BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU CỦA BÀI THUỐC AG TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU CỦA BÀI THUỐC AG TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƢỢC LÝ – DƢỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng TS Đỗ Thị Nguyệt Quế HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô giáo, nhà khoa học Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu, gia đình, bạn bè đồng nghiệp Trước hết, với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược liệu Trung ương TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Giảng viên môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội người thầy dành nhiều thời gian, công sức, tâm huyết trực tiếp hướng dẫn bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược liệu Trung ương giúp đỡ nhiều thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học thầy cô giáo – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành trình học tập luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu cán nhân viên, giáo viên Trường Trung cấp Y – Dược Phạm Ngọc Thạch Hà Nội tạo điều kiện cho trình học tập thực luận văn Cuối xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân người bên cạnh động viên giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng năm 2018 Học viên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Hội chứng rối loạn lipid máu 1.1.1 Định nghĩa cách phân loại 1.1.2 Nguyên nhân 1.1.3 Dịch tễ 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh 1.1.5 Điều trị 1.2 Vai trò tế bào gan rối loạn lipid máu 10 1.2.1 Quá trình tổng hợp cholesterol gan 10 1.2.2 Quá trình vận chuyển triglycerid khỏi tế bào gan 10 1.3 Một số mơ hình dƣợc lý thực nghiệm gây tăng lipid máu để nghiên cứu thuốc điều trị rối loạn lipid máu 12 1.3.1 Mơ hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh 12 1.3.2 Mơ hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh 13 1.3.3 Mơ hình dược lý thực nghiệm gây tăng lipid tế bào gan 14 1.4 Tổng quan dƣợc liệu có thuốc 15 1.4.1 Trâm bầu 15 1.4.2 Cây lức (Sài hồ nam) 17 1.4.3 Nhân trần 19 1.4.4 Trần bì 20 Phần 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 23 2.1.2 Tế bào động vật nghiên cứu 23 2.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 24 2.1.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 25 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Đánh giá độc tính cấp tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu 25 2.2.2 Đánh giá khả ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 cao chiết cồn từ thuốc AG 31 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Kết đánh giá độc tính cấp tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu 37 3.1.1 Kết đánh giá độc tính cấp cao chiết cồn từ thuốc AG động vật thực nghiệm 37 3.1.2 Kết tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu nội sinh 37 3.1.3 Kết tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu ngoại sinh 40 3.2 Kết đánh giá khả ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 cao chiết cồn từ thuốc AG 44 3.2.1 Kết đánh giá độc tính mẫu nghiên cứu tế bào HepG2 44 3.2.2 Kết đánh giá độc tính mẫu nghiên cứu kết hợp với 500 µM acid oleic tế bào HepG2 45 3.2.3 Kết tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 mẫu nghiên cứu 46 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 48 4.1 Độc tính cấp tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG thực nghiệm 48 4.1.1 Độc tính cấp cao chiết cồn từ thuốc AG động vật thực nghiệm 48 4.1.2 Tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu nội sinh 48 4.1.3 Tác dụng hạ lipid máu cao chiết cồn từ thuốc AG chuột gây tăng lipid máu ngoại sinh 54 4.2 Khả ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 cao chiết cồn từ thuốc AG thử nghiệm Oil Red O 56 4.2.1 Khả gây độc mẫu thử tế bào HepG2 56 4.2.2 Khả gây độc mẫu thử kết hợp với 500 µM acid oleic tế bào HepG2 57 4.2.3 Khả ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 cao chiết cồn từ thuốc AG 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AB Acid : béo Apo Apoprotein : ApoLp Apolipoprotein : CH Cholesterol : CHE Cholesterol : esterase CM Chylomycron : HDL – C Cholesterol : tỷ trọng cao HMG CoA Hydroxy : methyl glutaryl CoA IDL Lipoprotein : tỷ trọng trung gian LCAT Lecithin-cholesterol-acyl-transferase : LDL Lipoprotein : tỷ trọng thấp LDL – C Cholesterol : LDL LP Lipoprotein : LPL Lipoprotein : lipase TG Triglycerid : VLDL Lipoprotein : tỷ trọng thấp XVĐM Xơ : vữa động mạch DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết cho chuột uống cao chiết cồn 37 Bảng 3.2 Nồng độ TC huyết chuột sau tiêm Triton WR1339 38 Bảng 3.3 Nồng độ TG huyết chuột sau tiêm Triton WR1339 39 Bảng 3.4 Nồng độ TC huyết chuột nhắt mơ hình tăng lipid ngoại sinh sau 15 ngày điều trị 40 Bảng 3.5 Nồng độ TG huyết chuột nhắt mô hình tăng lipid ngoại sinh sau 15 ngày điều trị 41 Bảng 3.6 Nồng độ TC huyết chuột cống mơ hình tăng lipid ngoại sinh sau tuần điều trị 42 Bảng 3.7 Nồng độ triglycerid (TG) huyết chuột cống mơ hình tăng lipid ngoại sinh sau tuần điều trị 43 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng mẫu thử đến khả sống sót tế bào HepG2 (%) 44 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng mẫu thử kết hợp với acid oleic đến khả sống sót tế bào HepG2 46 Bảng 3.10 Khả ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 mẫu nghiên cứu 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây trâm bầu (Combretum qualrangulare Kurz) 16 Hình 1.2 Cây lức (Pluchea pteropoda Hemsl) 18 Hình 1.3 Cây nhân trần (Andenosma indianum (Lour.Merr.)) 19 Hình 1.4 Trần bì (Pericarpi Citri reticulatae) 21 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn chuyển hóa lipid tình trạng lâm sàng đặc trƣng nồng độ triglycerid (TG) acid béo đồng thời với hàm lƣợng TG - lipoprotein huyết tƣơng cao [26] Tăng lipid máu nguyên nhân gây xơ vữa động mạch, bệnh liên quan đến tim mạch, gan nhiễm mỡ, đề kháng insulin, rối loạn chuyển hóa khác Các nghiên cứu giới gánh nặng tử vong, tàn tật nhƣ chi phí y tế cho bệnh lý liên quan đến rối loạn lipid máu cao Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới (WHO), rối loạn lipid máu liên quan tới nửa số ca thiếu máu tim triệu ngƣời chết năm toàn cầu [71] Theo báo cáo Canada năm 2009, tử vong bệnh mạch vành chiếm tỉ lệ cao (1/3 số ca tử vong năm) gây thiệt hại mặt kinh tế khoảng 22 tỷ đô la cho chi phí y tế trực tiếp gián tiếp [47] Rối loạn lipid máu không phổ biến với nƣớc phát triển mà với nƣớc phát triển, có Việt Nam Bệnh có xu hƣớng gia tăng xã hội ngày phát triển (do chế độ ăn cung cấp chất dinh dƣỡng vƣợt nhu cầu; hoạt động thể lực giảm…) Ở Việt Nam số ngƣời mắc bệnh tăng lipid máu có chiều hƣớng gia tăng nhanh chóng thời gian gần Theo kết nghiên cứu năm 2011 vừa qua Viện dinh dƣỡng, bệnh tăng lipid máu chiếm tỷ lệ 26% ngƣời tuổi từ 25 đến 74 Riêng thành phố lớn nhƣ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ nêu lên đến 40% Chính vậy, việc phát triển phƣơng pháp điều trị rối loạn lipid máu nhƣ tìm phƣơng thuốc có hiệu an toàn nhu cầu thiết yếu Hiện nay, thuốc tân dƣợc nhƣ nhóm fibrat, nhóm statin có hiệu tốt, tác dụng nhanh nhƣng cịn gây nhiều tác dụng khơng mong muốn nhƣ đau cơ, tiêu cơ, tăng enzym gan, rối loạn tiêu hố khơng đƣợc định cho ngƣời suy gan, suy thận loét dày – tá tràng [22], [31], [33], tỷ lệ acid béo khác nhƣ: (oleat / palmitat, tỉ lệ 2: 1) (oleat / palmitat, tỷ lệ 0: 3) để gây tình trạng tích tụ lipid tế bào gan [41] Vesterdal LK cộng (2013) tiến hành nghiên cứu liên quan hấp thu hạt carbon đen (CB, 14nm) tích tụ lipid gan cách: cho tế bào HepG2 tiếp xúc với hạt cacbon đen (CB, 14nm), sau cho thêm acid oleic palmatic Kết cho thấy: có gia tăng hàm lƣợng lipid nội bào huyết tƣơng tế bào HepG2 đƣợc ủ với acid oleic palmatic [68] Liu R cộng (2015) tiến hành xây dựng mơ hình gan nhiễm mỡ cách ủ tế bào gan với acid palmitic (PA) liều 0; 0,125; 0,25; 0,5 mM sau 0, 6, 12, 24 48 Kết thu đƣợc: Sự gia tăng nồng độ TG tế bào gan phụ thuộc vào liều Cụ thể ủ tế bào gan acid palmitic lên đến liều 0,25 mM có tăng đáng kể nồng độ TG; nhƣng ủ tế bào gan với nồng độ cao 0,5 1mM lại khơng có gia tăng đáng kể nồng độ TG [55] Eun Ju Shin cộng xác định tác động ức chế YE (Chất chiết xuất vỏ cam quýt có chứa hợp chất polymethoxyflavones) tích tụ lipid gan, tích tụ lipid tế bào HepG2 gây 0,5 mM acd oleic đƣợc đánh giá cách sử dụng phƣơng pháp nhuộm Oil Red O [38] Ở Việt Nam Năm 2016, Phí Thị Xuyến, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phƣơng, Đỗ Quyên Nghiên cứu tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 gây acid oleic sen Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng acid oleic với nồng độ 500µM gây tăng tích tụ lipid cho kết p < 0,001 [28] Kết từ bảng 3.10 cho thấy: Với cao chiết cồn từ thuốc AG thấy có ức chế tích tụ lipid vào tế bào phụ thuộc nồng độ mẫu thử Cụ thể nồng độ 25 µg/ml thấy có ức chế lipid nhẹ vào tế bào (9,40 ± 1,96%) so với lô chứng khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Cịn nồng 58 độ 50 µg/ml có khả ức chế tích tụ lipid tốt lên tới 16,05 ± 1,40 %.Và so với chứng dƣơng fenofibrat 16,04 ± 1,05% kết tƣơng đƣơng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p