BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ CẨM TÚ Niên khóa: 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TOÀN PHẦN CỦA QUẢ THỂ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst THEO THỜI GIAN SINH TRƯỞNG Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS TRƯƠNG THỊ ĐẸP NGUYỄN THỊ CẨM TÚ Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Thị Đẹp, người tận tình hướng dẫn cho tơi từ bước đầu làm quen với nấm Linh chi Ganoderma lucidum sẵn sàng sửa chữa lỗi nhỏ để khóa luận hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phan Văn Minh, người thầy định hướng đề tài, dõi theo giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn TS Trần Công Luận sẵn lòng tạo điều kiện để đề tài thực Trung tâm Sâm Dược liệu TPHCM, GS.TS Nguyễn Minh Đức, DS Nguyễn Minh Cang tận tình giúp đỡ để thực phần Sắc ký lỏng hiệu cao khoá luận Xin cảm ơn KS Nguyễn Minh Quang hướng dẫn tận tình kỹ thuật trồng chăm sóc nấm Xin cảm ơn Thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học trường ĐH Nông Lâm TPHCM quan tâm tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập thực khố luận, lắng nghe, góp ý giúp tơi sữa chữa khố luận Xin cảm ơn Thầy cô, anh chị bạn trại thực nghiệm Viện nghiên cứu CNSH Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, Trung tâm Sâm Dược liệu TPHCM, Bộ môn Thực vật Ban nghiên cứu khoa học khoa Dược ĐH Y Dược TPHCM, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TPHCM dẫn, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình thực đề tài Chân thành cảm ơn người bạn chia sẻ bùi, hỗ trợ vật chất tinh thần để tơi ln tiến lên phía trước Xin cảm ơn tập thể lớp DH07SH, người bạn thân thiết gắn bó với quãng đường sinh viên đầy kỉ niệm Tháng 7/2011 i TÓM TẮT Từ xưa, nấm Linh chi xem loại thảo dược quý Việt Nam nhiều nước châu Á Nấm Linh chi chứa nhiều dược chất có khả phòng trị bệnh cho người Trong đó, triterpenoid tồn phần thành phần dùng để đánh giá chất lượng nấm Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid thay đổi theo thời gian sinh trưởng nấm Hiện nay, nghiên cứu hàm lượng triterpenoid toàn phần thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum theo thời gian sinh trưởng Việt Nam Do đó, đề tài “Khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần thể nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst theo thời gian sinh trưởng” tiến hành nhằm xác định thời điểm thích hợp để thu hoạch nấm có hàm lượng triterpenoid toàn phần cao Cơ chất trồng nấm mạt cưa cao su Kết phân tích sơ thành phần hóa học cho thấy nấm Linh chi có chất béo, carotenoid, alkaloid, triterpenoid, coumarin, glycosid tim, tannin, saponin, polyphenol, acid hữu chất khử Phát diện triterpenoid phản ứng hóa học Liebermann - Burchard SKLM với hệ dung môi Toluen – Ethylacetat – Acid formic Sau chiết Soxhlet định lượng phương pháp cân, xác định hàm lượng triterpenoid toàn phần tăng theo thời gian sinh trưởng, cao vào tuần thứ 10, đạt 4,51% 4,54% tính theo Khối lượng khơ thể nấm Kết cho thấy giai đoạn - 10 tuần tuổi thời điểm thích hợp cho việc thu hoạch nấm Linh chi có hàm lượng triterpenoid toàn phần thể cao Ngoài ra, so sánh với mẫu Linh chi Nhật, kết q trình phân tích sắc ký lỏng hiệu cao cho thấy thành phần triterpenoid toàn phần Linh chi Nhật đa dạng Linh chi Việt Nam ii SUMMARY “Lingzhi”, Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst., is a valuable medicinal herb in Vietnam and many other Asian countries It contains many beneficial ingredients which are effective in preventing and treating human diseases One of these ingredients is total triterpenoid content which is used for estimating its quality However, the total triterpenoid content can vary during the growth of this fungus Presently, understandings on the variation of the total triterpenoid content in fruiting body through the growth stages of this species is still very few in Vietnam Therefore, the objective of this thesis is “Investigating the variation of the total triterpenoid content in fruiting body of Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst through its growth stages” This understanding can help in determining the best time for the harvest of fruiting bodies with expected high total triterpenoid contents In the present study, Lingzhi was planted on rubber sawdust And, the results of analysis showed that chemical components of Lingzhi is composed of lipid, carotenoid, triterpenoid, coumarin, cardiac glycosides, tannins, saponins, polyphenols, organic acids and reductants Detection the presence of total triterpenoid was examined by Liebermann Burchard reaction and thin layer chromatography with Toluene – Ethylacetat – Formic acid solvent After Soxhlet extraction, the weighing method was applied and showed that the total triterpenoid content on a basis of dry weight was increasing within growth stage and highest at week to 10 of the experiment; 4,51 and 4,54%, respectively This result introduced the best time for the haverst of Ganoderma lucidum fruiting body with highest triterpenoid content should be from 8th to 10th week of the cultivation In addition, in comparison to Japanese “Lingzhi”, the results of the high liquid performance chromatography analyse showed the composition of the triterpenoid ingredient of Japanese “Lingzhi” was more diverse than Vietnam “Lingzhi”, Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst Key words: Ganoderma lucidum, Lingzhi, total triterpenoid content, growth stage, fruiting bodies iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH SÁCH CÁC BẢNG .x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan nấm Linh chi 2.1.1 Vị trí phân loại 2.1.2 Đặc điểm sinh thái phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái – cấu trúc nấm Linh chi 2.1.4 Đặc điểm nuôi trồng nấm Linh chi 2.1.4.1 Các thơng số thích hợp nuôi trồng .4 2.1.4.2 Tình hình phát triển trồng nấm Linh chi 2.1.5 Tác dụng dược lý nấm Linh chi 2.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi 2.3 Giới thiệu nhóm triterpenoid 10 2.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng triterpenoid nấm Linh chi 12 2.4.1 Sắc ký lớp mỏng 12 2.4.2 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm 14 3.2 Đối tượng nghiên cứu 14 3.2.1 Nguyên liệu: 14 3.2.2 Dung mơi, hố chất sử dụng 15 iv 3.2.3 Thiết bị sử dụng 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Quy trình trồng nấm 16 3.3.2 Thiết kế thí nghiệm 17 3.3.3 Mơ tả nấm Linh chi thí nghiệm 18 3.3.4 Xác định đường cong tăng trưởng 18 3.3.5 Thử độ tinh khiết dược liệu 18 3.3.5.1 Xác định độ ẩm 18 3.3.5.2 Xác định độ tro 18 3.3.6 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật nấm Linh chi 19 3.3.7 Định tính triterpenoid toàn phần 22 3.3.7.1 Định tính phản ứng hố học Liebermann- Burchard 22 3.3.7.2 Định tính triterpenoid tồn phần SKLM 22 3.3.7.3 Định tính triterpenoid tồn phần HPLC pha đảo 23 3.3.8 Định lượng triterpenoid toàn phần chiết - cân 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Mô tả nấm Linh chi thí nghiệm 25 4.1.1 Đặc điểm hình thái – cấu trúc 25 4.1.2 Soi bột 25 4.13 Xác định tên khoa học 26 4.2 Phân tích sơ thành phần hoá thực vật phản ứng hoá học 31 4.3 Thử độ tinh khiết dược liệu 31 4.3.1 Độ ẩm 31 4.3.2 Độ tro 32 4.4 Sự tăng trưởng mẫu nấm Linh chi thí nghiệm 33 4.5 Định tính triterpenoid 35 4.5.2 Định tính triterpenoid phương pháp HPLC 37 4.6 Định lượng triterpenoid phương pháp cân 41 4.6.1 Chiết Soxhlet tinh chế 41 4.6.2 Hàm lượng triterpenoid toàn phần 41 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 v 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 47 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 48 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHCl3: Cloroform DĐVN: Dược Điển Việt Nam EtOH: Ethanol FeCl3: Ferric chloride HCl: Chlohydric Acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) H2SO4: Sulfuric Acid KOH: Potassium Hydroxide MeOH: Methanol Na2CO3: Sodium carbonate PDA: Photo Diod Array PL: Phụ lục SKLM: Sắc ký lớp mỏng TLC: Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TNHH: Trách nhiệm hữu hạn TT: Thuốc thử UV: Ultraviolet VS: Vanillin – sulfuric vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân loại Linh chi theo màu sắc – công dụng Bảng 2.2 Thành phần chất có hoạt tính Linh chi Bảng 3.1 Quả thể nấm Linh chi dùng nghiên cứu 15 Bảng 3.2 Phản ứng xác định nhóm hợp chất 21 Bảng 4.1 Kết sơ thành phần hoá thực vật .31 Bảng 4.2 Kết khảo sát độ ẩm mẫu thể nấm Linh chi .31 Bảng 4.3 Kết khảo sát độ tro toàn phần mẫu thể nấm Linh chi .32 Bảng 4.4 Kết khảo sát độ tro không tan acid 32 Bảng 4.5 Khối lượng thể Linh chi thí nghiệm giai đoạn tăng trưởng 33 Bảng 4.6 Vị trí vết chất SKLM 37 Bảng 4.7 Kết chiết Soxhlet với dung môi methanol 41 Bảng 4.8 Kết tinh chế cao methanol qua cột Diaion HP - 20 41 Bảng 4.9 Hàm lượng triterpenoid toàn phần 42 Bảng 4.10 Khối lượng triterpenoid tồn phần theo khối lượng trung bình thể .42 viii Hình 4.10 Sắc ký đồ HPLC mẫu thể Linh chi VINA 39 Hình 4.11 Sắc ký đồ HPLC mẫu thể nấm Linh chi Nhật Kết HPLC cho thấy sắc ký đồ hai mẫu nấm Linh chi chủng Việt Nam (Linh chi 10 tuần tuổi Linh chi VINA) giống khác với sắc ký đồ Linh chi Nhật Do đó, sắc ký đồ HPLC dùng làm dấu vân tay hỗ trợ cho việc định danh mẫu nấm 40 4.6 Định lượng triterpenoid phương pháp cân 4.6.1 Chiết Soxhlet tinh chế Bảng 4.7 Kết chiết Soxhlet với dung môi methanol Mẫu thể tuần tuần tuần tuần 10 tuần VINA NB M (g) 20 20 20 20 20 20 20 M1 (g) 2,4901 2,0098 1,8503 1,7863 1,8894 1,4224 1,9710 Hiệu suất chiết (%) 12,45 10,05 9,25 8,93 9,45 7,11 9,85 M: Khối lượng bột nấm đem chiết chưa tính độ ẩm M1: Khối lượng cao methanol lần chiết Soxhlet Sau chiết Soxhlet với 20 g bột thể mẫu nấm Linh chi loại dung môi MeOH, thu khối lượng cao methanol đạt 1,4224 – 2,4901 g, cao methanol từ mẫu Linh chi thí nghiệm tuần tuổi cao nhất, đạt 2,4901 g; lượng cao methanol từ mẫu Linh chi VINA lại thấp, đạt 1,4224 g (Bảng 4.7) Hiệu suất chiết Soxhlet mẫu nấm Linh chi loại nói đạt từ 7,11 – 12,45% Hiệu suất chiết khơng cao nén chặt cho mẫu vào túi giấy (do bột nấm phồng, nhẹ) khiến dung môi chưa tiếp xúc tốt với phần bột nấm bên Tuy nhiên, kiểm tra lại dịch chiết SKLM khơng thấy vết triterpenoid, đó, lượng triterpenoid sót lại chiếm tỷ lệ nhỏ, khơng đáng kể Bảng 4.8 Kết tinh chế cao methanol qua cột Diaion HP - 20 Mẫu thể tuần tuần tuần tuần 10 tuần VINA NB M2 (g) 1,0112 1,1519 1,0108 1,0113 1,0114 1,0019 1,0115 M3 (g) 0,2585 0,2257 0,3615 0,4245 0,4217 0,4220 0,2889 Hiệu suất tinh chế (%) 25,56 19,59 35,76 41,98 41,69 42,12 28,56 M2: Khối lượng cao methanol đem tinh chế qua cột Diaion HP - 20 M3: Khối lượng triterpenoid toàn phần sau tinh chế 4.6.2 Hàm lượng triterpenoid toàn phần Theo dẫn liệu từ tài liệu Nguyễn Thị Thu Hằng (2009), mẫu Linh chi Nhật có khối lượng triterpenoid 0,637 g, chiếm tỷ lệ 2,47% mẫu Linh chi Việt Nam 41 có khối lượng triterpenoid 0,5745 g (2,26%), 0,7026 g (2,58%) 1,2456 g (4,61%) Do hàm lượng triterpenoid thu nhận từ quy trình chiết tinh chế thí nghiệm chúng tơi chấp nhận (Bảng 4.7, 4.8 4.9) Bảng 4.9 Hàm lượng triterpenoid toàn phần Mẫu thể M (g) tuần tuần tuần tuần 10 tuần VINA NB 20 20 20 20 20 20 20 M’ (g) M1 (g) 2,4901 17,73 2,0098 18,08 1,8503 17,47 1,7863 16,64 1,8894 17,36 1,4224 17,70 1,9710 17,54 M: Khối lượng bột nấm đem chiết chưa tính độ ẩm M’: Khối lượng bột nấm đem chiết tính độ ẩm M1: Khối lượng cao methanol Triterpenoid toàn phần (g) 0,6365 0,3937 0,6617 0,7499 0,7877 0,5991 0,5629 Hàm lượng (%) 3,59 2,18 3,79 4,51 4,54 3,38 3,21 Bảng 4.10 Khối lượng triterpenoid tồn phần theo khối lượng trung bình thể Mẫu thể Mtb (g) tuần tuần tuần tuần 10 tuần VINA Nhật 0,3760 1,7535 7,7458 12,3366 14,7826 28,6202 31,8511 Hàm lượng triterpenoid toàn phần (%) Khối lượng triterpenoid toàn phần (g) 3,59 2,18 3,79 4,51 4,54 3,38 3,21 0,0135 0,0382 0,2934 0,5560 0,6708 0,9687 1,0222 Kết tinh chế cao methanol qua cột Diaion HP - 20 từ mẫu thể Linh chi thí nghiệm chúng tơi cho thấy khối lượng triterpenoid toàn phần đạt từ 0,3937 g (mẫu tuần tuổi) – 0,7877 g (mẫu 10 tuần tuổi) Khối lượng triterpenoid tồn phần tính 20 g bột thể tính độ ẩm cho thấy hàm lượng triterpenoid thể nấm Linh chi thí nghiệm tăng dần theo thời gian sinh trưởng nấm, từ tuần đến 10 tuần tuổi, chứng tỏ triterpenoid toàn phần tích luỹ dần thể theo thời gian tăng trưởng không tổng hợp thể hoàn toàn trưởng thành (Linh chi tuần tuổi chứa triterpenoid toàn phần đạt hàm lượng 3,59%) Kết phù hợp với dẫn liệu Reiji Miyahara ctv (1985): Triterpenoid tổng hợp ngày thứ sau cho thể Trong mẫu nấm thí nghiệm, mẫu 42 thể nấm Linh chi 10 tuần có hàm lượng triterpenoid tồn phần cao mẫu lại (Hình 4.13) Tuy nhiên, tính hàm lượng triterpenoid tồn phần khối lượng tồn thể, khối lượng trung bình mẫu Linh chi VINA Linh chi Nhật cao mẫu Linh chi thí nghiệm nhiều nên dẫn đến hàm lượng triterpenoid khối lượng toàn thể mẫu nấm cao mẫu nấm Linh chi thí nghiệm Cụ thể, mẫu thể Linh chi Nhật đạt 1,0222 g mẫu thể Linh chi VINA đạt 0,9687 g, mẫu Linh chi thí nghiệm 10 tuần tuổi đạt cao 0,6708 g (Bảng 4.10) Hàm lượng (%) Khối lượng triterpenoid toàn phần (g) 1.4 Expon (Khối lượng triterpenoid toàn phần (g)) 4.5 1.2 Hàm lượng (%) 3.5 y = 0.0061e1.0489x R2 = 0.9122 ợng triterpenoid to ối l Kh 0.8 2.5 0.6 1.5 0.4 0.2 0.5 0 10 Tuổi thể (Tuần) Hình 4.12 Hàm lượng triterpenoid tồn phần thể Linh chi thí nghiệm qua giai đoạn tăng trưởng (Theo số liệu bảng 4.10) 43 Số lần (theo khối lượng triterpenoid toàn phần) Expon (Số lần (theo khối lượng triterpenoid toàn phần)) 60 y = 0,4501e1,0489x R2 = 0,9122 50 49.7 Số lần 41.2 40 30 21.7 20 10 2.8 10 Tuổi thể (Tuần) Hình 4.13 Sự gia tăng hàm lượng triterpenoid toàn phần thể Linh chi thí nghiệm qua giai đoạn tăng trưởng (Theo số liệu bảng 4.10) Từ dẫn liệu trên, nhận xét hàm lượng triterpenoid tồn phần phụ thuộc vào giai đoạn tăng trưởng (so với tuần tuổi Linh chi thí nghiệm); phụ thuộc vào điều kiện kỹ thuật nuôi trồng chủng (Linh chi VINA so với Linh chi thí nghiệm); phụ thuộc vào chất di truyền (chủng Linh chi Nhật so với Linh chi VINA Linh chi thí nghiệm) Kết thực nghiệm cho thấy mẫu thể nấm Linh chi thí nghiệm mẫu thể nấm Linh chi VINA Linh chi Nhật chứa hàm lượng triterpenoid toàn phần mức thấp Điều phù hợp với nhận xét Cổ Đức Trọng (2003), nhìn chung, nấm Linh chi ni trồng TPHCM có hàm lượng hoạt chất triterpenoid tồn phần thấp (trích dẫn Lê Xuân Thám, 1998) 44 Khi tiến hành so sánh đa dạng thành phần triterpenoid toàn phần mẫu thể nấm Linh chi 10 tuần tuổi, Linh chi VINA Linh chi Nhật kết cho thấy rằng: Thành phần triterpenoid toàn phần mẫu Linh chi Nhật đa dạng (có nhiều đỉnh sắc ký đồ HPLC hình 4.12)  Thảo luận đường cong tăng trưởng khối lượng thể hàm lượng triterpenoid: Những kết từ hình 4.5 hình 4.12 cho thấy đồ thị tăng trưởng khối lượng thể hàm lượng triterpenoid có dạng sigmoid Chúng có giai đoạn: lag phase, exponential phase saturation phase, giai đoạn có thời gian diễn tiến theo thời gian tương tự đồ thị Đặc biệt, quan tâm đặt vào đồ thị biểu diễn tăng trưởng hàm lượng triterpenoid tồn phần (Hình 4.12), nhận thấy giai đoạn lag phase xảy tuần tuổi trồng tuần tuổi trồng, thể nhỏ Trong đó, giai đoạn exponential phase – giai đoạn có tăng trưởng vượt bậc theo hàm số mũ – xảy tuần thứ đến tuần thứ 8; hàm số tương quan có dạng thức hàm số mũ có hệ số tương quan cao R2 = 91,22% (Hình 4.12) Từ tuần thứ 10 trở đi, nói hàm lượng triterpenoid tồn phần có dấu hiệu bắt đầu vào giai đoạn bão hòa Hình 4.13 cho thấy hàm lượng triterpenoid tồn phần tuần thứ 4,51% (gấp 41,2 lần so với tuần thứ 2) hàm lượng triterpenoid tồn phần tuần thứ 10 tuần 49,7 lần Nghĩa là, hàm lượng triterpenoid toàn phần tuần thứ 1,2 lần Trái lại, hàm lượng triterpenoid tuần thứ so với tuần thứ 1,9 tuần thứ 14,7 lần Về ý nghĩa ứng dụng thực tế, kết khảo sát đồ thị tăng trưởng hàm lượng triterpenoid (Hình 4.12 hình 4.13) cho thấy để thu hoạch thể nấm Linh chi có hàm lượng triterpenoid cao nên tuần thứ 10; hàm lượng triterpenoid bắt đầu vào giai đoạn bão hòa Tuy nhiên, hiệu kinh tế, nên thu thể tuần thứ 8, chi phí đầu tư thêm tuần (25% thời gian nuôi trồng) thu thêm 20,7% hàm lượng triterpenoid Vấn đề cần phải nghiên cứu Ngoài ra, cần nói rằng, thể Linh chi 10 tuần tuổi bắt đầu hóa gỗ, khơng rõ hàm lượng triterpenoid bão hòa hay suy giảm tuần tuổi sau 10 tuần Vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu sâu 45 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mẫu thể Linh chi thí nghiệm thuộc lồi Ganoderma lucidum, chủng Việt Nam Mẫu Linh chi thí nghiệm chứa chất béo, carotenoid, alkaloid, triterpenoid, coumarin, glycosid tim, saponin, polyphenol, acid hữu chất khử Bột thể Linh chi thí nghiệm, Linh chi VINA Linh chi Nhật có độ ẩm 9,6% – 16,82%; 11,52% 12,30%; độ tro toàn phần 2,84% – 2,97%, 3,81% 3,11%; tro không tan acid chlohydric 0,02% - 0,03%; 0,11% 0,08% Phát triterpenoid thể mẫu nấm khảo sát thông qua phản ứng Liebermann - Burchard SKLM hệ Toluen: Ethyl Acetat: Acid formic 75: 24: Đường cong sinh trưởng đồng dạng đường cong tăng trưởng hàm lượng triterpenoid toàn phần: dạng hàm số mũ luỹ tiến có giai đoạn: tăng trưởng chậm (2 – tuần tuổi); tăng trưởng vượt bậc (4 – tuần tuổi), xu hướng bão hoà 10 tuần tuổi Triterpenoid tích luỹ song song với q trình sinh trưởng Hàm lượng triterpenoid tồn phần nấm thí nghiệm đạt 2,18% – 4,54%, cao tuần 10 tuần tuổi Hàm lượng Linh chi VINA Linh chi Nhật 3,38% 3,21%, Linh chi Nhật có thành phần triterpenoid đa dạng Linh chi Việt Nam Sắc đồ HPLC mẫu Linh chi Việt Nam có đỉnh giống thời gian lưu khác với sắc đồ HPLC mẫu Linh chi Nhật Do vậy, sử dụng HPLC làm dấu vân tay việc định danh, giúp đánh giá chất lượng mẫu nấm Do đó, định lượng triterpenoid tồn phần phương pháp cân kết hợp sắc ký đồ HPLC giúp bước đầu đánh giá hàm lượng triterpenoid toàn phần mẫu thể nấm Linh chi 5.2 Đề nghị Tiếp tục khảo sát hàm lượng triterpenoid toàn phần thể nấm tuần để xác định suy giảm hàm lượng triterpenoid toàn phần (nếu có) Nghiên cứu chất chuẩn triterpenoid: phân tách triterpenoid sau định tính, định lượng sơ bộ, từ hy vọng tạo chất chuẩn triterpenoid từ mẫu nấm Việt Nam, giúp cho việc định tính định lượng triterpenoid tồn phần có nấm hiệu hơn, đánh giá chất lượng nấm tốt 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 1999 Bài giảng chiết xuất dược liệu Tài liệu giảng dạy sinh viên dược Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh 2007 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Bộ Y tế 2002 Dược điển Việt Nam III Bộ Y tế Nguyễn Văn Đàn Nguyễn Viết Tựu 1985 Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc Nhà xuất Y học, chi nhánh Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thu Hằng 2009 Khảo sát hàm lượng triterpenoid nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.) Karst lưu hành thị trường Thành phố Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Trần Hùng Bộ mơn Dược liệu ĐH Y Dược TP.HCM 2003 Giáo trình thực tập dược liệu Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp Hồ Chí Minh Lê Xuân Thám 1998 Nấm Linh chi thuốc quý Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lê Duy Thắng 2001 Kỹ thuật trồng nấm Nhà xuất Nơng nghiệp, Tp Hồ Chí Minh 10 Trịnh Thị Huyền Trang 2010 Tiêu chuẩn hoá nấm Thượng hồng Khố luận tốt nghiệp kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 11 Cổ Đức Trọng 2006 Linh chi huyền diệu Nhà xuất Trẻ, Tp Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Duy Đại Hướng dẫn kỹ thuật trồng nấm Linh chi 2009 http://www.linhchinano.com 13 Hồng Minh Hảo Nguyễn Bình Kha Cơng nghệ tách chiết hợp chất thiên nhiên http://mt.lhu.edu.VINA/Data/News/388/file/hop_chat_thien_nhien.pdf 47 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 14 Anna Stochmal, Wieslaw Oleszek and Ireneusz Kapusta 2008 TLC of Triterpenes (Include Saponins) Thin Layer Chromatography in Phytochemistry Monika Waksmundzka Hajnos, Joseph Sherma, Teresa Kowalska Taylor and Francis Inc CRC Press, New York, pp: 519 – 542 15 Bert Kruiswijk Thin layer chromatography visualisation reagents 2005 www.namedorganicreactions.co.uk/example%20tlc.pdf, pp: – 21 16 Bhosle S et al 2010 Taxonomy and Diversity of Ganoderma from the Western parts of Maharashtra (India) Mycosphere 1(3), pp: 249–262 17 J.T Xie , C.Z Wang , S Wicks, J.J Yin, J Kong, J Li, Y.C Li and C.S Yuan 2006 Ganoderma lucidum extract inhibits proliferation of SW 480 human colorectal cancer cells Experimental Oncology, pp: 25 - 29 18 Jiang Jing Gao, Akiko Hirakawa, Byung Sun Min, Norio Nakamura and Masao Hattori 2006 In vivo antitumor effects of bitter principles from the antlered form of fruitinging bodies of Ganoderma lucidum The Japanese Society of Pharmacognosy and Springer-Verlag, pp: 42 – 47 19 Hildebert Wagner, Sabine Bladt and V Rickl 1996 Plant drug analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, second edition Springer, USA 20 Masao Hirotani and Tsutomu Furuya 1990 Chances of the triterpenoid patterns during formation of the fruiting body in Ganoderma lucidum Phytochemistry, Vol 29, No 12, pp: 3767-3771 21 Nyoman P Aryantha, Andi Adinda and Suswini Kusmaningat 2001 Occurrence of triterpenoids and polysaccharides on Ganoderma tropicum with Ganoderma lucidum as reference Australasian Mycologist, pp: 123 - 128 22 Reiji Miyahara, Tomotaka Yosshimoto and Kazutaka Asawa 1985 Chemical Structures and Changes of Extracts during Growth of Reishi (Ganoderma lucidum) Faculty of Agriculture, Japan 23 R Russellm and M Paterson 2006 Ganoderma – A therapeutic fungi biofactory Phytochemistry Elsevier Ltd, pp: 1986 - 1998 24 Shashi B Mahato, Ashoke K Nandy and Gita Roy 1992 Triterpenoid Phytochemistry, vol 31, No Pergamon Press Ltd, Great Britain 25 Y Chen, Y Yan, M Y Xie S P Nie, W Liu, X F, Gong, Y, X Wang 2008 Development of a chromatographic fingerprint of Ganoderma lucidum, Ganoderma japonicum and Ganoderma capsules by micellar electrokinetic chromatography A, pp 119 – 126 48 PHỤ LỤC Bảng Bảng ANOVA cho khối lượng tươi thể nấm Linh chi số liệu Bảng 4.5 Tukey HSD Subset for alpha = 0.5 Tuan N 0,375933 1,753533 12,33667 10 14,78263 Sig 7,745833 0,653736 0,179963 Bảng Bảng ANOVA cho khối lượng khô thể nấm Linh chi số liệu Bảng 4.5 Tukey HSD Subset for alpha = 0.5 Tuan N 1,408133333 6,088633333 39,1042 10 46,5727 Sig 29,14406667 0,381553631 0,076939944 Bảng Bảng ANOVA cho khối lượng tươi, khối lượng khô hàm lượng nứơc số liệu Bảng 4.5 Khoi luong tuoi Khoi luong kho Ham luong nuoc Tuoi N Mean Std Deviation Std Error 10 Total 10 Total 10 Total 3 3 15 3 3 15 3 3 15 1,40813 6,08863 29,1441 39,1042 46,5727 24,4635 0,37593 1,75353 7,74583 12,3367 14,7826 7,39892 73,3733 71,4733 73,4833 68,4333 68,3567 71,024 0,285858992 1,102057096 3,96245556 4,519088788 2,946063097 18,66045867 0,083675823 0,448988578 1,236514312 1,333651444 1,995695674 5,950023485 1,698244191 2,656733583 0,738195999 0,394250343 2,35850235 2,792819364 0,1650408 0,636273 2,2877248 2,6090971 1,7009103 4,8181097 0,0483103 0,2592237 0,7139019 0,769984 1,1522154 1,5362895 0,9804817 1,5338658 0,4261977 0,2276205 1,361682 0,7211029 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound 0,698020231 2,118246436 1,1346 049 3,35097174 8,826294927 4,9843 7,1884 19,30078138 38,98735195 24,6135 31,963 27,87816112 50,33023888 35,3409 44,1164 39,25427356 53,89112644 43,232 48,799 14,1297291 34,79736424 1,1346 48,799 0,168071066 0,5837956 0,2847 0,4491 0,638183874 2,868882793 1,2691 2,1557 4,6741615 10,81750517 6,322 8,5499 9,023692821 15,64964051 11,131 13,7692 9,825050448 19,74021622 12,525 16,3116 4,103906822 10,69393318 0,2847 16,3116 69,15466089 77,59200577 71,55 74,91 64,87364125 78,07302542 69,87 74,54 71,64955281 75,31711385 72,89 74,31 67,45396119 69,41270548 68,01 68,79 62,49782204 74,2155113 66,57 71,03 69,47738819 72,57061181 66,57 74,91 Bảng Số liệu HPLC Linh chi 10 tuần PKNO ChNO TIME AREA HEIGHT -20 11.964 11737 787 -21 12.566 20384 1218 -22 13.142 17326 1010 23 15.052 3973 318 -24 15.618 16860 854 -25 16.929 34540 1224 -26 18.493 34111 1191 -27 19.275 7783 474 -28 20.164 105488 3921 -29 21.142 40421 1724 -30 21.735 43940 1760 -31 22.650 17979 707 -32 25.259 14429 520 -33 25.895 45290 1414 -34 29.685 260105 8125 -35 30.910 9855 423 -36 32.211 109178 2466 -37 36.015 24647 816 -38 40.358 163808 4149 -39 43.684 105424 1843 -40 47.398 53907 1115 -41 60.827 80842 1550 -42 62.909 92363 1685 Bảng Số liệu HPLC Linh chi VINA PKNO ChNO TIME AREA HEIGHT -20 12.230 6998 556 -21 12.889 35855 1809 -22 13.951 10248 774 -23 14.372 6280 493 -24 15.375 121218 2337 -25 16.684 26876 1280 -26 19.930 154498 5531 -27 20.842 38059 1604 -28 21.433 47833 1877 -29 24.963 81635 2036 -30 25.551 94423 2540 -31 29.421 434152 13136 -32 30.688 106527 2465 -33 31.935 477667 6187 -34 33.988 74683 1701 -35 36.933 71693 1994 -36 40.081 297700 7528 -37 43.728 688759 6322 -38 47.120 576810 4455 -39 60.496 124577 2366 -40 62.728 127534 2241 Bảng Số liệu HPLC Linh chi Nhật PKNO ChNO TIME AREA HEIGHT -20 12.105 34312 1786 21 12.729 13862 802 -22 14.167 21729 1271 -23 14.908 74083 2728 -24 18.599 45608 1881 -25 20.563 30324 1306 -26 21.446 75644 3800 -27 22.194 31284 1437 -28 23.132 295471 8618 -29 24.831 31569 1348 -30 25.924 640747 17307 -31 28.393 95948 3234 -32 29.527 44615 1610 -33 32.183 218954 6814 -34 32.775 314613 8050 -35 38.792 885098 17081 -36 39.949 1163996 26730 -37 43.053 621050 13518 -38 44.371 85956 2169 -39 47.740 401094 6751 -40 50.534 1048970 20638 -41 53.448 1388700 26062 -42 55.524 261448 4311 -43 61.022 169783 3345 -44 62.990 2358529 38117 -45 65.129 1245679 19917 -46 67.360 260651 4597 ... nấm Linh chi thí nghiệm trồng chất mạt cưa cao su theo thời gian sinh trưởng thể: tu n, tu n, tu n, tu n 10 tu n tu i Từ đó, xác định thời gian thể nấm Linh chi có hàm lượng triterpenoid tồn phần... lượng triterpenoid toàn phần từ thể nấm Linh chi thí nghiệm trồng chất giai đoạn tu n, tu n, tu n, tu n 10 tu n tu i  Định tính triterpenoid:  Phương pháp hóa học  Sắc ký lớp mỏng  Sắc ký... toàn phần tăng theo thời gian sinh trưởng, cao vào tu n thứ 10, đạt 4,51% 4,54% tính theo Khối lượng khơ thể nấm Kết cho thấy giai đoạn - 10 tu n tu i thời điểm thích hợp cho việc thu hoạch nấm