BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỒNG VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỒNG VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT) ẰNG SẮC K LỎNG HI U NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Nơi thực đề tài: Viện Dƣợc liệu Thời gian thực hiện: từ 08/2017 đến 04/2018 HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn đƣợc thực hoàn thành Viện Dƣợc Liệu với hƣớng dẫn TS Lê Đình Chi PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng Em xin chân thành cảm ơn TS Lê Đình Chi định hƣớng nghiên cứu góp ý giúp em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phƣơng Thiện Thƣơng hƣớng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dƣợc Liệu cán Khoa Hóa phân t ch tiêu chu n tạo điều kiện giúp em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ em thời gian em thực luận văn Do thời gian thực luận văn có hạn nên khơng tránh thiếu sót Em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy bạn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2018 Học viên Đồng Văn Thành MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: Tổng quan 1.1 Tổng quan Cốt kh củ (Reynoutria japonica Houtt.) 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng theo Y học cổ truyền 1.1.6 Tác dụng dƣợc lý 1.2 Tổng quan polydatin, resveratrol, emodin 1.2.1 T nh chất vật lý hóa học 1.2.2 Tác dụng dƣợc lý 10 1.3 Phƣơng pháp xác định POL, RES EM 15 1.3.1 Các nghiên cứu nƣớc 15 1.3.2 Các nghiên cứu nƣớc 16 1.3.3 Tiêu chu n dƣợc liệu Cốt kh củ số Dƣợc điển 17 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Chất chu n, hóa chất thiết bị 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời POL, RES, EM b ng HPLC 21 2.3.2 Th m định phƣơng pháp 22 2.3.3 Áp dụng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu Cốt kh củ 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Chu n bị dung dịch chu n 22 2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 2.4.3 Quy trình xử lý mẫu 23 2.4.3 Đánh giá phƣơng pháp phân t ch 24 2.4.4 Áp dụng số mẫu dƣợc liệu Cốt kh củ 27 2.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 28 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU/THỰC NGHIỆM 29 3.1 Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện sắc ký 29 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu 29 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 30 3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 30 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 30 3.1.2.3 Khảo sát thể t ch tiêm mẫu 35 3.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 36 3.2.1 Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu 36 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 37 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ chiết 38 3.2.4 Khảo sát thời gian chiết 39 3.2.5 Khảo sát số lần chiết 40 3.3 Th m định phƣơng pháp định lƣợng b ng HPLC 43 3.3.1 Độ chọn lọc phƣơng pháp 43 3.3.2 Độ th ch hợp hệ thống 43 3.3.3 Đƣờng chu n khoảng tuyến t nh 45 3.3.4 Giới hạn phát LOD giới hạn định lƣợng LOQ) 46 3.3.5 Độ lặp lại 48 3.3.6 Độ 49 3.4 Áp dụng phƣơng pháp định lƣợng POL, RES EM mẫu Cốt kh củ 50 Chƣơng BÀN LUẬN 52 Kết luận đề xuất 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học EM Emodin POL Polydatin RES Resveratrol DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography photodiode array cao gh p nối detector detetion mảng iod LC- Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng gh p khối MS/MS mass spectrometry phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chu n tƣơng đối SD Standard Deviation Độ lệch chu n HPLC HPLCPDA Tiếng Việt DANH MỤC CÁC ẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu nƣớc định lƣợng POL, RES, EM Cốt kh củ Tr 15 Bảng 3.1 Khảo sát pha động ACN – nƣớc Tr 31 Bảng 3.2 Khảo sát pha động MeOH – nƣớc Tr 33 Bảng 3.3 Các thông số sắc ký ứng với chƣơng trình gradient Tr 35 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ th ch hợp hệ thống phƣơng pháp Tr 44 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến t nh nồng độ diện t ch p c POL, RES EM Tr 45 Bảng 3.6 Kết xác định LOD LOQ phƣơng pháp Tr 48 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp Tr 49 Bảng 3.8 Kết th m định độ phƣơng pháp Tr 50 Bảng 3.9 Kết hàm lƣợng POL, RES EM mẫu Cốt kh củ Tr 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình 1.2 Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ Tr.4 Công thức số anthraquinon naphthoquinon rễ Cốt kh củ Tr.5 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số stilben rễ Cốt kh củ Tr.7 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo polydatin Tr.8 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo resveratrol Tr.9 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo emodin Tr.9 Hình 2.1 Hình ảnh dƣợc liệu Cốt kh củ lƣu trữ Viện Dƣợc liệu Tr.20 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS POL, RES EM Tr.29 Hình 3.2 Chƣơng trình gradient Tr.32 Hình 3.3 Chƣơng trình gradient Tr.32 Hình 3.4 Chƣơng trình gradient Tr.34 Hình 3.5 Chƣơng trình gradient Tr.34 Hình 3.6 Kết khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu Tr.36 Hình 3.7 Kết khảo sát dung mơi chiết Tr.37 Hình 3.8 Kết khảo sát nhiệt độ chiết Tr.38 Hình 3.9 Kết khảo sát thời gian chiết Tr.39 Hình 3.10 Kết khảo sát số lần chiết Tr.40 Hình 3.11 Sắc ký đồ đánh giá t nh chọn lọc phƣơng pháp Tr.43 Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát t nh phù hợp hệ thống phƣơng pháp Tr.44 Hình 3.13 Đƣờng chu n POL, RES EM Tr.46 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ Tr.47 ... liệu Cốt kh củ, chúng tơi tiến hành thực đề tài Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol emodin cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt) ằng sắc ký lỏng hiệu cao ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỒNG VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ (REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT). .. (Reynoutria japonica Houtt) ằng sắc ký lỏng hiệu cao với mục tiêu: Xây dựng th m định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời polydatin, resveratrol emodin dƣợc liệu Cốt kh củ b ng phƣơng pháp HPLC Áp