BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ RỞ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU TRÊN CHUỘT NHẮT TĂNG LIPID MÁU VÀ TRÊN TẾ BÀO HEPG2 TỪ BÀI THUỐC CỦA LƢƠNG Y TRẦN QUANG TRUNG, TỈNH AN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ RỞ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU TRÊN CHUỘT NHẮT TĂNG LIPID MÁU VÀ TRÊN TẾ BÀO HEPG2 TỪ BÀI THUỐC CỦA LƢƠNG Y TRẦN QUANG TRUNG, TỈNH AN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Lập Người hướng dẫn khoa học : TS Phạm Thị Nguyệt Hằng HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu thực đề tài, để hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình, đồng nghiệp bạn bè Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Thị Lập - người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt thời gian học tập động viên, chia sẻ tơi khó khăn q trình thực đề tài hoàn thành luận văn TS.Phạm Thị Nguyệt Hằng - người thầy đáng kính tận tình dạy cho tơi q trình thực đề tài Viện Dược liệu; gương cho noi theo phương pháp làm việc, học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy phịng Sau Đại học tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành luận văn; thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt thầy mơn Hóa Sinh truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu cán bộ, nhân viên, anh chị em Khoa Dược lý - Sinh hóa Viện Dược liệu tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln bên tơi lúc khó khăn để động viên, chia sẻ, khuyến khích tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 02 tháng năm 2018 Học viên Trần Thị Rở MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẮN ĐẾ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ RỐI LOẠN LIPID MÁU 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Nguyên nhân 1.1.4 Dịch tể 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh 1.1.6 Điều trị 1.1.7 Vai trò tế bào gan rối loạn lipid máu 1.2 MỘT SỐ MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU CỦA THUỐC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 12 1.3 TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC 14 1.3.1 Thành phần 14 1.3.2 Đặc điểm 18 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm 19 2.1.3 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Đánh giá tác dụng hạ lipid chuột nhắt tăng lipid nội sinh gây Triton TW 1339 cao đặc thuốc An Giang 21 2.2.2 Đánh giá khả ức chế tích tụ lipid gây acid oleic mẫu thử tế bào HepG2 thử nghiệm Oil Red O 24 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Tác dụng hạ lipid máu cao đặc thuốc An Giang chuột nhắt tăng lipid nội sinh gây Triton WR1339 31 3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 phương pháp nhuộm Oil Red O cao đặc thuốc An Giang 33 3.2.1 Đánh giá độc tế bào mẫu thử tế bào HepG2 33 3.2.2 Đánh giá độc tế bào mẫu thử kết hợp với 500 µM acid oleic tế bào HepG2 35 3.2.3 Tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 mẫu thử 36 Chƣơng BÀN LUẬN 38 4.1 Tác dụng hạ lipid máu cao đặc thuốc An Giang chuột nhắt tăng lipid nội sinh gây Triton WR1339 38 4.2 Tác dụng ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 phương pháp nhuộm Oil Red O cao đặc thuốc An Giang 44 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NGHĨA CỦA TỪ VIẾT TẮT AB AFLD Apo Chol CM ĐTĐ FFA HA HCCH HDL IDL IL IRS LDL Lp NAFLD Pro RLLM T2DM TG VLDL WAT XVĐM Acid béo Bệnh gan nhiễm mỡ có cồn Apolipoprotein Cholesterol Chylomicron Đái tháo đường Acid béo tự Huyết áp Hội chứng chuyển hóa Hight density lipoprotein Intermediate density lipoprotein Interleukin Insulin resistance (kháng insulin) Low density lipoprotein Lipoprotein Bệnh gan nhiễm mỡ không cồn Protein Rối loạn lipid máu Đái tháo đường týp Triglyceride/Triacylglycerol Very low density lipoprotein Mỡ trắng Xơ vữa động mạch DANH MỤC BẢNG KÝ HIỆU TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1 Phân loại RLLM theo FREDRICKSON (có bổ sung WHO) Bảng 1.2 Mối liên quan RLLM nguyên phát gen Bảng 1.3 Các nguyên nhân gây RLLM thứ phát Bảng 1.4 Phân loại thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược điều trị RLLM Bảng 3.1 Hàm lượng Chol toàn phần huyết chuột sau tiêm triton 32 Bảng 3.2 Hàm lượng TG huyết chuột sau tiêm triton 33 Bảng 3.3 Ảnh hướng mẫu thử đến khả ức sống sót tế 34 bào HepG2 (% sống sót) Bảng 3.4 Ảnh hướng mẫu thử kết hợp với 500µM acid 35 oleic khả sống sót tế bào HepG2 (%) Bảng 3.5 Tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 mẫu thử (%) 36 DANH MỤC HÌNH KÝ HIỆU TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1 Mã đề (Plantago asiatica L.) 14 Hình 1.2 Nghệ (Curcuma long L.) 15 Hình 1.3 Hoa hịe (Sophora japonica L.) 17 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu (RLLM), béo phì, tiểu đường, tim mạch thuộc nhóm bệnh chuyển hóa có nguy cao gây xơ vữa động mạch tử vong [21] Tỷ lệ tử vong nhóm bệnh gây tăng lên nước phát triển, có Việt Nam[3] Vai trị rối loạn lipid máu bệnh lý xơ vữa động mạch chứng minh qua nhiều nghiên cứu dịch tễ học, thực nghiệm cơng trình nghiên cứu tiền cứu – can thiệp [3], chủ yếu nồng độ cholesterol cao, góp phần gây khoảng 56% bệnh tim thiếu máu cục 18% đột quỵ [14], dẫn đến 4,4 triệu người tử vong hàng năm giới Phát sớm, phòng điều trị kịp thời góp phần làm giảm tỷ lệ mắc tai biến RLLM gây ra[14] Do đó, việc nghiên cứu thuốc điều trị RLLM ngày cần thiết cấp bách Hiện có nhiều thuốc hóa dược điều trị RLLM [14] Tuy thuốc hóa dược có chế tác dụng rõ ràng, phải sử dụng thường xuyên lâu dài nên gây nhiều tác dụng không mong muốn cho bệnh nhân tiêu cơ, viêm cơ, rối loạn điện tim, tăng transaminase [20]; ngồi ra, chi phí cho việc điều trị thuốc cao Nhằm tránh tác dụng khơng mong muốn thuốc có nguồn gốc hóa dược, giảm nguy rủi ro, tăng lợi ích đạt hiệu điều trị, ngày nhà nghiên cứu sản xuất thuốc có nguồn gốc từ dược liệu điều trị RLLM có xu hướng ngày tăng có Việt Nam, nhiên số lượng cịn hạn chế Việt Nam có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú có y học cổ truyền lâu đời với nhiều thuốc vô quý báu Dựa vào kinh nghiệm vị lương y có nhiều thuốc điều trị tim mạch, gan, đái tháo đường Trong có thuốc tỉnh An Giang lương y lưu truyền lại Bài thuốc người dân dùng hiệu bệnh mỡ máu Thành phần thuốc bao gồm Mã đề (Plantago asiatica L.), Nghệ (Curcuma longa L.), Hoa hịe (Sophora japonica L.) Vì vậy, để nâng cao giá trị sử dụng dược liệu góp phần làm phong phú thêm danh mục thuốc dược liệu phịng điều trị RLLM, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng hạ lipid máu chuột nhắt tăng lipid máu tế bào HepG2 từ thuốc lƣơng y Trần Quang Trung, Tỉnh An Giang” với hai mục tiêu sau: Đánh giá tác dụng hạ lipid chuột nhắt tăng lipid nội sinh gây triton Đánh giá tác dụng ức chế tích tụ lipid gây acid oleic tế bào HepG2 phƣơng pháp nhuộm Oil Red O Kết nghiên cứu (bảng 3.4) cho thấy, tất mẫu thử có nồng độ an tồn tế bào HepG2 sau kết hợp với 500µM acid oleic, khả ức chế tăng trưởng tế bào HepG2 so với lơ chứng khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Như vậy, mẫu thử có nồng độ 25µg/ml, 50µg/ml với cao đặc; 100µM với Fenofibrat kết hợp vói 500µM acid oleic không gây độc tế bào HepG2 nên dùng để tiến hành đánh giá khả ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 gây acid oleic 4.2.3 Tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 cao đặc thuốc An Giang Bên cạnh việc đánh giá tác dụng ức chế tăng lipid mơ hình động vật thực nghiệm, nghiên cứu đồng thời tiến hành đánh giá tác dụng ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 Tế bào HepG2 sử dụng thành cơng để thiết lập mơ hình tích tụ lipid tế bào gan đặc tính tế bào ổn định, dễ ni cấy, sử dụng để sàng lọc loại thuốc phòng ngừa điều trị số bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa, thường phát lâm sàng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sống bệnh nhân Liệu pháp điều trị lâm sàng bệnh bao gồm thuốc điều trị tăng lipid, thuốc chống béo phì, thuốc tăng huyết áp… thuốc khác Do vậy, tích tụ lipid tế bào HepG2 sử dụng làm mơ hình nghiên cứu sàng lọc thuốc ức chế tăng lipid tế bào[46] Các acid béo mạch dài hình thành giọt lipid nội bào dẫn đến tích lũy lipid Là thành phần quan trọng acid béo tự chuỗi dài làm tăng khả tích tụ lipid vào tế bào, acid oleic lựa chọn để thiết lập mơ hình gây tăng tích tụ lipid tế bào gan Việc thiết lập mơ hình tích tụ lipid tế bào gan đạt nồng độ từ 0,1 đến mmol.L −1 acid oleic 45 24 tế bào HepG2 [43] Mức tích lũy lipid tế bào có tương quan thuận với nồng độ axid oleic, đo phương pháp đường cong chuẩn [17] Trong nghiên cứu này, chọn acid oleic làm chất gây tăng khả tích tụ lipid vào tế bào HepG2 liên tục 24 để thiết lập mơ hình tích tụ lipid, đồng thời đánh giá khả ức chế tích tụ lipid cao đặc chiết cồn từ thuốc An Giang Kết nghiên cứu bảng 3.5 cho thấy: với cao đặc thuốc An Giang có ức chế tích tụ lipid vào tế bào phụ thuộc nồng độ mẫu thử Cụ thể, nồng độ 25µg/ml thấy có ức chế lipid nhẹ vào tế bào, cịn nồng độ 50µg/ml có khả ức chế tích tụ lipid tốt lên tới 12,31±1,36 (%) Và so với với chứng dương Fenofibrat 16,04 ± 1,05% kết tương đương Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0.01 Ở Việt Nam, nghiên cứu tác dụng ức chế tích tụ lipid cao chiết cồn từ sen Bùi Thị Thanh Hương cho kết nhóm tế bào xử lý acid oleic 0,5mM Fenofibrat 200mg/ml có tác dụng ức chế tích tụ lipid là: 15,9 ± 8,85% 23,1% ± 5,38% Còn kết hợp với cao chiết cồn phần trăm ức chế tích tụ lipid 20,0 ± 1,69 (với p < 0,05) Nguyễn Thị Lập cộng nghiên cứu tác dụng ức chế tích tụ lipid gây acid oleic cao chiết cồn từ Ganoderma sp1 , tang ký sinh đại hoa tế tân tế bào HepG2 cho kết sau: nồng độ 12,5µg/ml khơng gây ức chế lipid vào tế bào, tăng nồng độ lên 25,0 µg/ml thẻ tác dụng ức chế tích tụ lipid với phần trăm ức chế 17,1% Tác dụng tương đương với chất đối chứng dương Fenofibrat 100,0 μM có tỷ lệ phần trăm ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 17,3% Cao cồn đại hoa tế tân nồng độ 25,0 50,0 μg/ml thể tác dụng ức chế tích tụ lipid phụ thuộc nồng độ, với phần trăm ức chế 10,0% 12,0% 46 Trong nghiên cứu Sihui Wu, Haitao Pan cộng Hiệu ức chế in vitro CTMS CCMS tích tụ lipid axit oleic gây tế bào HepG2 có gia tăng đáng kể hàm lượng TG nhóm mơ hình so với nhóm chứng trắng (mẫu khơng xử lý) ( p