TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH KHOA CN HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM  BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG MÃ HP: 162ENMI327010 NHĨM THỰC HIỆN: Nhóm HỌC KỲ: II NĂM HỌC: 2016-2017 GVHD: TS Nguyễn Mỹ Linh Tp Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 05 năm 2017 ĐIỂM: HỌ TÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN NHẬN XÉT CỦA GV ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ………………………… ……………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… GV kí tên Thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường MỤC LỤC Mục lục… Bài 3: Chuẩn bị Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật…………………….4 Bài 4: Các phương pháp phân lập vi sinh vật……………………………….…… Bài 5: Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật………………………………………………11 Bài 6: Các phương pháp nhuộm màu quan sát hình thái vi sinh vật……… 14 Bài 7: Tổng số vi sinh vật hiếu khí…………………………………………….…20 Bài 8: Phương pháp kiểm tra tổng coliformtrong nước thải…………………… 24 Bài 9: Kiểm tra E coli nước thải………………………………………… 28 Bài 3: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NÔI CẤY VI SINH VẬT Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG Các chất dinh dưỡng chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường Người ta dựa vào sở khác để phân loại môi trường: - Theo thành phần nguồn gốc: môi trường tự nhiên, môi trường tổng hợp môi trường bán tổng hợp; - Theo tính chất lý học: mơi trường lỏng, mơi trường đặc môi trường môi trường bán lỏng; - Theo công dụng: môi trường môi trường chọn lọc NGUYÊN TẮC Thao tác phải cẩn thận, thực lửa đèn cồn Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác Agar mơi trường ni cấy vi sinh đóng vai trò "giá đở" Nếu nhiều q q có ảnh hưởng đến q trình ni cấy Khử trùng mơi trường dinh dưỡng nhằm mục đích: - Tiêu diệt tồn vi sinh vật ngoại lai diện môi trường - Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết phân lập, ni cấy xác Sau khử trùng môi trường phải đảm bảo số điều kiện sau:  Khơng làm biến tính mơi trường, khơng làm biến tính số chất mơi trường  Sau khử trùng , môi trường không sản sinh chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy  Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khử trùng  Bảo đảm an toàn người sử dụng Nơi cất giữ môi trường phải thuận tiện cho việc theo dõi, sử dụng bảo quản PHƯƠNG PHÁP - Phương pháp thực hiện: Làm thạch nghiêng; Đổ đĩa petri - Phương pháp khử trùng: autoclave (121oC) CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM a Chuẩn bị mơi trường Cân xác thành phần môi trường: - Saccharose or Maltore: 10gr - KH2PO4: 0.6gr - Agar: 4gr - Pepton: - MgSO4: - Nước cất: 2gr 1gr 200ml Cho hỗn hợp vào bình tam giác có chứa 200 mL nước cất, khuấy tan hỗn hợp Sau đậy kín miệng lại nút bọc giấy bạc Hấp tiệt trùng 121 oC b Chuẩn bị dụng cụ: Làm nút bơng cho ống nghiệm, gói giấy báo đĩa petri ống nghiệm Sau cho vào tủ sấy c Phân phối môi trường vào dụng cụ vào dụng cụ: Thao tác lửa đèn cồn, trình làm cẩn thận tránh để mơi trường rơi ngồi - Mơi trường cần đun cho hóa chất lỏng cho vào dụng cụ - Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường - Tay phải kẹp nút bơng kéo - Nhanh tay rót mơi trường vào dụng cụ đậy nút lại Ống nghiệm thạch nghiêng: Cần tiến hành sau khử trùng môi trường kết thúc môi trường chưa đông đặc Đổ thạch vào đĩa petri: Tồn qui trình đổ thạch vào đĩa petri thực lửa đèn cồn Chú ý: Thao tác khẩn trương khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn Mặt thạch phải phẵn, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm Thơng thường ¼ lít mơi trường phân phối 22 25 đĩa petri Sau phân phối môi trường vào dụng cụ, chờ thạch đông lại, đem ủ tủ ủ 35oC từ - ngày KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mơi trường sau phân phối vào dụng cụ: Môi trường sau ủ ngày: NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Sau ủ tủ ủ ngày, lấy quan sát kết ta thấy: Trong số nghiệm chứa mơi trường có ống nghiệm vơ khuẩn ( mơi trường khơng thay đổi so với trước ủ) đạt chuẩn có ống nghiệm có vi sinh phát triển Nguyên nhân nhiểm khuẩn: q trình thao tác cách xa lửa đèn cồn, tay chưa vệ sinh cồn cách Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG: Phân lập vi sinh vật q trình tách rời lồi vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Trong thiên nhiên hay vật phẩm nghiên cứu, vi sinh thường tồn dạng hỗn hợp nhiều loài khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, lý hóa úng dụng vào đời sống thực tiễn lồi cần phải đưa dạng khiết NGUYÊN TẮC: Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng cho loại khuẩn lạc riêng rẻ, cách biệt PHƯƠNG PHÁP - Phương pháp cấy ria - Phương pháp đổ đĩa -` CÁCH TIẾN HÀNH: Gồm ba bước sau: Bước 1: Tạo khuẩn lạc riêng rẻ từ quần thể vi sinh vật ban đầu Bước 2: Phân lập vi sinh vật khiết Bước 3: Kiểm tra độ tinh khiết cảu khuẩn lạc Chú ý: Nếu mẫu ban đầu dạng rắn cần đưa dạng lỏng để phân lập cách tiến hành bước sau - Nghiền mẫu - Hòa tan mẫu nước cất vơ trùng - Pha lỗng mẫu ỏ nồng độ thích hợp - Cấy mẫu mơi trường đặc trưng Để có chủng chủng cần tiến hành lập lại nhiều lần kĩ thuật tiến hành pha loãng đồng khuẩn lạc xuất môi trường a Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: (Phương pháp cấy ria) - Hơ đỏ que cấy, làm nguội lấy đầy que cấy vòng vi sinh vật cần phân lập - Nghiên hở Petri Dùng que cấy gạch đường song song phần a hộp Petri - Hơ đỏ que cấy, làm nguội gạch đường song song phần b đĩa Petri - Hơ đỏ que cấy, làm nguội gạch đường song song phần b đĩa Petri - Lật ngược hộp Petri có chứa vi sinh vật cho vào tủ ấm 35 độ C 24 đến 48h Phương pháp cấy ria b Phương pháp trải đĩa: - Dùng Pipetman đầu típ vơ trùng, thao tác vô trùng chuyển 0.1 ml dịch chứa vi sinh lên bề mặt môi trường đĩa Petri - Nhúng que trang vào cồn hơ lữa đèn cồn để khử trùng, để nguội lữa đèn cồn - Mở nhẹ nắp Petri, dùng que trang nhẹ nhàng trãi mẫu khắp mặt thạch - Rút nhanh que trang khỏi đĩa, đậy đĩa gói đãi đem ủ nhiệt độ thời gian thích hợp c Phương pháp đỗ đĩa - Dùng pipetman đầu típ vơ trùng đưa ml dung dịch mẫu pha loãng lên bề mặt đĩa petri - Đỗ khoảng 10 -15ml môi trường vào đĩa (chú ý để nguội mơi trường đến nhiệt độ thích hợp để tránh gây sốc nhiệt cho vi sinh vật) - Xoay nhẹ đĩa Petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa Petri để đông tự nhiên đem ủ nhiệt độ thích hợp KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM: Sau ủ 24h, kết thể qua hình ảnh sau: - Phương pháp cấy ria - Phương pháp trãi đĩa , đổ đĩa: NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM a Nhận xét: Trong phương páp cấy ria có tượng nhiễm khuẩn Qua hình ảnh cho thấy số lượng VSV có mẫu nhiều, chúng thể qua việc mọc với mật độ nhiều môi trường hai phương pháp b Bàn luận: Trong q trình khử trùng, mơi trường khử trùng không đạt yêu cầu Trong thao tác thực lửa đèn cồn không cẩn thận gây nhiễm BÀI 5: KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG 10 Bước 2: Nhuộm tiêu Crytasl Violet ( Getian violet) phút Bước 3: Nhuộm lugol phút ( rửa nước không) Bước 4: Rửa nước, tẩy cồn phút, rửa nước Bước 5: Nhuộm Fuschin (Safanin) phút, rửa nước, để khô Bước 6: Nhỏ dầu, quan sát vật kính (x 100) - Tiêu đem quan sát 16 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM a Tiêu tạm thời nhuộm màu Nấm men ( vật kính x10) Nấm men ( vật kính x40) 17 Dưa chua( vật kính X10) Dưa chua (vật kính x40) 18 b Tiêu cố định: Nấm men ( vật kính x100) NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ Nhận xét: - Ở tiêu tạm thời nhuộm màu nấm men quan sát hình thái VSV rõ nét - Ở tiêu tạm thời nhuộm dưa chua hình thái VSV quan sát không rõ - Ở tiêu cố định ta quan sát Nấm men Dưa chua khơng thấy kết Bàn luận kết quả: - Số lượng nấm men cao, bước thực làm tiêu xác sử dụng kính hiển vi thành thạo nên cho kết rõ nét - dưa chua số lượng VSV dưa chua thấp, q trình thực nhiều sai sót nên không đạt kết mong muốn Bài 7: 19 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG Việc đếm tổng số vi sinh vật cung cấp phương tiện tiêu chuẩn để xác định mật độ vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí kị khí, tùy tiện nước Có phương pháp loại môi trường để xác định tiêu Kỹ thuật đếm đĩa tế bào dị dưỡng phương pháp tốt xác định thành phần vi khuẩn tổng quát có mẫu nước, để đánh giá hiệu nhà máy xử lí nước, tăng trưởng sau vi khuẩn đường ống, nguồn nước v v PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp đổ đĩa: Đầu tiên xem phương pháp đếm tiêu chuẩn Nhược điểm: hạn chế số lượng tối đa vi khuẩn môi trường nhiệt độ ủ thời gian xét nghiệm ( nhiệt độ mơi trường 44-46 0C gây sốc nhiệt cho vi khuẩn ) Mơi trường giàu dinh dưỡng làm giảm phát triển vi khuẩn thiếu dinh dưỡng Kỹ thuật cãi tiến khắc phục hạn chế Phương pháp trải đĩa: Không bị sốc nhiệt nhiệt độ thạch Thêm vào đó, tất khuẩn lạc mọc mặt thạch nhìn thấy đếm dễ dàng dễ phân biệt khuẩn lạc riêng biệt bong bóng khí Kỹ thuật có hạn chế sử dụng mẫu thể tích nhỏ: 0.1 – 0.5 ml phụ thuộc vào khả hấp phụ thạch MÔI TRƯỜNG Trytone glucose extract agar: dùng cho phương pháp đỗ đĩa trãi đĩa pH chỉnh 6.8-7.0 Sau khử trùng 1210C 15 phút Place count agar: dùng cho phương pháp đổ đĩa trãi đĩa pH chỉnh 7.07.2 Sau khử trùng 1210C 15 phút R2A: dùng cho phương pháp đỗ đĩa, trải đĩa màng lọc Môi trường không dạng dehydrate mà phải chuẩn bị theo thành phần theo công thức môi trường Điều chỉnh pH đến 7.2 K2HPO4 KH2PO4 dạng rắn trước thêm agar khử trùng 1210C, 15 phút CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 20 Chuẩn bị môi trường plate count agar: khử trùng đun nóng chảy agar mơi trường khử trùng trữ lạnh( pha 3.6g môi trường 150ml nước cất) Chuẩn bị nước cất khử trùng Khử trùng dụng cụ: pipette, petri Pha loãng mẫu nước thải 21 Hút vào petri khử trùng 1ml mẫu pha loãng, độ pha loãng chuẩn bị petri (thao tác vơ trùng đèn cồn) Ghi kí hiệu độ pha loãng lên petri Thực độ pha loãng cho mẫu ( 10-4;10-5;10-6;10-7) Sau để nguội mơi trường khoảng 35-40 0C, rót vào petri chứa mẫu petri khoảng 10ml môi trường Xoay nhè nhẹ petri, tránh không để môi trường tràn ngồi phân bố vi sinh vật có mẫu Chờ thạch đóng cứng lại, lật ngược petri ủ 300C-350C Sau 24-72h đếm khuẩn lạc riêng lẽ quan sát KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mẫu sau ủ 300C-350C khoảng 24-72h Trải đĩa: độ pha loãng 10-7: 31 22 Đổ đĩa: độ pha loãng 10-6: 468 A Trãi đĩa: A Đổ đĩa: 31  3,1.108  CFU / g  7 1.1.10 468  4,68.10  CFU / g  1.1.106 NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Tiêu chuẩn cho phép tổng số VHKH nước sinh hoạt 100(CFU/g) Cho thấy mẫu nước cần xử lý muốn đưa vào sử dụng sinh hoạt Trong nồng độ pha loãng gồm đĩa petri mang ủ có đĩa đạt yêu cầu Tỉ lệ thấp so với yêu cầu Nguyên nhân đĩa bị nhiễm khuẩn q trình đổ mơi trường lấy mẫu nước thải pha loãng vào đĩa BÀI 8: 23 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COIFORM TRONG NƯỚC THẢI Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG Coliforms trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả lên men Lactose sinh acid sinh 37 oC 24-48 Nhóm Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay mẫu môi trường dùng để thị khả diện loài vi sinh vật gây bệnh khác Khi số Coliforms thực phẩm cao khả diện vi sinh vật gây bệnh cao Nhóm Coliforms gồm giống là: Escherichia với loài E coli, Citrobacter, Klebsiella Enterobacter Coliforms gồm nhóm: Coliform chịu nhiệt Coliforms phân NGUYÊN TẮC Mẫu pha loãng thành dãy thập phân, nồng độ khác 10 lần Mẫu ủ môi trường thích hợp có ống durham Mỗi nồng độ pha loãng lặp lại – ống Theo dõi sinh ống nghiệm Xác định ống dương tính nồng độ pha lỗng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm VSV tương ứng diện 1g (hoặc 1ml) ban đầu PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp MPN (Most Pobable Number – Phương pháp có xác suất cao nhất, phương pháp pha loãng tới hạn) CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM a Chuẩn bị mơi trường: Mơi trường Lauryl Tryptose: Cân 3,56 gr cho vào 100ml nước cất (mơi trường có màu vàng) Mơi trường Briilian Green Bile Lactose Broth: Cân 4,00 gr cho vào 100ml nước cất (mơi trường có màu xanh lục) b Pha lỗng mẫu: 24 Chuẩn bị ống nghiệm có đánh số, ống chứa 9ml nước cất khử trùng Cho 1ml mẫu nước vào ống 10-1, sau pha lỗng đến 10-5 c Nuôi cấy Nuôi cấy mẫu môi trường Laury Trytose (LT) nồng độ: 10 -3, 10-4, 105 , ống nghiệm /nồng độ; 1ml dịch pha loãng /ống LT Ủ 37oC 24h Sau 24h, lấy ống nghiệm chứa môi trường LT quan sát kết quả, xem ống dương tính ( mơi trường đục ống chng có bọt khí ống chng) cấy chuyển sang ống BGBL, ủ 37 oC 24h 25 Sau 24 giờ, lấy ống BGBL quan sát Lập tỉ lệ BGBL + nồng độ liên tiếp Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng Ống BGBL+ : môi trường đục ống chuông có bọt khí ống chng Ống BGBL - : Khơng có tượng Tính tốn kết KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Trong 24 ủ mơi trường LT: có ống dương tính nồng độ 10-3 10-5 26 Sau 24 cấy chuyển sang ống BGBL, ta quan sát có ống BGBL dương tính NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Tra bảng MPN ta có số MPN tương ứng với số ống nghiệm đạt chuẩn Vậy, Tổng số Coliforms = số MPN*10n =4*103 = 4000 (CFU/ml) (n: số nguyên dương nồng độ pha lỗng nơi cấy) Nhận xét: tỉ lệ ống dương tính khơng cao q trình ni cấy bị nhiễm khuẩn 27 Bài : KIỂM TRA E.COLI TRONG NƯỚC THẢI Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG Escherichia Coli (E Coli) dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển 44 độ C, sinh Indol, sinh axit, không sinh Axeton không sử dụng Citrat để làm nguồn Cacbon Mật độ E Coli vi khuẩn đường ruột dung để thị mức độ vệ sinh trình chế biến , bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống để thị ô nhiễm mẫu môi trường NGUYÊN TẮC Trong môi trường E.C Broth, E Coli bị kích thích sử dụng đường Lactose, E Coli phân hủy đường Lactose sinh Axit sinh Lượng khí sinh q trình kiểm chứng ống Durham ( Sẽ có lượng khí xuất bên ống Durham, làm nỗ iống Durham lên, thể tích khí 1/10 thể tích ống Durham) Trong mơi trường Endo Agar, chủng Coliform hình thành khuẩn lạc đỏ E Coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim Trong mơi trường E.M.B Agar, E Coli có khả mọc mơi trường thạch từ tốt đến tốt, có đặt điểm nhận dạng có tâm đen, màu tím có ánh kim PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Quy trình ni cấy E Coli tiến hành phương pháp đổ đĩa trãi đĩa môi trường Endo Agar CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Bước 1: Pha lỗng mẫu:Sử dụng ống BGBL dương tính Bước 2: Chuẩn bị môi trường: Cân 8,30 gr môi trường cho Erlen, cho thêm 200ml nước cất và khuấy môi trường tan gần hết Đem hấp tiệt trùng môi trường nồi hấp áp suất 2h 28 Bước 3: Chuẩn bị đĩa chứa môi trường hấp tiệt trùng Bước 4: Thực trải đĩa đỗ đĩa với 0.1ml mẫu phương pháp Bước 5: Đem ủ mẫu 35oC 24 đến 48h Bước 6: đếm số lượng khuẩn lạc E.coli có mẫu KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM: Sau ủ 44 độ C 48h số lượng E Coli đếm đc sau: - Ở nồng độ pha loãng 10-4 :A >2,5.10-5 CFU/g - Ở nồng độ pha loãng 10-5 : A >2.5.10-6 CFU/g 29 - Ở nồng độ pha loãng 10-6 : A= 61 CFU/g - Ở nồng độ pha loãng 10-7: A= 46 CFU/g NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM - Nhận xét: Kết phán ánh mật độ E Coli xuất mẫu nước thải nhóm lấy cao,điều chứng tỏ nước bị ô nhiễm mức độ cao - Bàn luận: Trong trình thực thao tác thí nghiệm, thao tác tiệt trùng khơng đảm bảo tuyệt đối, điều dẫn đến kết nghiệm có sai số so với số liệu thực tế có mẫu 30 ... ……………………………………………………………………………………………… GV kí tên Thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường MỤC LỤC Mục lục… Bài 3: Chuẩn bị Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật…………………….4 Bài 4: Các phương pháp phân lập vi sinh vật……………………………….……... PHÁP PHÂN LẬP VI SINH Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG: Phân lập vi sinh vật trình tách rời loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Trong thiên nhiên hay vật phẩm nghiên cứu, vi sinh thường tồn... GIEO CẤY VI SINH VẬT Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG 10 Đây phương pháp bảo quản đơn giản, chủng vi sinh vật cấy mơi trường thích hợp (dịch thể hay thạch) ống nghiệm hay bình tam giác chí bình serum vi sinh vật