BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS ĐOÀN THỊ TRANG XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS ĐOÀN THỊ TRANG XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ CHUYÊN NGÀNH 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Đặng Thế Hưng PGS TS Vũ Đặng Hồng HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thế Hưng – Trƣờng đại học Y tế Cơng cộng, PGS TS Vũ Đặng Hồng – Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội tận tình hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trung tâm xét nghiệm – Trường đại học Y tế Công cộng, giúp tơi suốt q trình thực tập thực luận văn Tôi xin cám ơn Ban giám đốc – Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội tạo điều kiện cho tơi đƣợc tham gia chƣơng trình đào tạo thạc sỹ Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho đƣợc trau dồi kiến thức kinh nghiệm quí báu suốt trình học tập trƣờng Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình, tồn thể bạn bè giúp đỡ động viên trình học tập nghiên cứu Hà Nội, Ngày 04 tháng 04 năm 2018 Đoàn Thị Trang MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại 1.2 THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ 1.2.1 Khái niệm phân loại 1.2.2 Tính chất, cơng thức số thuốc trừ sâu clor hữu đặc trƣng 1.2.3 Đặc tính chế gây độc 12 1.2.4 Dƣ lƣợng thuốc BVTV huyết tƣơng 13 1.3 PHÂN TÍCH THUỐC BVTV TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG GCMS 15 1.3.1 Các kỹ thuật xử lý mẫu 15 1.3.2 Sắc ký khí - khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectometry) 17 1.3.3 Các yêu cầu, tiêu thẩm định phƣơng pháp GC-MS phân tích thuốc BVTV huyết tƣơng 23 Phần : ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT VIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 26 2.2.2 Chất chuẩn 26 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 27 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu 28 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp phân tích 28 2.3.2.1 Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ xác định thuốc BVTV 28 2.3.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 28 2.3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tƣơng 29 2.3.3 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng thuốc BVTV nhóm clor hữu 30 2.3.3.1 Độ chọn lọc 30 2.3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 30 2.3.3.3 Xác định LOQ, LOD 30 2.3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 30 Phần : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lƣợng thuốc BVTV 31 3.1.2 Xác định thời gian lƣu chất phân tích 33 3.1.3 Xác định chất theo mảnh phổ (m/z) 35 3.1.4 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tƣơng 40 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống GC-MS 44 3.2.2 Độ chọn lọc 45 3.2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 47 3.2.3 Xác định giới hạn phát giới hạn định lƣợng 51 3.2.4 Độ lặp lại, độ thu hồi 52 3.3 ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI 54 Phần 4: BÀN LUẬN 56 4.1 VIỆC LỰA CHỌN THUỐC BVTV NGHIÊN CỨU 56 4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ 56 4.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC BVTV NHĨM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI 56 4.4.VỀ DƢ LƢỢNG THUỐC BVTV NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƢƠNG 58 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 5.1 KẾT LUẬN 59 5.2 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 65 DDE DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT : Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) : Diclor diphenyl dicloretylen DDD DDT HCH : Diclor diphenyl dicloretan : Diclor diphenyl tricloretan : Hexaclorocyclohexan AOAC ECD EI : Detector bắt điện tử (Electron capture detector) : Va chạm điện tử (Electron impact) GC-MS HPLC : Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectometry ) : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid LOD LOQ NCI NPD NTN PCI Chromatography) : Giới hạn phát (Limit of Detection) : Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification) : Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization) : Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector) : Ngƣời tình nguyện : Ion hóa hóa học dƣơng (Positive chemical ionization) QCVN RSD SD : Quy chuẩn Việt Nam : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SPE TCVN Thuốc BVTV : Chiết pha rắn (Solid phase extraction) : Tiêu chuẩn Việt Nam : Thuốc bảo vệ thực vật DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN STT Tên Bảng Biểu Trang Bảng : Phân loại thuốc BVTV theo đối tƣợng sinh vật gây hại Bảng : Một số phƣơng pháp phân tích thuốc BVTV nhóm clor hữu huyết tƣơng 21 Bảng : Điều kiện thích hợp để xác định thuốc BVTV thiết bị GC-MS 31 Bảng : Chƣơng trình nhiệt độ cột tách để phân tích thuốc BVTV phƣơng pháp GC-MS 33 Bảng : Thời gian lƣu chất hỗn hợp 18 chất chuẩn nhóm clor hữu 34 Bảng : Các mảnh phổ đặc trƣng mảnh sử dụng phân tích nhóm clor hữu theo GC-MS/SIR 40 Bảng 7: Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn CC-W 43 Bảng 8: Cách chuẩn bị mẫu QC huyết tƣơng 44 Bảng : Tính thích hợp hệ thống GC-MS α-HCH 44 10 Bảng 10: Độ lặp lại hệ thống GC-MS 44 11 Bảng 11: Sự phụ thuộc đáp ứng pic nồng độ thuốc BVTV nhóm clor hữu huyết tƣơng 47 12 Bảng 12: Kết xác định LOD, LOQ 48 13 Bảng 13: Kết khảo sát độ lặp lại, độ thu hồi thuốc BVTV nhóm clor hữu 51 14 Bảng 14: Kết mẫu thử NTN 53 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN STT Tên Hình Ảnh Trang Hình : Sơ đồ cấu tạo hệ thống GC 17 Hình 2: Thiết bị GC-MS dùng phân tích 27 Hình 3: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 32 Hình 4: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 32 Hình 5: Sắc kí đồ chạy theo chƣơng trình nhiệt 33 Hình 6: Sắc ký đồ hỗn hợp 18 chất theo chế độ quét SCAN 34 Hình 7: Phổ khối α-HCH 35 Hình 8: Phổ khối δ-HCH 36 Hình 9: Phổ khối Methoxyclor 37 10 Hình 10: Phổ khối Heptaclor epoxid 38 11 Hình 11: Phổ khối Aldrin 39 12 Hình 12: Sắc kí đồ mẫu huyết tƣơng chiết lỏng-lỏng 41 13 Hình 13: Sắc kí đồ mẫu huyết tƣơng chiết lỏng-lỏng làm qua cột Florisil 41 14 Hình 14: Sắc kí đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn 46 15 Hình 15: Đƣờng chuẩn phân tích thuốc BVTV huyết tƣơng 50 16 Hình 16: Sắc kí đồ thuốc BVTV nồng độ LOQ 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) (bao gồm thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm, thuốc trừ cỏ) đóng vai trò quan trọng nơng nghiệp tất quốc gia giới Hàng năm, Mỹ lƣợng thuốc BVTV đƣợc sử dụng chiếm 1/3 tổng số thuốc BVTV toàn giới, chủ yếu hóa chất diệt cỏ [6] Châu Âu sử dụng nhiều thuốc BVTV chiếm 30%, số nƣớc lại 20% tổng số thuốc BVTV toàn giới [25] Tại Việt Nam, vào năm 1957 miền Bắc nƣớc ta sử dụng khoảng 100 Đến trƣớc năm 1985 khối lƣợng thuốc BVTV dùng hàng năm khoảng 6.500 - 9.000 tấn; 03 năm gần đây, Việt Nam nhập sử dụng 70.000 - 100.000 tấn/năm, tăng gấp 10 lần Theo báo cáo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, năm 2014 Việt Nam nhập từ 70.000 đến 100.000 thuốc BVTV, thuốc trừ sâu chiếm 20,4%, thuốc trừ bệnh chiếm 23,2%, thuốc trừ cỏ chiếm 44,4%, loại thuốc BVTV khác nhƣ thuốc xông hơi, khử trùng, bảo quản lâm sản, điều hòa sinh trƣởng trồng chiếm 12% [6] Theo số liệu cục BVTV, việc kiểm soát sản xuất sử dụng thuốc BVTV nƣớc ta thƣờng gặp nhiều khó khăn Thêm vào đó, việc sản xuất nhỏ lẻ không áp dụng quy chuẩn phun thu hoạch nông sản khiến cho dƣ lƣợng thuốc BVTV nơng sản phổ biến cao, đặc biệt rau, quả, chè… Kết kiểm tra, năm 2000 - 2002 cục BVTV cho thấy vùng Hà Nội số mẫu có dƣ lƣợng mức cho phép cao, rau, nho, chè từ 10% - 26%, TPHCM từ 10 - 30% Một số nghiên cứu việc sử dụng thuốc BVTV chè, lúa rau Thái Nguyên, đồng sông Hồng Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy số lần phun thuốc bảo vệ thực vật cao, có nơi lên đến 26-32 lần/năm, có nồng độ cao nhiều nhƣ không thực việc thu hoạch theo quy định, việc tồn dƣ thuốc BVTV sản phẩm nông nghiệp cao [3], [7] Thuốc BVTV ảnh hƣởng trực tiếp gây ngộ độc mãn tính, ngộ độc cấp tính dẫn đến tử vong làm biến đổi gen, gây nên bệnh di truyền ảnh hƣởng đến nhiều hệ sau Thuốc BVTV có nhiều chế dẫn đến nguy gây ung thƣ Một số nghiên cứu rằng, thuốc BVTV có khả gây ung thƣ thơng qua chế cân oxy hóa (oxidative stress) tạo nhiều phân tử có gốc tự có khả phá hủy cấu trúc DNA Một số khác lại cho thuốc BVTV có khả hoạt động nhƣ hormone khiến tế bào tăng trƣởng bất thƣờng làm mất/giảm khả kiểm soát tăng sinh tế bào [10] Một số chất gây ức chế (hoặc gây kích thích giả) đến tuyết nội tiết, gây cân hoạt động loại hooc-mon (hormone), từ gây phản ứng tiêu cực đến hoạt động bình thƣờng thể ngun nhân gây ung thƣ vú Nhiều nghiên cứu mối liên hệ việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu khả tăng nguy ung thƣ vú đối tƣợng phụ nữ Nghiên cứu Cohn cộng việc phơi nhiễm với thuốc trừ sâu DTT (dichloro diphenyl trichlorothane) trƣớc thời kỳ dậy có nguy ung thƣ vú cao nhiều so với việc phơi nhiễm thuốc trừ sâu sau lứa tuổi dậy [13] Nghiên cứu đối tƣợng ngƣời vợ ngƣời nông dân bị phơi nhiễm với thuốc trừ sâu Iowa miền bắc Carolina, Mỹ từ năm 1993-2000 ngƣời vợ nơng dân sử dụng thuốc BVTV có nguy mắc ung thƣ vú cao so với ngƣời không sử dụng thuốc BVTV [20] Hiện nay, ung thƣ vú ung thƣ có tỷ lệ cao phụ nữ Hà Nội, ung thƣ vú ngày có xu hƣớng trẻ hóa, chứng tỏ thay đổi lối sống ô nhiễm môi trƣờng Việt Nam nguyên nhân liên quan đến gia tăng trẻ hóa bệnh [24] Nhiều nghiên cứu rằng, 75-80% ung thƣ phát sinh tác động môi trƣờng lối sống, gen di truyền chiếm 2025% [9] [28] Việt Nam nƣớc có nơng nghiệp phát triển lâu đời với nhiều mặt hàng nông sản Để đạt suất cao nông nghiệp việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cần thiết, nhờ ứng dụng suất thu hoạch tăng lên rõ rệt, sống vật chất ngƣời dân no đủ Tuy nhiên, hàm lƣợng tồn dƣ vƣợt mức thuốc BVTV sản phẩm nông nghiệp, đất nƣớc gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời Trên thị trƣờng có nhiều nhóm Endosulfan I p,p’-DDD Endosulfan sulfat 89 p,p’-DDT Endrin keton Methoxy 90 PHỤ LỤC 9: Sắc ký đồ nồng độ 10 ppb Heptaclor Aldrin Heptaclor epoxid 91 Endosulfan II Diendrin p,p’-DDE 92 Endosulfan I p,p’-DDD Endrin aldehyd 93 p,p’-DDT Endrin keton Methoxy 94 PHỤ LỤC 10: Sắc ký đồ nồng độ ppb Heptaclor Aldrin Heptaclor epoxid 95 Endosulfan II Diendrin p,p’-DDE 96 Endosulfan I p,p’-DDD p,p’-DDT Endrin keton 97 PHỤ LỤC 11: Sắc ký đồ số mẫu thử 98 99 100 NB8 Endrin aldehyd 101 Endrin keton 102 103 ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS ĐOÀN THỊ TRANG XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ THUỐC TRỪ SÂU NHÓM CLOR HỮU CƠ TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG GC- MS LUẬN... xác định dư lượng số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu huyết tương GC- MS với mục tiêu sau: Nghiên cứu xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng số thuốc trừ sâu nhóm clor hữu huyết tƣơng GC- MS Ứng dụng... điện  Một số ứng dụng sắc ký khí định lượng thuốc BVTV nhóm clor hữu huyết tương Trong phân tích thuốc BVTV, GC với detector ECD hay đƣợc ứng dụng để phân tích thuốc BVTV nhóm clor hƣu thuốc