốc gia Cúc Phương có khả đối kháng mạnh với nấm gây bệnh Sclerotiiim hydrophilum, Rhizoctonia soỉani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum vi khuẩn gây bệnh bạc Xanthomonas oryzcie (Trung et al., 2016) Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết, tinh xác định bàn chất chất kháng nấm chất kháng khuẩn sinh từ chùng CP i 604 M ục tiêu - Tuyển chọn đưọc chủng vi khuẩn Bacillus am ylolique/aciens sinh chất kháng nấm mạnh - Nghiên cứu điều kiện lên qui mô lít - Tách chiết thu hồi chất kháng nấm - Tinh xác định bàn chất sinh lý hóa chất kháne nấm - Đánh giá độ an toàn chất kháng nấm Phương pháp nghiên cứu C hủng vi khuẩn nghiên cứu Từ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ phân lập vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Cơn Đào, chúng tơi tiến hành so sánh tính tương đồng cao cùa đoạn gen 16S rRNA so với chúng chuẩn cúa loài sỏ' liệu Eztaxon-e ('http://eztaxone ezbiocloud.net/) Dựa số liệu so sánh, chủng tơi lựa chọn chùng có trình tự gen16SrRNA tương đồng cao với loài B velezensis, B am yloliquefaciens subsp plantarum ,B methylotrophicus B oryzicola Từ ống lưu giữ lạnh sâu -70°c, chủng vi khuẩn lựa chọn ria hoạt hóa mơi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) 30°c Sau 24 giờ, tế bào hoạt hóa thu dùng cho thí nghiệm mơ tà Xác định khả năn g sinh c h ấ t k h n g nấm c h ấ t k h n g k h u ẩ n Từ tế bào hoạt hóa, chùng vi khuẩn cấy trải mặt thạch TSBA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) ủ 30°c Hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn kiểm tra phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, khoanh thạch đục bàng ống nhựa vô trùng ( = mm) đặt lên mơi írưịng PDA (g/L: khoai tây 200 g, dextrose 20 g thạch 15 g) cấy sẵn loài nấm kiêm định gây bệnh thực vật Fusarium oxysporum, Scleroúum hydrophilum, Rhizoctonia solani Phytophthora capsici đặt lên môi trường NA cấy vi khuẩn kiểm định gây bệnh bạc lúa Xanthom onas oryzae Ngồi ra, phổ hoạt tính kháng nấm đưọc kiểm tra chủng nấm kiểm định Aspergillu.s oryzae, A nigcr Sacchciromyces cerevisiae Bộ giống chùng vi sinh vật kiểm định lưu giữ Bào tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Viện Vi sinh vật Công nfihệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Xác định khả sinh enzym e ngoại bào Từ tế bào hoạt hóa, chủng vi khuẩn đưọc cấy vào binh tam giác 250 mi chứa 100 mỉ mơi trưịng TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể Sau 48 nuôi cấy lắc 160 v/p 30°c, dịch nuôi ly tâm 8.000 v/p 10 phút nhầm loại bỏ tế bào vi khuẩn Khả sinh enzyme ngoại bào xác định phương pháp khuếch tán thạch Theo dịch nuôi cấy vi khuẩn đưọc nhỏ vào giếng ( = mm) đục lỗ đĩa thạch chứa , % loại chất tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein tributyrin Sau 24 ủ đĩa thạch chứa chất 37°c, hoạt tính amylase CMCase xác định dựa vòng trong-phân giải chât tinh bột tan CM C xung quanh khoanh thạch nhuộm với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase chitinase quan sát nhuộm chất xylan chitin với dung dịch đỏ cơng gơ; hoạt tính protease lipase quan sát trực tiếp chất casein tributyrin Xác định khả phân giải p hosphate khó tan Chùng vi khuẩn hoạt hóa đưọc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml mơi trường dịch thể PVK (g/L: glucose 10, C a (P ) 5, KCI 0,2, (NH ) ; S 0,5, NaCI 0,2, M g S 7H2Õ 0,1 M n S H20 0,002 F e S 7H20 0,002) Sau 48 nuôi lắc 160 v/p 30°c, dịch nuôi vi khuấn ly tâm ỏ' 8.000 v/p 10 phút để loại bo té bào Hàm iuựrig phosphe vơ giải phóng từ Ca (P ) vào mỏi trường nuôi cấy xác định phương pháp xanh molybden dựa đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH PO (Holman et a i, 1943) Xác định khả sinh chất kích thích sinh trướng IAA Chủng vi khuẩn hoạt hóa cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml mơi trường dịch thể NA có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) tới nồng độ cuối mM Sau 48 nuôi lắc 160 v/p 30°c, dịch nuôi vi khuẩn ly tâm ỏ' 8,000 v/p 10 phút để loại bỏ tế bào Khà sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (1AA) xác định dựa phản ứng tạo mầu với thuốc thử Salkowski (Glickmann Dessaux, 1995) Hàm lượng IAA sinh xác định dựa đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức) Dấu vân tay rep -P C R phân tích tính tương đồng kiểu gen Từ khuẩn lạc khiết, ADN tổng số tách chiết theo phưong pháp cùa Gabor et al (2003) Mức độ tinh ADN kiêm tra dựa sô bước sóng A /A (xâp xi 1,8) Sau đó, 50 ng ADN cùa chủng vi khuẩn đưa vào ống PCR tích phàn ứng cuối [à 25 |il chứa sằn DreamTaq™ PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientiíìc, Mỹ) Phàn ứng PCR thực với mồi ERIC GTG theo chu trình nhiệt Freitas et al (2008) đà mơ tả Sàn phẩm PCR điện di 65 V gel agarose 2% có bổ sung chất nhuộm ADN RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di chụp hệ thống soi gel (BioRad, Mỹ) Mơ hình băng ADN (hay kiều gen) tạo từ chùng vi khuẩn phân tích mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0 Tính tương đồng kiểu gen tính tốn theo hệ số Dice Mối quan hệ kiểu gen chùng đưọc thể theo SO’ đồ sử dụng thuật tốn UPGMA Tât bước phân tích tính tương đông kiêu gen thực phân mêm NTSYSpc P hân tích trình tự đa gen xây dựng phát sinh chủng loại Phản ứng PCR khuếch đại giải trình tự đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha ipolC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) 16S rRNA thực với cặp mồi theo mô tả cùa Rooney et al (2009) Trình tự cùa gen gửi lên ngân hàng gen với số hiệu KU9048IỌ, KU9048I1, KU9Ọ4812 KU904813, KU904814 K.U9048I0 Trình tự đa gcn chủng vi khuân nghiên cứu có chiêu dài 5.547 bp kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp gen gỵrA, đoạn 964 bp gen rpoB, đoạn 875 bp cùa gen purH đoạn 777 bp gen p o ic, đoạn 835 bp gen groEL đoạn 1,168 bp gen I S rRNA Trình tự đa gen lồi quan hệ gần gũi nghiên cứu Kobo et a i (2011) tài từ ngân hàng gen NCBI (http://wvv\\ ncbi.ním.nih.íiov/') Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000 lần phần mềm MEGA phiên 5.05 Tách chiết chất kháng nấm kháng khuẩn Từ dịch nuôi cấy loại bỏ tế bào, chất kháng nấm chất kháng khuẩn tách chiết bàng phương pháp (i) sử dụng dung môi hữu cơ, (ii) hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, (iii) đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết ethanol (iv) tủa pH thấp Các phương pháp tách chiết lặp lại đến lần theo quy trình sau: i Phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ: dịch ni cấy loại bị tế bào đưa vào dung mơi có độ phân cực khác benzen, l-butanol, chlorotbrm, ethyl acetate, hexan, 2-pentanoi vá tuiuene theo tỷ ỉệ ỉ : Sau đảo trộn mẫu 10 phút, hỗn hợp dung dịch ly tâm tốc độ 0 vòng/phút phút nhăm tách rõ lớp dịch nuôi cấy dung môi Phần dung mơi phía thu lại quay nhiệt độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thơ hoàn nguyên với nước cất thứ hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định II Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amber!ite-XAD7 đưa vào dịch nuôi cấy theo tý lệ : (khối lưọng/thể tích) Hỗn hợp khuấy nhẹ qua đêm máy khuấy từ ỏ' nhiệt độ 4°c Sau đó, hạt amberlite đơọc thu lại rửa liên tiếp lần với nước cất, lần với ethanol 30% Hạt amberlite khuấy nhẹ với ethanol 75% (He et a i, 2007) Chất kháng sinh thô ethanol thu lại cô quay nhiệt độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thơ hồn ngun với nước cất thử hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định iii Phương pháp đơng khơ: tiến hành đơng khơ hồn tồn dịch ni cấy Sau đó, đưa lượng thể tích ethanol 0 % tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đông khô lấc 160 vòng/phút nhằm chiết rút chất kháng sinh thô Phần ethanol thu lại cô quay nhiệt độ 60°c Sau đó, cặn kháng sinh thơ hồn ngun với nước cât thử hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định iv Phương pháp tủa pH thấp: dịch nuôi cấy chỉnh pH 3,0 sử dụng HCI N ù qua đêm 4°c Sau đó, dịch ni cấy ly tâm 8.000 vòng/phút 10 phút Phân cặn tủa thu lại hoàn nguyên với nước cất Hoạt tính kháng sinh thơ cặn tủa thử với nấm vi khuẩn kiểm định Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn Chất kháng nấm chất kháng khuẩn đưọc tinh bàng kỹ thuật HPLC sử dụng cột Zorba.\ Eclipse XDB - C18 (4,6 X 250 mm, |il, Agilent Technologies, USA) Phương pháp tinh HPLC thực theo mô tả cùa He et al 2007 Theo đó, pha động sử dụng methanol nuớc chứa 0,05% triíluoroacetic acid Sau cân bàng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 |il dịch kháng sinh tách chiết theo bước bàng dung môi I - butanol hạt amberlite-XAD7 tải lên cột Dung môi hệ động thay đổi tuyến tính theo nồng độ methano! từ 20% lên 40% 10 phút, từ 40% lên 60% phút từ 60% lên 70% 10 phút Tốc độ dịng cùa q trình sắc ký 0,5 ml/phút sắc ký-đồ ghi nhận bước sóng 220 nm Sau bị thơi khòi cột, phân đoạn sẳc ký (0,5 ml/phân đoạn) thu nhận, cô quay loại bỏ dung môi thử hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn Sau đó, phân đoạn có hoạt tính trộn lại vói tinh lại lần theo chu trình sắc ký mơ tà Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn gửi sang Trung tâm Phương pháp Phồ ứ n g dụng - Viện Hóa Học - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ để xác định phổ khối Xác định đặc tính sinh hóa lý chất kháng nấm kháng khuan Khả bền nhiệt độ, bền pH bền với enzyme thủy phân chất kháng nấm chất kháng khuân thử nghiệm sau: i ii iii Khả nâng bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh xử lý nhiệt độ 60°c, 80°c 100°c Sau thòi gian xứ lý 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn xác định bàng phưong pháp khuếch tán thạch mô tà Khả bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh xử lý pH từ 3,0 đến 7,0 đệm citrate-phosphate pH 8,0 đến 9.0 đệm Tris-HCI Sau 24 ủ 4°c, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn xác định bẳng phương pháp khuếch tán thạch mô tà Khả bền với enzyme thùy phân: enzyme trypsin, a-chymotrypsin, amylase, lipase proteinase K pha đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối mg/ml Sau dịch tách chiết chất kháng sinh trộn với dung dịch enzyme theo tỷ lệ : ủ 37°c Sau xử lý, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn đưọc xác định phương pháp khuếch tán thạch mô tà T h nghiệm tính an tồn chất kháng nấm kháng khuấn Tính an tồn chất kháng nấm kháng khuẩn sán sinh từ chùng B amyloliquefaciem subsp plantarnm CP 1604 bước đầu thử nghiệm khả náng nảy mầm hạt thóc, hạt lạc hạt ngô; thử nghiệm năne sinh trường ioại ìúã, lạc ngơ Qua chất kháng nấm tách thơ pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nưóc cất loại hạt kể đưọc ngâm giị' dung dịch pha lỗng nàv Sau đó, hạt đưa lên lớp bơng ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ỏ- 25°c Độ ẩm bơng kiểm tra hàng ngày kích thước (cm) hạt nẩy mầm đo lại sau đến ngày ù mầm Đối chứng hạt ngầm nước cất trước ù mầm Nhằm đánh giá tính an tồn chất kháng nấm chất kháng khuẩn lên sinh trưởng non, mầm hạt mẫu đối chứng trồng đất Sau - ngày phát triên ồn định, chất kháng nấm tách thô pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phun lên bề mặt Đối chửng nưó'c cất phun lên bề mặt Màu sắc quan sát hàng ngày Sau ngày thử nghiệm, kích thước I ghi lại so sánh Tổng kết kết nghiên cứu B am ylolique/aciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành thu thập 79 mẫu đất vườn Quốc gia vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Cơn Đào 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ phân lập bàng phương pháp xử lý nhiệt [45] Dựa đặc điểm khác biệt màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt mép viền khuấn lạc, 252 (17,5%) chủng giải trình tự gen 16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp) So sánh sở liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chùng có chi sơ tương đồng gen 16S rRNA cao với chủng B cimylolique/ciciens subsp plantarum FZB42 99,93% Gen I S rRNA 14 chùng tương đồng chí sai khác nucleotide vị trí 583 (G thay bàng A) so với chung chuẩn FZB42 Khơng có chùng có trình tự gen I S rRNA tưong đồng cao với loài B methylotrophicuỉi B oryzicola Trong số 14 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum, chùng phân lập Cúc Phương, chủng phân lập ỏ- Bạch Mã, chủng phân lập đ ọ o Chư Yang Sin chùng phân lập đưọc Côn Đảo 12 ( %) chùng phân lập đất canh tác nông nghiệp; chi có chủng BM 1912 CĐH 1701 phân lập đất rừng Ngoài ra, B amylolique/aciens subsp plantarum SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng Hoàng Liên nghiên cứu Thông tin chi tiết 15 chủng trình bày bảng H oạt tính kháng nấm vi khuẩn Cùng với chùng SP 1901, 14 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum nghiên cứu sinh chất kháng nấm gây bệnh F oxysporum, s hydrophilum R solani p capsici với kích thước vịng kháng nấm trung bình loại nấm 4,2 mm, 10,6 mm, 7,7 mm 7,4 mm Các chùng B amvlolique/aciens subsp plantarum thử nghiệm sinh hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lúa X oryzae với kích thước vịng kháng trung bình 20,8 mm Ngồi ra, hoạt tính kháng nấm cùa chùng vi khuấn rõ ràng thử nghiệm với loại nấm sợi I loại nấm men thường gặp A oryzae, A niger cerevisiae (Bảng 2) Điêu chứng tị ràng chung B am yitìiiqueỳaaem subsp planiarum phản lập môi trường tự nhiên Việt Nam sinh chất có phổ hoạt tính rộng kháng nấm kháng khuẩn Bàng Thông tin CO' bàn cùa 15 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum STT Tên chủng Loại đất Ị CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM0621 BM 0824 BM 1912 CYS0I01 NN NN NN NN NN R NN' i Tọa độ 20.39730 20.40270 20.36010 16.09630 16.27200 15.99740 12.65070 N N N N N N N 105.58793 105.53779 105.67194 108.08954 108.00317 107.99320 108.09832 E E E E E E L Độ tu o ng đồng (%) Số hiệu đoạn 16S rDNA tham chiếu 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 CP000560 CP0005Ó0 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 10 1 12 13 14 15 CYS 0208 CYS 0816 CYS090I CYS09I CĐH 0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 NN NN NN NN NN NN R R 12.61560 N 12.49300 N 12.52710 N 12.52710 N 8.68555 N 8.68555 N 8.68916 N 22.28469 N 108.12942 108.28791 108.35777 108.35777 106.59250 106.59250 106.58861 103.89341 E E E E E E E E 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 N N: nơne nghiệp; R: rừng Phân tích hệ genome B amylolique/ciciem subsp plcmtanim cho thấy 9% hệ genome cùa vi khuẩn chứa gen mã hóa chất kháng nấm kháng khuẩn (Chovvdhury et al., 2015) Đa số chất có chất peptide tổng hợp không qua ribosome bacylicin, lipopeptide (surfactin, ĩengycin, iturin bacillomycin) polyketide (difficidin, bacillaene macrolactin) Giống chủng công bố, 15 chủng B amylolique/aciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam có khả sàn sinh chất kháng nấm vi khuẩn gây bệnh Trong số loài vi khuẩn ứng dụng làm chế phẩm phòng trừ loại bệnh hại trồng, Bacillus trọng nghiên cửu vi khuẩn có khà tạo nội bào tử để tồn lâu chế phẩm điều kiện bào quản thưòng Nhiều chùng B amylolique/aciens subsp amylolique/aciens B amylolique/aciens công bố khà đối kháng với loại vi sinh vật gây bệnh trồng in vitro chủng L-H15 đối kháng nấm F oxyspom m [22]; chùng S76-3 đối kháng nấm F graminearum [20]; chùng GR53 đối kháng nấm R solanì [32]; chùng C N U 114001 đối kháng với 12 loại nấm gây bệnh Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum , c orbiculare, Curyne.spura cassicola, F oxysporiim, Penicillium digitatum, p capsici, R sôlani, Stemphliyum lycopersici, Pyricularia grisea Sclerotinia sclerotioritm [30] Nhiều chủng B amvlolique/aciens subsp plantarum có khả phịng trừ giảm thiểu bệnh cho trồng thử nghiệm nhà kính dịch ni cấy dịch tế bào chùng NJZJSB3 bào vệ iá cải dầu chống lại hoàn toàn xâm nhiễm cúa nấm Sclerotinia sclerotiorum [48]; lạc xừ lý với chủng BZ -I giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh R solanacearum từ 84,5% xuống 12,1% [47] Hon nữa, bổ sung vi khuẩn B amyloliqite/aciens subsp plantarnm vào phân hữu làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh trồng chùng S20 làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearnm cà tím từ 56% xuống cịn 22% [7]; chủng HR62 làm giảm tỳ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum cà chua xuống 65% [27] Chính vậy, nghiên cứu nhằm đánh giá thúc đẩy sinh trường, phát triển tạo suất cho trồng việc làm cần thiết nhàm tìm kiếm chùng B amylolique/aciens subsp amyloliqiie/aciens hữu ích sử dụng Irong sàn xuât chê phâm phân bón hữu sinh học phù họp với điều kiện đất canh tác nông Việt Nam Báng Hoạt tính kháng nấm vi khuân BM 0621 -7 1 1 9 Q 8 1 10 23 21 20 19 s cerevisiae A r/iger 12 o * A oryzae 13 p capsici R solani CP 1604 CP 1801 r'D nf"K s hydrophilum F oxyspornm Hoạt tính kháng nàin vi khuân (D - d, mm) Kháng nâm khác Kháng nâm vi khuân gây bệnh 5 BM 0824 BM 1912 CYS 0101 CYS 0208 CYS0816 CYS 0901 CYS091 CĐH0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 5 13 12 12 1 12 7 9 21 11 21 9 18 23 23 22 10 20 10 1 4 1 6 5 23 18 17 23 6 10 4 5 9 2 7 2 Enzym e ngoại bào Thử nghiệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy 15 chủng B amylolique/ciciens subsp plantarum sinh enzyme ngoại bào lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase chitinase Kích thước vịng phân giải loại chất tương đương thể chi tiết bảng Bảng Khả sinh loại enzyme ngoại bào Tên chúng CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 BM 0824 BM 1912 CYSOiOI CYS 0208 CYS 0816 CYS 0901 CYS 091 CĐH 0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 Lipase 1i 11 10 11 10 9 10 7 * Hoạt tính enzyme ngoại bào (D - d, mm) Amylase Chitinase Protease CMCase 17 23 23 20 23 20 17 23 24 23 17 16 23 25 18 16 23 19 16 21 23 23 15 16 17 17 22 23 „ 16 21 23 19 21 23 19 16 21 23 18 16 18 23 23 20 22 15 20 23 22 22 19 15 22 20 16 21 22 19 16 18 Xylanase 20 17 17 20 17 20 16 17 20 17 17 20 18 18 19 Khá phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trư ởng IAA 15 chùng B amolique/aciens subsp plantarum có khà phân giải phosphate khó tan Ca (P 4)2 Mức độ giái phóng phosphate vô vào môi trường nuôi cấy giao động từ 19,64 - 74,21 |xg/ml Bên cạnh đó, số chủng có khả sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA rõ ràng chủng CDH 0101 (3,28 (ig/ml) SP 1901 (1,98 |ig/ml): số chung sinh hàm lượng IAA thấp CP 1604 CYS 0101 (Bàng 4) Bảng Khá phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA Tên chung CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 HU 0824 BM 1912 Lượng phosphate hòa tan (Ịig/m! GTTB ± KBT) 49,67 ±0,61 53,12 ± ! ,96 53,25 ±2,19 54,45 ± 5,13 63,24 ±0,53 61,21 ±2,99 Lượng IAA sinh GTTB ± KBT) ũ,(59 ± 0,09 1,41 ±0,05 1,40 ±0,04 1,18 ± 0,07 1,07 ±0,08 i ,44 i 0,04 (ng/ml; m ặt n h ó m đa en zy m e non-ribosom al peptide synthetases (N R P S) D ự a vào câu trúc phân tử đặc tính sin h học, lip o p ep tid e sản sinh từ vi khuẩn B acillus đư ợ c xếp vào h ọ surfactins, iturins fengycin (S tein, 2005; O ngena Jacques, 2008) Iturin bao gôm iturin A, c , D , E, bacillom ycin D , F, L, bacillo p ep tin m ycosubtilin (M oyne v cs, 2004) Đ ây phân tử có cấu trúc c ủ a m ột v ò n g p eptide liên kết với m ột P-am ino acid béo cấu thành từ 14-17 p h â n tử cacbon Iturin có hoạt tín h kháng nấm m ạnh ng khơng có h o ạt tính kháng khuẩn v kháng virus Iturin làm th ay đổi đ ặ c tín h thấm m àng dự a h ìn h th àn h lỗ dẫn ion (A randa v cs 2005) F en g y cin gồm fengycin A v B Đ ây phân tử có cẩu trúc m ột peptide vòng liên kết với m ộ t P-hydroxy acid béo cấu thành tò 16-19 phân từ cacbon F engycin có hoạt tính kh án g nấm sợi m ạnh (K oum outsi cs, 2004; H u v cs, 2007) S uríactin có cấu trúc m ột v ò n g peptide liên kết với m ộ t (3-hydroxy acid béo cấu thành tò 13-15 phân tử cacbon Surfactin m ột chất hoạt đ ộ n g bề m ặt với m ột số đặc tính sinh học k h ả làm thay đổi cấu trúc m àng tế bào tương tác với p h â n tử phospholipid H oạt động tư n g tác củ a suríactin bị bất hoạt lớp m àng kép sin h v ật có cholesterol D o vậy, m ức đ ộ m ẫn cảm tế bào với surfactin phụ thuộc vào h àm lư ợ ng sterol có thành tế bào (C arrillo v cs, 2003) Đ iều lý giải surfactin có có k h ả dung huyết, kháng virus, vi k h uẩn nh n g không kháng nấm (O ngena Jacques, 2008) Trong số loài vi k h u ẩn B a cillu s công bố, B a m yloỉique/acienss nhận quan tâm đặc biệt vi k h uẩn sản sinh nhiều loại lipopeptide tiêu diệt vi sinh v ật hại G iải m ã hệ gene chủng vi khuẩn B am yỉo liq u e/a cien ss FZB 42 cho thấy, 8,5% genom e củ a vi khuẩn m ang gene tham gia sinh tổ n g hợp lipopeptide C ác gene nằm n h ó m gene lớn (gene cluster) qui định tổng hợp N R P S (C hen v cs, 2009) G ần đây, nhiều chủng vi k h u ẩn B am ylolique/acienss phân lập từ vùng sin h thái có khả sản sinh lipopeptide diệt n ấ m công bố (A rgueỊles-A rias cs, 2009; A íreb o la v cs, 2010; B enitez cs, J2010; C h en v cs, 2010; A lvarez cs, 2012; N ihorim bere v cs, 2012; Y uan v cs, 2012; R om ano v cs, 2011) M ột sổ nghiên cứu 'đã tập trung vào tối ưu h ó a đ iều k iện lên m en v phư ng pháp tá c h ch iết lipopeptide từ m ột số chủng B a m ylolìque/acienss (M ezghanni v cs, 2012; Y uan cs, 2012) B am ylo liq u e/a cien ss đư ợ c Fukom oto phát vào năm 1943 n h khả sinh a-am y lase protease T ại thời điển đó, B am ylolique/acienss xem n h m ộ t dịng khác cùa lồi B su b tilis hay loài p h ụ B su b tilis subsp am ylolique/acìenss (Priest, e t al., 1987) Đên năm 1987, B am ylolique/acienss m ới đư ợ c tách thành m ột loài riêng dự a chứng số lai D N A 23% , 15% 5% so vớ i loài B subtilis, B lich en i/o rm is B pu m ilu s (Priest, et al., 1987) T đến nay, n h iều chủng B am ylolique/acienss p h â n lập từ hệ sinh thái khác n h a u vùng địa lý khác nh au công bố N ă m 2011, B o rriss et a l, chứng m inh khác biệt số lai D N A , chi số so sánh hệ gen bàng kỹ thuật m icro array (m icroarray - based com parative eenom ic h y b ridization), tín h tương đồng củ a toàn hệ genom e phổ chất hoạt tính lipopeptide v p o ly p ep tid e m ộ t nhóm B a m ylolique/acienss D SM khơng có khả năn g m ột nhóm B am ylo liq u e/a cien ss F Z B 42 có k h ả sống nội cộng sinh rễ thực vật D ự a vào kết q u ả th u đượ c, B orriss đề xuất tách B am ylo liq u e/a cien ss thành nhóm lồi p hụ B a m ylolique/acienss subsp p la n ta ru m (có khả sống nộ i cộng sinh rễ thực vật) v B a m vlolique/acienss subsp am ylolique/acienss (không có k h ả sơng nội cộng sinh rễ thực vật) (B orriss, et al., 2011) C hính khả sơng cộng sin h o n g rê vi sinh v ậ t năm o n g nh ó m vi sinh vật a n to àn G R A S, lipopepíide từ B am vlo liq u eía cien ss subsp plantarum xem ch ất an tồn có nhiều triển vọng ứng dụng diệt trừ n ấm gây bệnh T ài liệu tham khảo A lvarez F assóciated the cyclic sclerotinia C astro M , P rincipe A, B orioli G, F ischer s , M ori G & Jofre E (2012) The plantB acillus am yloliquefaciens strains M E P2 18 and A R P2 capabie o f producing lipopeptides iturin or surfactin and íen g y c in are e ữ e c tiv e in biocontrol o f stem rot disease J A p p l M icro b io l 112: 159-174 A rguelles-A rias A, O ngena M, H alim i B, Lara Y, B rans A, Jorỉs B & Fickers p (2009) Bacilliỉs am yIo liau efacien s G A I as a source o f p o ten t antibiotics and other secondary m etabolites for biocontrol o f plant pathogens M ìcrob C ell F act 8: 63 A e b o la E , Jaco b s R & K orsten L (2010) Iturin A is the principal inhibitor in the biocontrol activity o f B acillus am yloliquefaciens P P C B 004 against po sth arv est fungal pathogens J A p p l M ìc ro b io ỉ 108: 386-395 B enitez L B , V elh o R V , L isboa M P, M edina LF & B randelli A (2010) Isolation and characterizatio n o f antifungal peptides produced by B acillus am yloliquefaciens L B M 5006 J M ic r o b io ỉ 48: 791-797 B orriss R , C hen XH , R ueckert c , et al (2011) R elationship o f B acillus am yloliquefaciens clades asso c ia te d w ith strains D SM 7T and FZB 42T: a pro p o sal for B acillus am y lo liq u efacien s subsp am yloliquefaciens subsp nov and B acillus am yloliquefaciens subsp p la n ta ru m subsp nov based on com plete genom e sequence com parisons Int J S y st E vol M ic ro b io l 61: 1786-1801 C arrillo c , T eru el JA, Axanda FJ & O rtiz A (2003) M olecular m ech an ism o f m em brane p erm eab ilizatio n by the peptide antibiotic suríactin B iochim B iophỵs A cta 1611: 91-97 C hen L, W ang N , W ang X, H u J & W ang s (2010) C haracterization o f tw o anti-fungal lipopeptides produced by B acillus am y lo liqueíaciens SH -B 10 B io reso u r Technol 101: 8822-8827 -= ^ HOL C hen X H , K oum outsi A , Scholz R, e t aỉ (2009) G enom e analysis o f B acillus am y lo liq u efacien s F Z B 42 reveals its potential for b iocontrol o f p lan t pathogens J B io tech n o l 140: 27-37 F ravel D R (2005) C om m ercialization aríd im plem entation o f biocontrol A nnu R ev P h y to p a th o l 43: 337-359 10 H e ZL, Y a n g X E & S toffella P J (2005) T race elem ents in agroecosystem s and im pacts on the env iro n m en t J Trace E lem M e d B io l 19: 125-140 11 H u L tì, Shi Z Q , Z hang T & Y ang ZM (2007) F engycin antibiotics isolated from B-FS01 culture inhibit the grow th o f F usarium m oniliform e S heldon A T C C 38932 F E M S M icro b io l L e tt 272: 91-98 12 K oum outsi A , C hen X H , H enne A, et al (2004) Structural and íunctional characterization o f gene clusters directing nonribosom al synthesis o f bioactive cyclic lipopeptides in B acillus am y loliquefaciens strain FZB 42 J B a c te r ỉo ỉ 186: 1084-1096 M e zg h a n n i H , K hedher SB, Tounsi s & Z ouari N (2012) M edium optim ization o f aatiíìin g al activ ity prod u ctio n by B acilỉus am yloliqueíaciens using statistical experim ental design P re p B iochem B iotechnol 42: 267-278 14 M oyne A L , C leveland T E & T uzun s (2004) MolecuLạr characterization and analysis o f the operon e n co d in g the antiíungal lipopeptide bacillom ycin D F E M S M icro b io l Lett 234: 4349 15 N ih o rim b ere ỵ , C aw ov H , Seyer A, B runelle A, T honart p & O ngena M (2012) Im pact o f rhizo sp h ere factors on cyclic lipopeptide signature from the p lan t b e n e n cia ỉ sứain B aciìỉus am y lo liq u eĩacien s S499 F E M S M icrobiol E co l 79: 176-191 16 O n g en a M & lac q u e s p (2008) B acillus lipopeptid.es: versatile w eapons for plant disease biocọntrol Trends M ic ro b io ỉ 16- 115-125 17 P riest FG , G oodfellow M , Shute LA & B erkeley R C W (1987) B acillus am yloliqueíaciens sp nov nom rev Int J S y s t B acteriol 37: 69-71 18 R om ano A, V itullo D, D i Pỉetro A, L im a G & L anzotti V (2011) A ntiíungal lipopeptides írom Bacillus amyloliquefaciens strain B J N a í P ro d lA : 145-151 19 Souto G I, C o e a o s , M ontecchia M S, K e rb e r N L , Pucheu N L , B achur M & G arcia A F (2004) G enetic and íunctional ch aracterizatio n o f a B acillus sp strain excreting surfactin and an tifu n g al m etabolites partially id entified as iturin-like com pounds J A p p l M icro b io l 97: 1247-1256 20 Stein T (2005) B acillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific íim ctions M o l M ic ro b io l 56: 845-857 21 Y uan B , W ang z, Q in s, Z hao G H , F en g Y J, W ei L H & Jiang JH (2012) Study o f the antisapstain ủ in g u s activity o f B acillus am yloliquefaciens C G M C C 5569 associated w ith G inkgo b ilo b a and id entiíĩcation o f its active com ponents B ioresour Technol 114: 536-541 22 Y uan J, R aza w, H uang Q & Shen Q (2012) T h e ultrasound-assisted exừ actio n and id en tiíĩca tio n o f antiíungal substances from B am yloliquefaciens strain N JN -6 suppressing F u sariu m oxysporum J B asic M ỉc ro b io l 52: 721-730 23 Y uan J, Li B , Z hang N , W aseem R, S h e n Q & H uang Q (2012) Production o f bacillom ycinand m acro lactin -ty p e antibiotics by B acillu s am yloliquefaciens N JN -6 for suppressing so ilb o m e plant pathogens J A g r ic F o o d C hem 60: 2976-2981 17 - P h n g án p h ố i h ọ p v ó i tổ chức n g h iên cứu sở sản xu ất nước (nếu có) (Trình bày rõ phiccm g án p h o i hợp: tên tổ chức p h ố i hợp tham gia thực để tài nội dung công việc tham g ia đề tài, kể c s sản xu ấ t người sử dụng kết nghiên cứu; kh ả đóng góp nhân lực, tài chính, sở hạ tầng-nếu cố) 18 - P h n g án h ọ p tác quốc tể (nếu có) (Tìrình bày rõ p h n g án p h ổ i hợp: tên đối tác n c ngoài; n ộ i dung đ ã hợp tác- đối tác có hợp tác từ trước; nội d u n g cần hợp tác tro n g kh uôn kh ổ đề tài; hình thức thực P hân tích rõ lý cần h ợ p tác d ự kiến kết quà hợ p tác, tá c đ ộ n g hợp tác đ ố i với k ết Đ e tà i) 19 - T óm tắt kế hoạch lộ trình thực h iện ( L O G F R A M E ) ST T M ụ c tiêu Sản phẩm C c n ội dung, h o t đ ộn g chủ yếu Đ iều kiện thực D ự kiến kinh phí (Tr.đ) 1 K ế h oạch thự c T h ời ẹian (bẳt đầu, kết thúc) T hu th ập tài liệu, viết đề cư n g TS Trịnh T hành Trung 06/2013 Đ ề cương chi tiết Cá nhân, tổ chức thực hiện* - 07/2013 T uyển chọn chủng vi khuẩn B a m ylo liq u efaciens 01 chủng vi k h u ẩn B am yỉolỉque/acie ns sinh hoạt tính diệt nấm m ạnh n h ất - H oạt h ó s ch ủng vi khuẩn B am yloỉique/aciens Bảo tàng G iống chuẩn v s v v giống B acillus sensu lato 15 KS Hà Thị Hằng, TS Trịnh T hành Trung 07/2013 K S H Thi Hằng v CN N guyễn A nh Đào 01/2014 K S H Thị Hằng v CN N guyễn A nh Đào 03/2014 12/2013 - T nghiệm hoạt tính đối kháng loại nấm gây hại thực v ật F oxysporum , M oryzae B cinerea L ự a chọn chủng sinh chất kháng nấm m anh T ìm điều k iện ni cấy th ích hợp T hông sổ nuôi cấy n hư m ôi trư ờng, nguồn nitơ , nguồn cacbon, pH ban đ ầ u nhiệt độ n i cấy thích hợp - T ìm hiểu m trường, nguồn cacb o n nitơ thích h ợ p theo phư ng pháp nuôi cấy lắc 15 03/2014 - T ìm hiểu pH ban đầu n h iệt độ ni cấy thícK hợ p theo phư ng pháp ni cấy lắc T ìm điều k iện lên m en th ích hợ p T hông số lên m en n h tốc độ khuấy, tốc độ thơng khí v tỷ lệ giống cấy - T ìm hiểu thơng sổ lên m en n hư tốc độ khuấy, tốc độ thơng khí tỷ lệ giống cấy quy m lít 20 T c h chiết h iệu chất k háng n ấm dung m ôi h ữ u D ung m ôi hữu c tách chiết chất kh án g nấm - Tách chiết chất kháng sinh dung m có độ phân cực khác 15 ThS Trịnh Thi V ân Anh, TS Trịnh Thành Trung 06/2014 06/2014 07/2014 Tách chiết hiệu chất kháng nấm phương pháp L ự a chọn p h n g pháp tách chiết chất kháng nấm - So sáuh hiệu tách chiết chất kháng nấm sử dụng phương pháp chiết dung m ôi hữu cơ, đông khô, hấp phụ X A D -7 kết tủa chất kháng nấm pH thấp 20 07/2014 11/2014 - Đ ánh giá độ tinh chất kháng nấm qua phương pháp tách chiết 10 11 T inh chất kháng nấm P hư ng pháp tin h kỹ thuật H PLC - T inh chất kháng nấm kỹ thuật H PLC 20 X ác định chất sinh lý hóa chất kháng nấm C ác đặc tính lý h ó a chất kháng nấm X ác định tính bền nhiệt, bên pH , bên enzym e thủy phân v bền qua thòi gian bảo quản chât kháng nấm 20 Đ ánh giá tính an tồn dòng tế bào vero X ác định n g ỡ n g an toàn c ủ a ch ất kháng nấm - T nghiệm độc tính tế bào vero 15 X ác đ ịn h Đ ánh giá tính an ngư ỡ ng an tồn tồn t r ê n củ a chất kháng nảy n ấm m ầm hạt V iết báo cáo B áo cáo - T nghiệm nảy m ầm hạt lúa, ngô v lạc nồng độ M IC 10 Tổng kết kết viết báo cáo ỉ KS N guyễn M anh H ùng, TS T rịnh T hành Trung ThS T rịnh Thị V ân A nh, TS T rịnh T hành Trung TS Trịnh T hành Trung TS T rịnh T hành T rung TS T rịnh T hành Trung * G hi nhữ ng nhân có tên M ục 10 nghiên cứu sinh, học viên cao học tham gia 10 12/1014 02/2015 02/20 ỉ 04/2015 02/2015 04/2015 02/2015 05/2015 05/2015 111 HÌNH THỬC SẢN PỈLẢM KHOA HỌC CỦA ĐÈ TÀI 20 C ấu trú c d ự k iến báo cáo kết đề tài Đ ặ t v ấ n đề C h n g 1: T ổ n g quan tài liệu C hưcm g 2: P h n g pháp nghiên cứu C h n g 3: K ết q u ả thảo luận 3.1 T uyển ch ọ n chủng vi khuẩn B am ylolique/aciens sin h chất kháng nấm m anh • T rìn h bày g kết q 15 chủng B a m ỵlo lique/aciens phân lập nguồn khác n h a u có k h ả năn g kháng lại loài nấm hại phổ b iến F oxỵsporum , M 0ỉy za e v B cinerea • Đ ánh giá hoạt tín h kháng sinh chủng, lựa chọn a m ylo lỉq u e/a cien s sinh hoạt tính diệt nấm m ạnh chủng vi kh u ẩn B 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp quy mơ lít cho vi khuẩn B a m ylo ỉiq n e/a cien s sin h chất kháng nấm cao • T rìn h bày bảng kết q u ả v ề m ô i trư ờng, nguồn cacbon, n g u n nitơ , pH m ôi trư n g nuôi cấy ban đầu v nhiệt độ nuôi cấy tối u n cho vi k h uẩn sản sinh hoạt tín h diệt nấm cao nhẩt • T rin h bày bảng kết tốc độ khuấy, tốc độ thông, tỷ lệ giống cấy khởi động th ích hợp cho vi khuẩn sản sinh hoạt tính diệt nấm cao nhẩt 3.3 Nghiên cứu phương pháp tách chiết hiệu chất kháng nấm • Trình bày bảng hiệu tách chiết dung môi phân cực khác • Đ án h giá lũ ệu tách chiết v m ức độ tinh phư ng pháp sử dụng dung m ôi h ữ u cơ, đ ô n g khô, hấp p h ụ X A D -7 v kết tủa chất kh án g sinh pH thấp 3.4 T inh x ác định chất củ a chất kháng sinh diệt nấm • Trình bày phương pháp tinh chất kháng nấm kỹ thuật HPLC • Trình bày đặc tính sinh hóa lý chất kháng sinh 3.5 Đánh giá tính an tồn chế phẩm diệt nấm • T rin h bày bảng an toàn củ a chế phẩm nồng độ hạt lúa, ngô lạc nảy m ầm • Trình bày bảng an tồn chế phẩm dòng tế bào vero 11 C h n g 4: K ế t lu ậ n v kiến n g h ị T ài liệu tham khảo Phụ lục 21 B ài báo, báo cáo, sách ch uyên khảo: Số báo đăng tạp chí quốc gia: 02 Số báo đăng tạp chí quốc tế: Sổ báo cáo k h o a h ọc, hội nghị khoa học nước: Số báo cáo kh o a h ọc, hội nghị khoa học quốc tế: Sách chuyên khảo v sản phẩm khác dự k iến công bố: Chi ( dự k iế n ) (Tạp chỉ, N h x u ấ t bản) N ghiên cứu điều k iện lên m en dịch thể cho chủng vi khuẩn B am ylo ỉiq u e/a cien s sinh hoạt tín h kháng nấm hại Tối ưu hóa m ôi trường, nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH m ôi trưcmg ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, tốc độ khuấy, tốc độ thổi khí tỷ lệ giống cấy T ạp chi K hoa học T ự nhiên C ông nghệ, N X B Đ H Q uốc gia Tác giả Đ ặc tín h sin h hóa lý chất kháng nấm sản sinh từ chủng vi k h u ẩn B a m yloỉique/aciens - T inh chất kháng sinh diệt nấm T ạp chí K hoa học T ự n h iên v C ông nghệ, N X B Đ H Q uốc gia Tác giả T ên sản phẩm D ự kiến n o i côn g bố N ội dung, yêu cầu khoa học cần đạt ST T - X ác định tín h bền n h iệt, bền pH , bền enzym e thủy phân v bền theo thời gian chất kháng sinh 22 P h n g pháj3; T iêu chuẩn; Q uy phạm ; Phần m ềm m áy tính; B ản v ẽ th iết kế; Q uy trình cơng nghệ; S đo, đồ; s ố liệu, C sở d ữ liệu; Báo cáo phân tích; T ài liệu d ự báo (phương pháp, quy trình, m ô hình, )', Đ ê án, qui hoạch; L uận ng kinh tê-kỹ thuật v sản phâm khác STT T ên sản phẩm Y câu k h o a học G hi ( dự k i ế n ) 1 C hủng B amylolicỊueýaciens sin h chất kháng nấm hại H oạt tính kháng sinh m ạnh số chủng lựa chọn chủng 23 Sản ph ẩm côn g nghệ M ẫu (m odeỉ, m aket); Sản phẩm (ỉà h n g hố, tiêu thụ thị trường); V ật liệu; T hiết bị, m áy m óc; D ây ch u y ền công nghệ loại khác; , D ự kiến số M ứ c chât lư ợ n g cân đạt Đcra T ền sản phẩm cụ STT lượng/quy m ô sản thể v tiêu chất v ị đo M ầu tư n g tự (theo tiêu phẩm tạo lư ợ n g chủ yếu chuẩn m ói nhất) sản phẩm Thế giới Trong nước 12 ỉ Chế phẩm diệt nấm hại ừồng iV[IC 500 lít 24 Sản phẩm dự kiến đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp, giải pháp hữu ích, sáng chế 25 Sản phẩm đào tạo STT Cấp đào tạo Số lượng Nhiệm vụ giao liên quan đến đề tài Ghi (Dự kiến kinh p h í) Đ.vị: Tr đồng - Tiến sỹ - Thạc sỹ 01 - Tách chiết chất kháng nấm - Tinh chất kháng nấm - Xác định tính chất sinh lý hóa chất kháng nấm - Thử tính an tồn chế phẩm trồng, tế bào vero chuột - Cử nhân - Hoạt hóa vi khuẩn 01 - Thử hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh - Thử nghiệm tính an tồn chế phẩm hạt nảy mầm 26 Các sản phẩm khác ( Ghi rõ : H ợp đồng, chínk sá ch ) IV KHẢ NĂNG ỦNG DỤNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA KÉT QUẢ NGHIÊN c u 27 - Khả ứng dụng kết nghiên cứu 27.1 K ứng dụng lĩnh vực đào tạo, nghiên cứu khoa học & công nghệ, sách, quàn ỉý - Đào tạo 01 cử nhân 01 thạc sỹ chuyên nghành vi sinh vật học 27.2 Khả ứng dụng thực tiễn (phát triển kinh tế -XH, sản xu ấ t hàng hỏa ) - Sản xuất chê phẩm diệt nấm an tồn nhằm ứng đụng cho phịng trừ bệnh nấm hại 27.3 K liên doanh liên kết với doanh nghiệp ừ-ình nghiên cứu 28 - Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết đề tài - Từ kết tách chiết chất kháne sinh thành phẩm qui mô nhỏ, chất kháng sinh có hiệu tiêu diệt nấm gây bệnh cây, không gây độc ừên loại thử nghiệm ià tiền đề cho thử nghiệm hiệu chất kháng sinh đồng ruộng 29 - Tác động lọi ích mang lại kết nghiên cứu 13 29.1 Đ ôi v i lĩnh vực K H & C N cỏ liên quan ( Nêu d ự kiến đ ó n g góp vào lĩnh vực khoa học cổ n g nghệ tro n g nước quốc tế, đ ó n g g óp mới, m h n g ngh iên cứu m ới thông q u a c ô n g trình cơng bo ngồi nước) - ứ n g dụng đư ợ c ph n g pháp phân loại ch ín h xác nhóm vi khuẩn loài B am ylo liq u e/a cien s d ự a vào việc ứng dụng kỹ thuật giải trình tự đa gene - T ạo tiề n đề cho n g h iên u chất hoạt tín h lipopeptide diệt nấm hại từ vi sinh vật, sờ đ ể phát triển k ỹ th u ật sản xuất thuôc trừ sâu hệ m ới V iệt N am 29.2 Đ oi vớ i kinh tế - x ã h ộ i bảo vệ m ô i trư ng (N n h ữ n g tác đ ộ n g d ự kiến cùa k ết nghiên cứu đổ i vớ i x ã h ộ i:đ ó n g góp cho việc xâ y dựng c h ủ trương, sách, p h p lu ậ t có tác đ ộ n g làm chuyển biến nhận thức x ã hội, s ự p h t triển kỉnh tế x ã h ộ i b ảo vệ m ôi trường) - L ip opeptide ch ất có k h ả diệt nấm hại trồ n g v có thời gian bán hủy nhanh Vì vậy, sản xuất chất kháng sinh diệt nấm góp phần vào giảm thiểu ô nhiễm môi trường tàn dư thuốc hóa học sản phẩm nơng nghiệp - G iúp n h k h o a học V iệt N am chủ động tiếp cận với ph n g pháp sản xuất chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật Qua đó, giảm số lượng nhập sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật ngoại nhập 29.3 Đ oi vớ i tổ chức chủ trì s ứ ng d ụ n g k ết q u ả nghiên cứu ( Đ ối với cá c đơn vị tổ c h ứ c thuộc Đ H Q G ý t i : n â n g cao trình độ, lự c cán khoa học, cán g iả n g dạy, cán quản l ý ; tă n g cư ng thiết bị) - C án nghiên cử u có điều k iện tiếp cận với ph n g pháp nghiên u tách chiết, tinh sản xuất chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật - T ận dụng trang th iết bị N h nư c đầu tư cho V iện 29.4 K inh p h í ng u n lự c khác m đề tài có th ể đem lại 14 V K IN H P H Ỉ T H Ự C H IỆ N Đ Ề T À I - Tổng kinh p h í thự c đề tài: 160.000.000 (M ột trăm sáu m ươi triệu đồng) - Phân bổ kinh phí: Đơn vị tính: Triệu đồng TT Nội dung Kinh phí Năm thứ 1 Xây dựng đê cưcmg chi tiêt Thu thập viết tổng quan tài liệu Năm thứ 2 T hu thập tư liệ u (m ua, thuê) D ịch tài liệ u th am khảo (sô trang X đ n giá) V iết tống q u an tư liệu Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, nghiên cứu 45 30 45 30 29,2 28,8 C hi phí tàu x e, c n g tác phí Chi phí th u ê m n C hi phí h o t đ ộ n g chun m ơn Chi phí cho đào tạo (C h ìp h í th m ướn NCS, học viên cao học Phù hợp với mục 25) Thuê, mua săm trang thiêt bị, nguyên vật liệu T huê trang th iê t bị M ua trang th iê t bị M ua ng u y ên v ậ t liệu, cây, 12 Hội thảo khoa học, viết báo cáo tổng kết, nghiệm thu Hội thào V iêt báo cáo tồng k êt K iêm tra tiê n độ giữ a kỳ Chi khác 3,8 9.2 M ua văn p h ò n g phâm 2,6 " Chủ trì đê tài (1 X tháng) 15 Q uản lý phí 1,2 1,2 Tơng kinh phí 80 80 N gày 24 tháng 06 năm 2013 Ngày 24 tháng 06 năm 2013 Ngưòi viết thuyết minh đề cương (Họ, tên, chữ ký) Thủ trưởng Đơn vị (Ký, đóng dấu) VIỆN TRƯỞNG g Văn Họp Trịnh Thành Trung PHÊ DUYỆT CỦA GIÁM ĐỐC ĐHQGHN TL Giám đốc Trưởng ban Khoa học Công nghệ PH Ụ LỤC - Giải trinh kinh phí khoản chi ST T Nội dung Kinh phí Tông ( T r đ ) Xây dựng đề cương chi tiết Thu thập viêt tông quan tài liệu Giải trinh (Số ỉưcmg, đơn giá, thành tiền) đê cương X = triệu Căn ( D ựa vào văn nào) Thông tư 44/2007/T TLT-BTCBKHCN Thu thập tư liệu (mua, thuê) Dịch tài liệu tham khảo (sổ trang X đơn giá) Viết tống quan tư liệu Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập số liệu, nghiên cứu 75 Chi phí tàu xe, cơng tác phí Chi phí th mướn Chi phí hoạt động chun mơn chun đê X 30 triệu chuyên đề X 15 triệu 75 Chi phí cho đào tạo (C hi p h í thuê m ớn NC S, học viên cao h oc P hù hơp vớ i muc 25) T h u ê , m u a sắ m trang th iế t bị, 58 nguyên vật liệu T huê a n g thiết bị Mua ữang thiêt bị - Hóa chât ni = 20 triệu - Dune mơi hữu hóa M u a n g u y ê n vật liệu, cây, chất tách ch iết = triệu - loại enzyme thủy phân = 16 triệu - Dụng cụ tiêu hao = triệu 17 Thông tư 44/2007/T TLT-BTCBKHCN H ộ i th ả o k h o a h ọ c , v iế t b o eáo tổug k ế t, nghiệm thu X báo cáo = t r i ệ u 12 T hông tư 44/2007ÍT T L T -B T C BKHCN H ội thảo V iết báo cáo tổng k ết N ghiệm thu Chi k h c 13 M ua văn p h ò n g p h â m 4,6 G iây in, b ú t viêt, dán nhãn C hủ trì đề tài (1 X tháng) Q uản lý phí 2,4 In báỡ -cáQ , p h o to tài liệu, m u a tài liêu 1,5 % tổ n g kinh phí T n g kinh phí 180 PHỤ LỤC - Chi tiết mua nguyên v ậ t liệu, cây, STT Tên hàng ĐVT Số lượng Đơn giá Thành tiền (VNĐ) (VNĐ) Hóa chât ni Thạch kg 500.000 1.000.000 Cao nâm men kg 4.400.000 4.400.000 Cao thịt kg 3.600.000 7.200.000 D-glucose kg 800.000 2.400.000 Fructose kg 450.000 900.000 NH4 NO kg 980.000 980.000 N aN 03 kg 820.000 820.000 Urea kg 780.000 780.000 (NH4)2SƠ4 kg 760.000 760.000 K2HPO4 kg 760.000 760.000 5 _ Hóa chất tách chiết tinh chất kháng sinh n-Hexane lít 11 790.000 790.000 Isopropyl Ether lít 550.000 550.000 n-Butanol lít 460.000 460.000 Ethyl acetate lít 420.000 420.000 10 A ceíone lít 520.000 520.000 11 E thanol lít đ"S 1.250.000 2.500.000 12 M ethanol lít 520.000 2.080.000 13 A cetonitrile lít 1.200.000 4.800.000 Kg nyjy~S 10.800.000 5.409.000 lít 740.000 1.480.000 14 15 X À D -7 HC1 Enzyme thủy phần nghiên cứu đặc tính sinh học chất kháng sinh 18 16 Pepsin Lọ 3.600.000 3.600.000 17 T rypsin Lọ 3.100.000 3.100.000 18 P roteinase K Lọ 4.600.000 4.600.000 19 Lipase Lọ 2.900.000 2.900.000 20 A m ylase Lọ 1.800.000 1.800.000 D ụ n g cụ tiêu hao 21 Ong e p p e n d o rf 1,5 m l Túi 250.000 1.250.000 22 Đ âu típ 100 |il Túi 270.000 540.000 23 Đầu típ 1000 Ịil Túi 270.000 510.000 24 Ong F an co l 15 m l Túi 220.000 440.000 25 Ong F an co l 50 ml Túi 260.000 260.000 T ơn g cộng 49.000.000 Chủ trì đề tài T rịnh T h ành T run g 19 TÓ M T Ắ T BẰ NG T IẾ N G A N H KẾT QUẢ D ự K IẾN CÙA Đ Ề TÀ I K H CN SU M M A R Y P r o je c t title: Study on ferm entation conditions and extraction protocols for production o f antiíiingal agents produced from Bacillus am yỉoỉique/aciens Code number: Project leader: Dr Trinh Thanh Trung M a n a g in g In s titu te : Institute o f M icrobiology and B iotechnology C oop eraíin g Institute: D uration: írom June, 2013 to M ay, 2015 O b jectiv es: • To produce antiíungal preparation from B am yloỉique/aciens (M IC > 500) Main Contents: • Screen for antifungi-producing B am ylolique/aciens from B acillus collection at Vietnam Type C ulture C ollection • Stúdy on ferm entation conditions for antiíụngal production at - litter scale • E valuation o f efficient techniques for extraction o f antiíungal agents from fermented broth • D eterm ination o f physical and biochem ical characteristics o f the antifungal agent • D eterm ination o f safety and eíĩiciency o f the antiíungal agent R e su lts: • A ntiíìingal preparation w ith M IC above 500 • A m aster student • Tw o papers published in national joum als Signature Trinh T hanh Trung ... vị công tác Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Vai... kiện lên men thu chất kháng khuẩn kháng nấm, nhiệt độ 30°c lựa chọn nghiên cứu Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng định đến sinh trưởng hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật Trong nghiên cứu. .. Sacchciromyces cerevisiae Bộ giống chùng vi sinh vật kiểm định lưu giữ Bào tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Vi? ??n Vi sinh vật Công nfihệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Xác định khả sinh enzym e ngoại