BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG Bacillus flexus, Bacillus koreensis, Bacillus pumilus CÓ KHẢ NĂNG DÙNG LÀM CHẾ PHẨM VI SINH Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ VĂN CHÁNH QUY Niên khóa: 2007 – 2011 1      Tháng / 2011 LỜI CẢM ƠN  Với lòng biết ơn sâu sắc Chân thành cảm ơn thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học - Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện học tập truyền đạt kinh nghiệm thật tốt suốt năm đại học Cảm ơn ThS Võ Minh Sơn tận tình hướng dẫn cho tơi hồn thiện luận văn Cảm ơn chị Văn Thị Thúy anh chị Phòng sinh học thực nghiệm – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II bảo nhiệt tình trình thực luận văn Xin cám ơn gia đình bạn bè cổ vũ suốt thời gian qua Lê Văn Chánh Quy 2      TĨM TẮT  Ngành ni trồng thủy sản ngày phát triển mạnh Tuy nhiên việc sử dụng chất kháng khuẩn để phòng bệnh kháng sinh hóa chất gây tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh gây bệnh ngày gia tăng (Balcaza ctv, 2006) Do việc sử dụng chế phẩm vi sinh thay kháng sinh hóa chất trở thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn nuôi trồng thủy sản (Jean ctv, 2003) Các chủng Bacillus có khả sản sinh sản phẩm thứ cấp như: chất kháng khuẩn, chất diệt trùng, enzyme ngoại bào; kích thích hệ thống miễn dịch, kháng virus (Wang ctv, 2008; Ciprandi ctv, 1986) Những thử nghiệm định tính khả sinh enzyme ngoại bào, khảo sát nhiệt độ, pH, nồng độ muối thử nghiệm khả chịu đựng pH dày, muối mật, khả phân hủy tín hiệu quorum sensing khả tương thích chủng vi khuẩn Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus thực Kết cho thấy tất chủng Bacillus sp thử nghiệm có khả sinh enzyme ngoại bào; chủng Bacillus koreensis thích nghi với khoảng nhiệt độ từ 30 - 400C, chủng Bacillus pumilus thích nghi 300C, chủng Bacillus flexus thích nghi tốt 350C; chủng Bacillus flexus Bacillus pumilus thích nghi tốt pH7 pH8, chủng Bacillus koreensis thích nghi tốt pH6 pH7; chủng Bacillus pumilus thích nghi với nồng độ muối 1%, chủng Bacillus flexus thích nghi tốt với nồng độ muối 1%, chủng Bacillus koreensis thích nghi với nồng độ muối 0-1%; với thử nghiệm khả chịu đựng pH dày chủng Bacillus pumilus Bacillus koreensis chịu đựng tốt pH2 pH3, Bacillus flexus chịu đựng pH3; thử nghiệm khả chịu đựng muối mật nhìn chung chủng Bacillus sp chịu đựng tốt có khả tăng trưởng nồng độ muối mật 0,5% thời điểm giờ, - 2% thời điểm giờ, thời điểm sau chủng bắt đầu phân hủy HHL mạnh thể qua tốc độ phân hủy thời điểm 24 từ 0,12- 0,18 ppm/ giờ, chủng thử nghiệm khơng đối kháng nên trộn chung sử dụng làm chế phẩm vi sinh 3      4      SUMMARY "Surveying biological characteristics of strains of Bacillus flexus, Bacillus koreensis, Bacillus pumilus that are capable to use as probiotic" in aquaculture Aquaculture industry is growing strongly However, the use of antimicrobial compounds to prevent diseases such as antibiotics and chemicals have caused the situation of antibiotic-resistant bacterial pathogens is increasing (Balcaza et al, 2006) Therefore the use of microbial preparations to replace antibiotics and chemicals have become a promising approach in aquaculture (Jean et al, 2003) The Bacillus strains can produce secondary products such as antibacterial, insecticides, extracellular enzyme; stimulate the immune system, anti-virus (Wang et al, 2008; Ciprandi et al, 1986) The extracellular enzymes production, temperature, pH, salt concentration and gastric pH, bile salts endurance, the breakdown of quorum sensing signal and compatibility of the Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus were tested The results showed that all strains of Bacillus sp tested were capable of generating extracellular enzymes; Bacillus koreensis adapted temperatures between 30 - 400C, Bacillus pumilus only adapted at 300C, Bacillus flexus adapted at 350C well; Bacillus pumilus and Bacillus flexus adapted at pH7 and pH8, Bacillus koreensis well-adapted at pH6 and pH7; Bacillus pumilus adapted to 1% salt concentration, Bacillus flexus well adapted to the 1% salt concentration , strain Bacillus koreensis adapted to salinity - 1% salt concentration, the test of gastric pH endurance, the strain Bacillus pumilus and Bacillus koreensis well - beared in pH and pH 3, Bacillus flexus just stand at pH 3; test of endurance bile salts endurance are generally all three strains of Bacillus sp endure well and has the ability to grow at 0,5% concentration of bile salts in the time of hours, - 2% concentration of bile salts at the time of hours; in the time after hours, three strains start to disintegrate HHL expressed decomposition rates at the time of 24 hours from 0,12 to 0,18 ppm/h The strains could be used as a mixed microbial preparation.  5      Keywords: probiotics, pH, temperate, salt, HHL, bile, Bacillus pumilus, Bacillus flexus, Bacillus koreensis iii 6      MỤC LỤC  Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng .viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 13 1.2 Yêu cầu đề tài 15 1.3 Nội dung thực 15 1.3.1 Phương pháp định tính enzyme ngoại bào 15 1.3.2 Thử nghiệm khả chịu muối 15 1.3.3 Thử nghiệm ảnh hưởng pH 15 1.3.4 Thử nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ 15 1.3.5 Thử nghiệm khả chịu đựng pH dày (pH 2, pH 3) 15 1.3.6 Thử nghiệm khả chịu đựng muối mật (0,5%; 1%; 2%) 16 1.3.7 Thử nghiệm khả phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing 16 1.3.8 Khảo sát khả tương thích chủng thí nghiệm 16 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17 2.1 Tổng quan probiotic - chế phẩm vi sinh nuôi trồng thủy sản 17 2.1.1 Định nghĩa probiotic 17 2.1.2 Đặc điểm chung probiotic 17 2.1.3 Các chế tác động probiotic 18 2.1.4 Vai trò probiotic nuôi trồng thủy sản 20 2.1.5 Tình hình nghiên cứu probiotic ứng dụng thủy sản 20 7      2.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus 21 2.2.1 Đặc điểm chung chi Bacillus 21 2.2.2 Dinh dưỡng sinh trưởng 23 2.2.3 Quá trình tạo bào tử Bacillus 23 2.2.4 Ứng dụng Bacillus nuôi trồng thủy sản 25 iv 2.3 Khái quát hệ thống quorum sensing 26 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 3.1.1 Thời gian tiến hành 29 3.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 29 3.2 Vật liệu nghiên cứu 29 3.2.1 Nguồn vật liệu 29 3.2.2 Mơi trường hóa chất 29 3.2.3 Thiết bị, dụng cụ 30 3.3 Nội dung thử nghiệm 31 3.4 Phương pháp nghiên cứu 31 3.4.1 Phương pháp định tính enzyme ngoại bào 31 3.4.2 Khảo sát đặc tính sinh lý 33 3.4.3 Khảo sát khả phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing 36 3.4.4.Khảo sát đặc tính tương thích chủng vi khuẩn Bacllus 37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1.Kết 39 4.1.1 Phương pháp định tính enzyme ngoại bào 39 4.1.2 Thử nghiệm ảnh hưởng muối, pH, nhiệt độ 41 4.1.2.1.Thử nghiệm ảnh hưởng nồng độ muối lên vi khuẩn 41 4.1.2.2 Thử nghiệm ảnh hưởng pH 42 4.1.2.3 Thử nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ 43 4.1.3 Thử nghiệm khả chịu đựng pH dày muối mật 44 8      4.1.3.1 Thử nghiệm khả chịu đựng acid dày 44 4.1.3.2 Thử khả chịu đựng muối mật 46 4.1.4 Khảo sát khả phân hủy phân tử quorum sensing 49 4.1.5 Kết kiểm tra tương thích chủng vi khuẩn Bacillus sp 52 4.2.Thảo luận 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Đề nghị 56 v TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 9      DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  Ký hiệu viết tắt Nội dung Ctv công tác viên EPA eicosapentaenoic acid  DHA docosahexaenoic acid PUFAs polyunsaturated fatty acids BAMPs bacteria associated molecular patterns UV tia cực tím μm micromet AHL N-acyl homoserine lactone HHL N- hexanoyl- L- Homoserin lacton  nm nanomet cfu Colony forming unit  v/p vòng/phút SE standard error 10      Sig, 1 h2 Tukey HSD Vikhuan N Subset for alpha = ,05 93,61315 3 Sig, c 95,26972 b 99,08807 1 a h3 Tukey HSD Vikhuan N Subset for alpha = ,05 3 91,00867 3 Sig, c 92,74876 b 98,3497 a 1 h6 Tukey HSD 76      Vikhuan N Subset for alpha = ,05 3 82,62003 3 c 90,82241 b 97,14374 Sig, 1 a pH Std h1 h2 N Mean Deviation Error 99,84898 0,13189 0,076147 99,66867 0,07357 0,042476 3 104,4022 8,338194 4,814059 Total 101,3066 4,773206 1,591069 99,49941 0,11444 0,066072 99,39043 0,087125 0,050302 3 96,5182 0,215906 0,373959 77    Std   h3 h6 Total 98,46935 1,477764 0,492588 99,30547 0,226077 0,130526 98,66322 0,323235 0,18662 3 94,94824 0,355832 0,20544 Total 97,63898 2,054367 0,684789 98,5434 0,100698 0,058138 97,42395 0,178848 0,103258 3 93,96449 0,412127 0,237942 Total 96,64395 2,080008 0,693336 h1 Tukey HSD ph3 N Subset for alpha = ,05 99,66867 a 99,84898 a 3 104,4022 a Sig, 0,493303 h2 Tukey HSD ph3 N Subset for alpha = ,05 3 96,5182 99,39043 a 99,49941 a 78      Sig, 0,836959 a h3 Tukey HSD ph3 N Subset for alpha = ,05 3 94,94824 98,66322 a 99,30547 a Sig, b 0,094019 h6 Tukey HSD ph3 N Subset for alpha = ,05 3 3 Sig, 93,96449 C 97,42395 B 98,5434 1 a *Ghi chú: h1, h2, h3, h6 giờ, giờ, giờ, giờ; 1, 2, chủng Bacillus pumilus, Bacillus flexus, Bacillus koreeenis, 79      Bảng 10 Kết xử lý One-Way ANOVA , Tukey phần mềm SPSS thí nghiệm ảnh hưởng muối lên tăng trưởng, Std N B.pumilus 0,3 0,06 0,034641 0,46 0,052915 0,030551 0,406667 0,018148 0,010477 3 0,029462 0,384667 0,317333 0,045622 0,290667 0,008327 0,004807 21 0,363905 0,067322 0,014691 0,183333 0,015275 0,008819 0,567333 0,015535 0,008969 0,282667 0,035233 0,020342 3 0,26 0,085135 0,049153 0,050333 0,000577 0,000333 0,047333 0,000577 0,000333 0,043667 0,000577 0,000333 21 0,204952 0,182317 0,039785 0,484667 0,053267 0,030754 0,499333 0,012858 0,007424 0,348 0,051884 0,029956 3 0,099333 0,001155 0,000667 0,109333 0,007095 0,004096 0,053667 0,002517 0,001453 0,053333 0,003512 0,002028 Total B.koreensis Deviation Error Total B.flexus Mean 0,388 0,01701 0,00611 0,003528 80    Std 0,02634   Total 21 0,235381 0,193222 0,042165 B.pumilus Tukey HSD Mmb N Subset for alpha = ,05 0,290667 c c 0,317333 0,317333 0,384667 0,384667 0,384667 abc 3 3 Sig, 0,3 0,388 bc 0,388 0,388 abc 0,406667 0,406667 ab 0,46 a 0,074484 0,116603 0,241935 B.koreensis Tukey HSD Mmb N Subset for alpha = ,05 Sig, 0,053333 C' 0,053667 C' 3 0,099333 C' 0,109333 C' 3 0,484667 A' 0,499333 A' 0,348 0,271269 81    B' 0,994668   B.flexus Tukey HSD mmb N Subset for alpha = ,05 Sig, 0,043667 C 0,047333 C 0,050333 C 0,183333 B 3 0,26 B 0,282667 B 0,567333 A 0,999983 0,05136 82      Bảng 11 Kết xử lý One-Way ANOVA , Tukey phần mềm SPSS thí nghiệm ảnh hưởng pH lên tăng trưởng Std N Deviation Error 0,018667 0,003055 0,001764 0,256 0,028844 0,016653 0,46 0,02488 0,014364 0,948 0,042755 0,024685 0,737667 0,014844 0,289333 0,018502 0,010682 10 0,030667 0,009713 0,005608 21 0,391476 0,332005 0,072449 0,017333 0,005033 0,002906 0,022333 0,005132 0,002963 0,035171 0,020306 0,869333 0,028024 0,01618 0,723333 0,029687 0,01714 0,382333 0,022053 0,012732 10 0,085333 0,025423 0,014678 21 0,351429 0,324274 0,070762 B.pumilus Total B.flexus Total B.koreensis Mean 0,36 0,00857 0,022 0,004 0,002309 0,108667 0,015177 0,008762 0,326667 0,030551 0,017638 0,360333 0,040501 0,023383 0,196333 0,015177 0,008762 83    Std   0,026333 0,005132 0,002963 10 0,015667 0,004509 0,002603 Total 21 0,150857 0,140226 0,0306 B.pumilus Tukey HSD pH N Subset for alpha = ,05 0,018667 e 10 0,030667 e 0,256 d 0,289333 d Sig, 0,46 c 0,737667 b 0,948 a 0,994973 0,615278 1 B.flexus Tukey HSD pH N Subset for alpha = ,05 0,017333 E 0,022333 0,022333 DE 10 D 0,36 C 0,382333 C 0,085333 84      Sig, 0,723333 0,869333 A 0,999969 0,073904 0,907586 85    B 1   B.koreensis Tukey HSD pH N Subset for alpha = ,05 10 0,015667 D' 0,022 D' 0,026333 D' 0,326667 A' 0,360333 A' Sig, 0,108667 C' 0,196333 0,994885 1 B' 0,477002 Bảng 12 Kết xử lý One-Way ANOVA, Tukey phần mềm SPSS ảnh hưởng nhiệt độ B.pumilus B,flexus B.koreensis N Mean Std Deviation Std Error 25 0,473333 0,030551 0,017638 30 0,756667 0,040415 0,023333 35 0,636667 0,060277 0,034801 40 0,5 0,02 0,011547 Total 12 0,591667 0,123644 0,035693 25 0,653333 0,141892 0,081921 30 0,846667 0,061101 0,035277 35 0,976667 0,060277 0,034801 40 0,633333 0,064291 0,037118 Total 12 0,7775 0,166576 0,048086 25 0,130667 0,021197 0,012238 30 0,311333 0,044959 0,025957 35 0,366667 0,021385 0,012347 40 0,366667 0,023094 0,013333 86      Total 12 0,293833 0,104246 B.pumilus Tukey HSD Nd N Subset for alpha = ,05 25 0,473333 C 40 0,5 C 35 30 Sig, 0,636667 B 0,756667 A 0,850839 1 B.flexus Tukey HSD Nd N Subset for alpha = ,05 Sig, 40 0,633333333 B 25 0,653333333 B 30 0,846666667 0,846667 Ab 35 0,976667 A 0,072596663 0,343697 Means for groups in homogeneous subsets are displayed, A Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 87    0,030093   B.koreensis Tukey HSD Nd N Subset for alpha = ,05 25 0,130667 30 0,311333 a 35 0,366667 a 40 0,366667 a Sig, b 0,176186 Means for groups in homogeneous subsets are displayed, A Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Bảng 13 Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme ngoại bào Difco Sporulation Medium (DSM) Bacto nutrient broth (Difco) 8g 10% (w/v) KCl 10 ml 1,2% (w/v) MgSO4·7H2O 10 ml M NaOH 1,5 ml (pH 7,6) Pha lít nước cất lần 7,6, Hấp khử trùng sau làm nguội đến 500 C, Sau thêm vào dung dịch hấp khử trùng sau: M Ca(NO3)2 ml 0,01 M MnCl2 ml mM FeSO4 ml 88      Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme lipase Môi trường I Nutrient broth: 13 g/l CaCl2 x 2H2O: 0,1 g/l Tween 80: 10ml Agar: 20g/l Thành phần pha nước cất lần, ngoại trừ Tween, Môi trường hấp khử trùng 1210 C 15 phút, Tween 80 hấp khử trùng riêng lẻ, Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme amylase Yeast extract: 1g/l Tinh bột: 5g/l Agar: 20g/l Thành phần pha nước cất lần, sau Agar thêm vào , Mơi trường hấp khử trùng 1210 C 15 phút, Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme cellulase Yeast extract: Carboxymethylcellulose sodium salt: Agar: 20 Thành phần pha nước cất lần, sau Agar thêm vào , Môi trường hấp khử trùng 1210 C 15 phút, Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme gelatinase Nutrient broth: 13g/l Gelatin: 10g/l 89      Agar: 20g/l Nước cất: Vừa đủ 1L Môi trường hấp khử trùng 12OC, 20 phút, Thành phần môi trường sử dụng khảo sát enzyme caseinase Skim milk (Difco) : 10g/l Agar: 20g/l Nước cất: Vừa đủ 1L Môi trường hấp khử trùng 121OC, 15 phút   90    ... 2007) Theo khóa phân loại Priest B flexus Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Lồi: Bacillus flexus  B. flexus là vi khuẩn gram dương, có phản ứng catalase dương tính, hình thành nội bào ... Bacillus flexus just stand at pH 3; test of endurance bile salts endurance are generally all three strains of Bacillus sp endure well and has the ability to grow at 0,5% concentration of bile salts... concentration and gastric pH, bile salts endurance, the breakdown of quorum sensing signal and compatibility of the Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus flexus were tested The results