BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO CỦA PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT CÂY BÁT GIÁC LIÊN (Dysoma difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang, Berberidaceae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA, TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO CỦA PHẦN DƢỚI MẶT ĐẤT CÂY BÁT GIÁC LIÊN (Dysoma difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang, Berberidaceae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Phƣơng Thiện Thƣơng TS Bùi Hồng Cƣờng HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Phương Thiện Thương (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) TS Bùi Hồng Cường (Bộ môn Dƣợc cổ truyền – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội), ngƣời thầy hƣớng dẫn, bảo em, góp ý giúp đỡ em, đƣa ý kiến quý báu để em hoàn thiện đề tài Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu Cảm ơn chị Phƣơng, chị Nga, chị Nụ, bạn Tuyết, em Quân, em Long, em Hằng… đặc biệt em Phạm Giang Nam Lê Ngọc Duy – ngƣời ln tận tình, hết lòng giúp đỡ để em hoàn thành luận văn thời hạn Em xin chân thành cảm ơn anh chị khoa Dƣợc lý – Sinh hóa, Viện Cơng nghệ sinh học ln tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Y Dƣợc Hải Phòng tồn thể anh, chị bạn đồng nghiệp ln khích lệ, san sẻ cơng việc quan tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình làm việc học tập Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, chồng bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn Em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên DS Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN…………………………………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI PODOPHYLLUM…………………………………… 1.1.1 Về vị trí phân loại…………………………………………………………… 1.1.2 Về đặc điểm chung………………………………………………………… 1.1.3 Về thành phần hóa học……………………………………………………… 1.1.4 Về tác dụng sinh học độc tính…………………………………………… 1.1.5 Về tác dụng, cơng dụng số thuốc YHCT………………… 13 1.2 TỔNG QUAN CÂY BÁT GIÁC LIÊN……………………………………… 15 1.2.1 Về vị trí phân loại …………….…………………………………………… 15 1.2.2 Về đặc điểm thực vật phân bố…………………………………………… 16 1.2.3 Về thành phần hóa học……………………………………………………… 18 1.2.4 Về tác dụng sinh học……………………………………………………… 19 1.2.5 Về công dụng thuốc YHCT…………………………………… 20 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 21 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU .…………………………………… 21 2.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ………………………………………… 23 2.2.1 Thuốc thử, dung mơi, hóa chất.…………………………………………… 23 2.2.2 Trang thiết bị máy móc………………………………………………… 23 2.2.3 Tế bào thí nghiệm ……………………………………………………… 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………… 24 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học …………………………………………… 24 2.3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phƣơng pháp dọn gốc tự DPPH, superoxyd……………………………………………………………………… 25 2.3.3 Đánh giá tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thƣ in vitro……… 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………………………… 32 3.1 THÀNH PHẦN HĨA HỌC………………………………………………… 32 3.1.1 Định tính phản ứng hóa học……………………………………… 32 3.1.2 Định tính phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng…………………………… 34 3.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ MẪU NGHIÊN CỨU……………………………………………………………………………… 36 3.2.1 Chiết xuất…………………………………………………………………… 36 3.2.2 Phân lập…………………………………………………………………… 37 3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập đƣợc………………………… 39 3.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc……………………………… 44 3.3 TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN IN VITRO……………………… 54 3.3.1 Thử tác dụng dọn gốc tự DPPH………………………………………… 54 3.3.2 Thử tác dụng dọn gốc tự Superoxyd…………………………………… 56 3.4 TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO……………………… 59 CHƢƠNG BÀN LUẬN……………………………………………………… 61 4.1 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC……………………………………………… 61 4.1.1 Kết định tính…………………………………………………………… 61 4.1.2 Kết phân lập chất từ phần dƣới mặt đất bát giác liên……… 62 4.2 VỀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN IN VITRO…………………… 65 4.3 VỀ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO…………………… 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… PHỤ LỤC………………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH 70 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Phổ khối (Electrospray inoization mass spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton H-NMR HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) IC50 Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LD50 Liều gây chết 50% (Lethal Dose, 50%) NXB Nhà xuất OD Mật độ quang học (Optical Density) P/đ Phân đoạn pp Page TLTK Tài liệu tham khảo tr Trang UV Phổ tử ngoại (Ultra Violet Spectroscopy) YHCT Y học cổ truyền δ Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính ppm) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Bảng Tên bảng Bảng 1.1 Các chất phân lập đƣợc từ số loài Podophyllum Bảng 1.2 Hàm lƣợng hợp chất lignan số loài Trang Podophyllum Bảng 1.3 Cơng dụng số lồi Podophyllum 14 Bảng 3.1 Kết định tính phần dƣới mặt đất bát giác 32 liên phản ứng hóa học Bảng 3.2 Kết định tính cắn phân đoạn mẫu nghiên 33 cứu phản ứng hóa học Bảng 3.3 Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR BGL1 với liệu 44 Bảng 3.4 Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR BGL2 với liệu 46 Bảng 3.5 Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR BGL3 với liệu 48 Bảng 3.6 Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR BGL4 với liệu 50 10 Bảng 3.7 Đối chiếu phổ 13C, 1H-NMR BGL5 với liệu 52 11 Bảng 3.8 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH phân đoạn từ mẫu 55 bát giác liên 12 Bảng 3.9 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH hợp chất phân lập 55 từ mẫu bát giác liên 13 Bảng 3.10 Hoạt tính dọn gốc tự superoxyd phân đoạn từ 57 mẫu bát giác liên 14 Bảng 3.11 Hoạt tính dọn gốc tự superoxyd hợp chất phân 58 lập từ mẫu bát giác liên 15 Bảng 3.12 Tác động gây độc dòng tế bào ung thƣ mẫu nghiên cứu 60 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Bảng Hình 1.1 Các hợp chất lignan số lồi Podophyllum Hình 1.2 Cơ quan sinh dƣỡng bát giác liên (Dysosma 16 Tên hình Trang diformis) Hình 1.3 Cơ quan sinh sản bát giác liên (Dysosma 17 diformis ) Hình 1.4 Một số thành phần hóa học có bát giác liên 18 Hình 2.1 Mẫu bát giác liên nghiên cứu 21 Hình 2.2 Cơ quan sinh dƣỡng lồi bát giác liên nghiên cứu 22 Hình 2.3 Cơ quan sinh sản loài bát giác liên nghiên cứu 22 Hình 2.4 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ mẫu nghiên cứu 25 Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính nhóm flavonoid mẫu nghiên 35 cứu 10 Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính nhóm saponin mẫu nghiên 36 cứu 11 Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ thân rễ rễ bát giác 37 liên 12 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ cắn ethyl acetat thân rễ rễ 39 bát giác liên 13 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân đoạn thu đƣợc sau lên cột pha 39 thƣờng với hệ dung môi MeOH : H2O (2:1) 14 Hình 3.6 Sắc ký đồ chất BGL1, BGL2 với hệ dung môi MeOH 40 : H2O (2:1) 15 Hình 3.7 Sắc ký đồ chất BGL1, BGL2 với hệ dung môi Toluen 40 : ethyl acetat : aceton : acid formic (5:2:2:1) 16 Hình 3.8 Sắc ký đồ chất BGL3 với hệ dung môi MeOH : H2O 41 (1:1) 17 Hình 3.9 Sắc ký đồ chất BGL3 với hệ dung môi EtOAc : 41 CH3COOH : HCOOH : H2O (10:1:1:1) 18 Hình 3.10 Sắc ký đồ chất BGL4 với hệ dung môi MeOH : H2O 42 (3:1) 19 Hình 3.11 Sắc ký đồ chất BGL4 với hệ dung môi Toluen : ethyl 42 acetat : aceton : acid formic (5:2:2:1) 20 Hình 3.12 Sắc ký đồ chất BGL4 với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH 42 (10:1) 21 Hình 3.13 Sắc ký đồ chất BGL5 với hệ dung môi EtOAc : 43 CH3COOH : HCOOH : H2O (10:1:1:1) 22 Hình 3.14 Sắc ký đồ chất BGL5 với hệ dung môi MeOH : H2O 43 (3:2) 23 Hình 3.15 Cấu trúc hợp chất BGL1 46 24 Hình 3.16 Cấu trúc hợp chất BGL2 47 25 Hình 3.17 Cấu trúc hợp chất BGL3 50 26 Hình 3.18 Cấu trúc hợp chất BGL4 51 27 Hình 3.19 Cấu trúc hợp chất BGL5 54 28 Hình 3.20 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH phân đoạn từ mẫu 54 bát giác liên 29 Hình 3.21 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH hợp chất phân lập từ 55 mẫu bát giác liên 30 Hình 3.22 Hoạt tính dọn gốc tự superoxyd phân đoạn từ 57 mẫu bát giác liên 31 Hình 3.22 Hoạt tính dọn gốc tự superoxyd hợp chất phân 58 lập từ mẫu bát giác liên 32 Hình 4.1 Tổng hợp chất phân lập đƣợc 65 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây bát giác liên hay gọi độc cƣớc liên, độc diệp chi hoa, cƣớc diệp, …, có tên khoa học Dysosma difformis (Hemsley & E H Wilson) T H Wang, tên đồng nghĩa Podophyllum tonkinense Gagnepain, phân bố chủ yếu số tỉnh Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Nam, …) Việt Nam (Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, ) [11] Ở Trung Quốc, bát giác liên đƣợc sử dụng Y học cổ truyền với công dụng chữa rắn cắn, sƣng tấy, áp xe vú, nhọt độc, đờm ho [6], [11] Toàn bát giác liên đƣợc dùng làm thuốc trừ phong, tiêu viêm, giải độc, tiêu phù, sát trùng với nhiều thuốc quý [47], [71] Ở Việt Nam, bát giác liên đƣợc dùng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Đặc biệt, ngƣời dân số địa phƣơng dùng bát giác liên với hoàng đỗ quyên tử bối kì thuốc để chữa ung thƣ vú [11] Trên giới, có nhiều nghiên cứu lồi Podophyllum, đó, chủ yếu nghiên cứu thành phần ligan tác dụng chống ung thƣ chúng Từ chất phân lập đƣợc số loài Podophyllum, ngƣời ta cải tiến cấu trúc, tạo loạt chất có hoạt tính tốt lâm sàng để điều trị ung thƣ phổi tế bào nhỏ, ung thƣ tinh hoàn, ung thƣ biểu mô lymphô, …nhƣ etoposid, teniposid [64] Tuy bát giác liên đƣợc dùng làm thuốc [6], [11] nhƣng Việt Nam chƣa có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dƣợc lý dƣợc liệu Cho đến nay, có nghiên cứu tác giả Cao Thanh Mai (2014) mô tả đƣợc đặc điểm thực vật dự đoán mẫu nghiên cứu lồi: Podophyllum pleianthum Hance, Podophyllum majoense Gagnepain, Podophyllum tonkinense Gagnepain (do chƣa lấy đƣợc để xác định xác tên khoa học); ngồi ra, tác giả mô tả đƣợc đặc điểm vi học đồng thời định tính sơ thành phần hóa học thân rễ mẫu nghiên cứu [7] Để có thêm sở khoa học cho việc sử dụng bát giác liên làm thuốc, đồng thời phát huy giá trị, vai trò bát giác liên y dƣợc học, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng ung thƣ in vitro bát giác liên (Dysosma PHỔ UV CHẤT BGL4 PHỔ UV CHẤT BGL4 1.000 Abs 0.500 0.000 -0.293 190.00 400.00 600.00 nm No P/V Wavelength nm Abs 366.00 0.502 324.00 0.268 266.00 0.438 Description 800.00 PHỔ ESI-MS CHẤT BGL4 Inten.(x1,000,000) 285 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 111 0.5 0.0 100 200 300 400 500 600 700 m/z PHỤ LỤC Bộ phổ chất BGL5 (phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT), phổ UV, phổ khối ESI-MS) PHỔ UV CHẤT BGL5 1.000 Abs 0.500 0.000 -0.301 200.00 No P/V 300.00 Wavelength nm 400.00 nm Abs 349.50 0.443 293.50 0.323 266.50 0.618 Description 500.00 600.00 PHỔ ESI-MS CHẤT BGL5 Inten.(x100,000) 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 413 593 3.0 2.0 691 337 435 391 1.0 533 451 361 473 489 387 549 511 571 605 631 647 669 693 0.0 350 400 450 500 550 600 650 m/z ... sử dụng b t giác liên làm thuốc, đồng thời ph t huy giá trị, vai trò b t giác liên y dƣợc h c, tiến h nh đề t i: Nghiên cứu thành phần h a h c đánh giá t c dụng chống oxy h a, t c dụng kháng ung. .. Shaw 1.1.3 Về thành phần h a h c Thành phần h a h c chi Podophyllum đƣợc chia thành hai nhóm chính: nhóm gồm ch t tạo thành nhựa (hay gọi podophyllin) nhóm gồm ch t khơng t o thành nhựa T c dụng. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO T O BỘ Y T TRƢỜNG ĐẠI H C DƢỢC H NỘI NGUYỄN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN H A H C VÀ ĐÁNH GIÁ T C DỤNG CHỐNG OXY H A, T C DỤNG KHÁNG UNG THƢ TRÊN IN VITRO CỦA PHẦN DƢỚI MẶT