TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM TRONG ĐỒ HỘP GVGD: Ths Nguyễn Thị Thanh Hải Danh sách nhóm: Dương Thị Tuyết Sang 56130245 Đồng Thị Phượng 56136675 Hồ Thúy Sinh 56131970 Trần Minh Thảo 56131861 Huỳnh Chiếm Trọng 56132470 MỤC LỤC MỞ ĐẦU I.TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM: Giới thiệu: Cấu trúc: a Cấu trúc tế bào: b Cấu trúc phân tử: II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTALINUM: 1/ Phương pháp truyền thống .6 1.1/ Thiết bị vật liệu .6 1.2/ Mơi trường, dụng cụ, hóa chất 1.3/ Quy trình phân tích 1.4/ Sơ đồ phân tích .10 1.5/ Kiểm tra độc tố C.botulinum 10 2/ Phương pháp sử dụng môi trường Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypin (TPGYT) 11 2.1/ Chuẩn bị mẫu 11 2.2/ Phát tế bào vi khuẩn: .11 2.3/ Phát độc tố botulin 13 III CLOSTRIDIUM BUTALINUM TRONG ĐỒ HỘP: 14 Các triệu chứng dấu hiệu: .15 Cơ chế hoạt động độc tố Butalinum: 15 Tiệt trùng đồ hộp: .16 KẾT LUẬN 17 MỞ ĐẦU Thực phẩm đóng hộp có thị trường ngày nhiều người sử dụng Là thực phẩm thường dự trữ Nếu mua sử dụng đồ hộp khơng cẩn thận, người có thề bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium Botulinum có đồ hộp, gọi ngộ độc Botulism, gây tử vong, gây phá hủy hệ thần kinh Bệnh ngộ độc Botulism bệnh nhiễm độc độc tố xâm nhập vào thực phẩm, phát triển sinh độc tố Người ăn phải thức ăn có độc tố bị nhiễm độc Còn vi khuẩn thường khơng gây bệnh khơng sinh sản thể người Vi khuẩn Clostridium Botulinum lần công nhận cô lập năm 1896 Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào ổ dịch Botulism Các cô lập ban đầu dặt tên Botulinus baciluss Tuy nhiên, cô lập từ ổ dịch ln ln tìm thấy dạng bào tử kỵ khí, đó, Bengston đề xuất sinh vật đặt vào chi Clostridium C botulinum phân bố khắp nơi đất Đặc biệt nơi đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm Trong loại rau quả, kể mật ong chứa loại khuẩn Chúng có ruột động vật nuôi nhà, ruột cá, có ruột người Do vi khuẩn có nhiều tự nhiên nên dễ nhiễm vào thực phẩm trình sản xuất, chế biến, vận chuyển bảo quản Vì vậy, để việc sử dụng đồ hộp loại thực phẩm khác cách an tồn, nhóm tìm hiểu vi khuẩn C Botulinum việc hình thành độc tố botulin đồ hộp vi khẩn I.TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM: Giới thiệu:  Vực (domain): Bacteria  Ngành (phylum): Firmicutes  Lớp (class): Clostridia  Bộ (ordo): Clostridiales  Họ (familia): Clostridiaceae  Chi (genus): Clostridium  Loài(species): C.Botulinum Clostridium botulinum vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí tuyệt đối (phát triển mơi trường khơng có oxy), hầu hết khơng di chuyển Dưới ảnh hưởng nhiệt độ cao yếu tố môi trường bất lợi, vi khuẩn chuyển thành bào tử hình oval bền vững Vi khuẩn phát triển thuận lợi 3-43°C Ở nhiệt độ thích hợp, khơng có oxy, ẩm ướt pH acid yếu ( pH> 4,6), bào tử biến đổi lại thành vi khuẩn phát triển, tiết độc tố botulin C botulinum có khả sinh nhiều loại độc tố quan trọng độc tố thần kinh Có loại độc tố thần kinh kí hiệu từ A đến G, độc tố loại A, B, E, F gây bệnh người độc tố loại C, D gây bệnh động vật Bản thân vi khuẩn bào tử không gây bệnh mà bệnh độc tố sinh ra, gây liệt thần kinh Sự tăng trưởng vi khuẩn ngăn chặn acid cao, tỷ lệ đường hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp lưu trữ nhiệ độ 38 o F C botulinum chia thành nhóm khác dựa đặc điểm sinh hóa sinh lí: *Nhóm C.botulinum I bao gồm: - Chủng độc tố loại A -Những biến dạng thủy phân protein độc tố loại B F -Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF Đặc điểm chính: cong với long roi có nhung rải rác, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu ức chế hoạt động vi khuẩn nước 0,944 4,6 Các chủng thuộc nhóm I khơng gây ảnh hưởng đến thần kinh ý vấn đề bảo quản lạnh Tuy nhiên bào tử bền nhiệt dẫn đến vấn đề việc xử lý thực phẩm cần qua gia nhiệt bào tử bền vững an tồn vi khuẩn *Nhóm C.botulinum II bao gồm: - Chủng độc tố loại E -Những biến dạng không thủy phân protein phân giải đường độc tố loại B F Đặc điểm: bao gồm thẳng với long roi có lơng nhung rải rác, pH tối thiểu để ức chế hoạt động vi khuẩn nước 0,97-5 Là nguy tiềm ẩn thực phẩm đông lạnh Chúng không phân giải protein tự nhiên, sinh trưởng tạo độc tố nhiệt độ độ C tạo bào tử có mức kháng nhiệt thấp Các chủng có khả chống chịu với tác động ức chế muối tốt Khả tăng trưởng tạo độc tố giới hạn nhiệt độ thấp chủng II không cao, tiếp tục giảm có thêm yếu tố bất lợi ảnh hưởng đến tăng trưởng *Nhóm C.botulinum loại III bao gồm: -Những độc tố loại C D -Những biến dạng nói chung khơng có thủy phân protein Đặc điểm: thẳng với lơng roi có lơng nhung rải rác, sản xuất bào tử với khả chịu nhiệt trung gian Thường gây bệnh động vật chim * Nhóm V loại IV bao gồm: - Thủy phân protein chủng độc tố loại G Đặc điểm: tương tự nhóm III, vai trò chúng ngộ độc thực phẩm chưa hiểu rõ Các chủng thuộc nhóm số lồi clostridia khơng tạo độc tố gộp chung tạo nên loài Clostridium argentinens Cấu trúc: a Cấu trúc tế bào: Trên tiêu nhuộm gram, vi khuẩn bắt màu Gram dương, có hình dạng thẳng cong, kích thước chiều rộng 0,3-0,7 µm, chiều dài 3,57,0 µm Sinh bào tử, bào tử thường to chiều ngang tế bào b Cấu trúc phân tử: Bộ gen Clostridium botulinum 3.886.916 bp,trong G + khoảng 28,2 % ,ngồi có plasmid 16,334 bp Toxin tổng hợp từ chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần 150.000 dalton Ở cấu trúc phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấy, bị số enzym vi khuẩn trypsin tách thành hai chuỗi nặng (100.000 dalton) nhẹ (50.000 dalton) nối với cầu nối sunfur có gắn phân tử Zn II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTALINUM: 1/ Phương pháp truyền thống 1.1/ Thiết bị vật liệu - Tủ lạnh - Giấy thấm khô - Đèn cồn - Dụng cụ vô trùng - Cối chày vơ trùng - Pipet có nút bơng gòn vơ khuẩn - Ống nghiệm vơ trùng - Que cấy - Tủ ấm, 35± 1°C 26± 1°C - Bình vơ khuẩn bảo quản mẫu dự trữ - Giá đựng ống nghiệm - Kính hiển vi - Đĩa petri vô trùng 15100 mm - Ống ly tâm - Máy li tâm lạnh tốc độ cao - Ống tiêm vơ trùng ml với kích cỡ 25cm, 1cm, 6cm để tiêm vào chuột - Chuột (khoảng 12-20g) 1.2/ Mơi trường, dụng cụ, hóa chất - Pepton đệm bufer pepton water (BPW) - Iron suphide Agar (ISA) - Perfringns selective Agar (shahidi ferguson ferfringns, SPF) - Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin (TPGYT) - Môi trường dịch thể gan băm hay mơi trường thịt chín (hoặc nước luộc thịt) - Mơi trường thạch- lòng đỏ trứng-gan- thịt bê hay thạch- lòng đỏ trứng yếm khí - Dung dịch cồn- odine (iodine 4% cồn 70%) - Dung đệm phosphate vô trùng, pH=6,2 - Dung dịch nước muối vô trùng - Dung dịch NAOH 1N - Dung dịch HCl 1N - Dung dịch trypsin (difco, 1:250) - Thuốc nhuộm Gram, tím kết tinh hay xanh methylene 1.3/ Quy trình phân tích a Chuẩn bị mẫu trước phân tích - Mẫu giải đơng nhiệt độ khơng q 45°C phân tích sau giải đông - Cân 25g mẫu túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch đệm phosphat đồng mẫu - Pha loãng nồng độ theo dãy thập phân (10 -1, 10-2, 10-3,…) Mẫu xử lý nhiệt độ 70-80°C 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng thể vi sinh vật khác - b Tiến hành cấy - Cấy vào đĩa petri vô trùng 1ml dịch mẫu pha lỗng - Tiếp tục cho vào 20-25ml mơi trường ISA ủ ẩm 45°C vào đĩa, lắc - Đĩa cấy mẫu đem ủ 37°C 24-48h bình kị khí c Thu thập kết - Quan sát, ghi nhận khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc có tần số xuất nhiều nhất) tiến hành quan sát tế bào kính hiển vi test sinh hóa, đếm tổng số khuẩn lạc C1 Test sinh hóa Tính chất chủng: - tính chất sinh hóa: lên men loại đường sinh khí Nhóm Dạng độc tố I A,B, F Làm tan Gelatin Lên men Glucose Lên men Fructose Lên men Mannose Lên men Maltose II B,E, F + + ± ± IV G + + ± + ± + - D + + + + + III C, Lên men Succarose Lên men Trehalose Lên men Lactose Lipase Lecithinase Sinh H2S - + - - - - - - + + + + + + + + + + - hình thể: trực khuẩn đầu tròn, nhiều lơng quang thân, không sinh vỏ - Nha bào: bầu dục nằm gần đầu vi khuẩn - Ni cấy: kị khí tuyệt đối, môi trường 35-37°C, pH khoảng 6-7 - Môi trường đặc ni cấy: khuẩn lạc nhỏ, chắc, hình đậu, hình sợi - Mơi trường lỏng ni cấy: đục môi trường cặn đáy - Môi trường thạch máu ni cấy: có vòng tan máu C2 Quan sát tế bào  Lấy tế bào: - Cho giọt nước lên tâm lam kính, sau dùng que cấy lấy khuẩn lạc đĩa petri bôi lên chổ giọt nước dàn có đường kính 2cm - Cố định tế bào: hơ lam kính lửa đèn cồn (chú ý khơng để nóng q hơ mặt lam kính tránh để tế bào tiếp xúc trực tiếp lửa chết tế bào cần quan sát), để diệt bớt ức chế số tế bào  Tiến hành nhuộm: - Nhỏ dung dịch thuốc nhuộm tím Violet lên tế bào, khoảng 15s rửa nước cất (chú ý rửa nước cho trôi theo chiều đồng thời không dội trực tiếp lên chỗ tế bào) đến nước rửa khơng màu tím dừng lại - Để khơ tự nhiên hơ nhẹ lửa đèn cồn - Tiếp tục cho Liugon vào tế bào vi khuẩn, tương tự sau 15s đem rửa làm khơ (mục đích tế bào bắt màu tím bền hơn) - Sau nhỏ cồn 90° vào, dùng để tẩy màu cồn thấm vào tế bào số tế bào có màu tím số khơng có màu tím, tương tự tiến hành rửa làm khô - Cuối nhuộm đỏ Fuchin, mục đích phân biệt vi khẩn G + (có màu tím) vi khuẩn G-(có màu đỏ)  Tiến hành quan sát kính hiển vi: - Tế bào Clotridium có hình que dạng vùi trống, bắt màu tím đầu - Quan sát kĩ hình thái, xem có tế bào giai đoạn sinh sản khơng 1.4/ Sơ đồ phân tích Đồng pha loãng mẫu theo dãy thập phân (10-1,10-2,10-3, ) tiến hành xử lý mẫu 80°C Cấy 1ml mẫu vào đĩa petri, đổ 10-15ml môi trường ISA 45°C 10 lắc Ủ bình kín 37°C 24-48h Đổ lớp ISA thứ lớp thứ đông đặc Đếm tất khuẩn lạc màu đen có đường kính >0.5 mm Tính kết  Cơng thức tính: Trong đó: A: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa V: Thể cấy vào đĩa d: nồng độ pha loãng tương ứng 1.5/ Kiểm tra độc tố C.botulinum a) Thí nghiệm chuột - Chuẩn bị thức ăn cho chuột tẩm ướt dịch khuẩn - Tiến hành quan sát, chuột khơng có triệu chứng khẳng định chuột có khả kháng botulin, hay nói cách khác C.botulinum khơng gây độc hại đến sức khỏe, có triệu chứng lông xù lên, thở mạnh hồi, liệt yếu dần chết ta tiến hành kiểm tra xem chuột chết phải độc tố botulin không b) Tiến hành kiểm tra 11 - Chuẩn bị mẫu: lấy dịch ruột chuột chết để tiến hành kiểm tra - Tiến hành thực mục 1.3 * Nếu kết quan sát giống với khuẩn lạc C.botulinum khẳng định chuột chết độc tố botulin * Nếu kết khơng giống chuột chết nguyên nhân khác Khuẩn lạc C.botulinum 48 tiếng Xuất kết tủa bao quanh khuẩn lạc 2/ Phương pháp sử dụng môi trường Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypin (TPGYT) 2.1/ Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm đóng hộp ngun có đánh số thứ tự mẫu Đối với thực phẩm rắn lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm lượng dung dịch đệm phosphate nghiền chày vơ trùng Hay gắp mẫu nhỏ thực phẩm cho vào môi trường tăng sinh nhờ cặp ghép vô trùng Cấy trực tiếp thực phẩm mẫu lỏng vào môi trường nuôi cấy pipet Chuẩn bị mẫu dự trữ, sau ni cấy, chuyển phần mẫu dự trữ vào bình đựng mẫu dự trữ bình đựng mẫu vơ trùng để sử dụng test cần thiết 2.2/ Phát tế bào vi khuẩn: * Tăng sinh: - Chuẩn bị ống nghiệm vơ trùng (có nút bơng), cho vào ống ống Durham 12 - Loại bỏ oxi môi trường tăng sinh nước 1015 phút làm lạnh nhanh - Cấy vào hai ống nghiệm chứa mơi trường thịt chín 1-2 gam thực phẩm rắn hay 1-2ml thực phẩm lỏng (cho 15ml môi trường tăng sinh) Ủ 35°C - Cho vào hai ống nghiệm môi trường TPGYT thay vi khuẩn nghi ngờ chủng không phân hủy protein chứa kháng nguyên B, E hay F - Lưu ý: Phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên bề mặt môi trường Sau ngày ủ, kiểm tra canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ đục môi trường, tạo khí, hay phân hủy chất thịt Lưu ý mùi tạo thành, kiểm tra canh trường vi khuẩn kính hiển vi cách chuẩn bị quan sát vết bôi dịch vi khuẩn nhuộm Gram (hay giọt ép kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay nhuộm đơn với tím kết tinh hay xanh methylene kính hiển vi sáng) Kiểm tra hình thái vi khuẩn lưu ý tế bào điển hình C.botulinum số lượng tìm thấy, mức độ bào tử hóa vị trí bào tử tế bào Cũng thời điểm này, kiểm tra vi khuẩn khả tạo toxin, thông thường toxin tạo với nồng độ lớn sau ngày ủ, ủ thêm 10 ngày để phát bào tử tổn thương chậm phát triển thành tế bào dinh dưỡng trước hấp nước áp suất cao để loại bỏ môi trường Để phân lập giống thuần, bảo quản canh trường thời điểm tạo nhiều bào tử 4°C * Phân lập giống - Có thể phân lập nhanh vi khuẩn C.botulunum từ hệ vi sinh vật hỗn hợp môi trường tăng sinh hay mẫu thực phẩm ban đầu trình bào tử xảy tốt - Tiền xử lý mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có nút bơng chứa 1-2ml canh trường vi khuẩn thể tích tương ứng cồn tuyệt đối lọc vơ trùng, lắc ủ nhiệt phòng Để phân lập vi khuẩn, lấy 1-2ml mẫu dự trữ cho vào ống nghiệm có nút bơng, thêm thể tích tương ứng cồn tuyệt đối lọc vô trùng, lắc ủ nhiệt độ phòng Hay cách khác, đun hay 2ml mơi trường tăng sinh có chứa vi khuẩn 80°C 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Không xử nhiệt với vi khuẩn C.botulinum không phân hủy protein - Cấy mẫu xử lý: xử lý que cấy vòng cấy hay vòng cấy chứa đầy dịch mẫu xử lý theo hai cách mơi trường thạch-lòng đỏ trứng-gan thịt bê hay thạch-lòng đỏ trứng yếm khí để 13 tách khuẩn lạc phát triển riêng lẻ Nếu pha lỗng đến mức cho khuẩn phát triển dính vào sau ủ Ủ đĩa khô trước đem ủ nhằm tránh vi khuẩn dính vào sau ủ Ủ đĩa 35°C 48 điều kiện yếm khí * Chọn khuẩn lạc vi khuẩn C.botulinum điển hình - Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình vi khuẩn C.botulinum phát triển độc lập Những khuẩn lạc có đặc điểm gỗ cao hay dẹt, nhân hay xù xì Chúng thường phát triển phân bố dàn trải có mép khơng Trên bề mặt trứng chúng có bề mặt óng ánh kiểm tra ánh sáng chiếu lệch góc Những vùng óng ánh trông giống lớp ngọc trai, theo trước sau đường viền không khuẩn lạc Bên cạnh vùng ngọc trai khuẩn lạc C.botulinum loại C, D F thường bao quanh vòng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng Các loại khuẩn lạc A B thường có vùng kết tủa nhỏ - Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng để cấy khuẩn lạc C.botulinum loại E vào môi trường TPGY, khuẩn lạc sinh toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín Sau đem ủ ngày, kiểm tra tạo thành toxin - Phân lập giống thuần: cấy ria lại chủng loại toxin lên môi trường thạch lòng đỏ trứng Ủ đĩa 35°C điều kiện yếm khí, đĩa ủ 35°C điều kiện khí Nếu khuẩn lạc điển hình C.botulinum phát triển đĩa thạch yếm khí khơng phát triển đĩa hiếu khí giống Nếu khơng phân lặp C.botulinum từ khuẩn lạc chọn có nghĩa mật độ chúng hệ vi sinh vật hỗn hợp thấp Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào mơi trường tăng sinh làm tăng số lượng chúng lên đủ phép phân loại Bảo vệ giống trạng thái bào tử tủ lạnh, hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô 2.3/ Phát độc tố botulin Chuẩn bị mẫu: Lấy phần mẫu để phát tế bào vi khuẩn C.botulinum sống, phần khác để kiểm tra độc tính Bảo quản phần mẫu lại tủ lạnh Ly tâm mẫu chứa chất rắn lơ lửng điều kiện sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Chiết mẫu thực phẩm rắn với thể tích tương ứng dung dịch đệm gel-phosphate pH=6,2 Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm cối chày làm Ly tâm mẫu giã điều kiện lạnh sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính 14 * Xác định độc tính mẫu thực phẩm hay môi trường vi khuẩn - Xử lý với Trypsin: có mặt độc tố vi khuẩn khơng phân hủy protein mẫu thực phẩm cần phải kích hoạt Trypsin để xác định Vì cần xử lý phần lỏng mẫu rắn sau ly tâm hay mẫu lỏng hay dịch thịt chín chủng với Trypsin trước phát độc tính Khơng xử lý Trypsin với mơi trường TPGY mơi trường chứa sẵn Trypin xử lý tiếp với trypin làm giảm hoạt tính toxin kích hoạt mức cao nhờ trypsin có sẵn mơi trường Điều chỉnh pH mẫu lỏng 6,2 với dung dịch NaOH 1N hay HCl 1N Thêm 0,2ml dung dịch trypsin bão hòa nước vào 1,8ml phần mẫu lỏng Ủ dịch hỗn hợp 35-37°C giờ, trộn đều, để kiểm tra độc tính Để chuẩn bị cho dung dịch trypsin, cho 1g trypsin (Difco,1:250) vào ống nghiệm thêm 10ml nước cất, lắc hơ nóng nhẹ để hòa tan - Kiểm tra độc tính: Tiến hành test song song mẫu xử lý khơng xử lý với trypsin (lặp đơi) Pha lỗng phần mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn chưa xử lý đến 1:2, 1:10, 1:100, dung dịch đệm gel-phosphate Tiến hành pha loãng tương tự với mẫu loãng hay canh trường vi khuẩn xử lý với trypin Tiêm vào bụng chuột, theo cặp chuột, 0,5ml mẩu lỏng chưa pha loãng vào 0.5ml mẫu kiểm tra chưa xử lý độ pha loãng cách sử dụng ống tiêm hay 3ml với kim cỡ - Vi khuẩn với độ pha loãng cách sử dụng ống tiêm hay 3ml với kích cỡ 2,5cm, 1,6cm Lặp bước với mẫu xử lý với Trypsin (lặp đôi) Đun 1,5ml mẫu lỏng hay canh trường vi khuẩn 10 phút 15°C Làm lạnh thêm 0,5ml (chưa pha loãng) vào chuột theo cặp Chuột khơng chết, độc tố botulin có bị bất hoại nhiệt Quan sát tất chuột theo khoảng thời gian định 48 Chỉ nhận triệu chứng thời gian chuột chết Triệu chứng ngộ độc chuột bắt đầu 24 đầu tiên, long xù lên, thở mạnh hồi, thể yếu dần, cuối liệt thở yếu dần chết Nếu chuột chết mà khơng có đủ triệu chứng nói khơng thể kết luận độc tố botulin có chất lỏng tiêm vào chuột Mà chuột chết hợp chất độc có mẫu tiêm hay nhiễm trùng vết thương 15 III CLOSTRIDIUM BUTALINUM TRONG ĐỒ HỘP: C botulinum gây thể bệnh -Thứ thể nhiễm qua thức ăn (foodborne botulism) Tất loại thức ăn bị nhiễm bảo quản không kỹ nguồn lây bệnh chủ yếu qua loại đồ hộp có độ acid thấp đậu, ngô, củ cải đường Thịt hộp, cá hộp nguồn lây bệnh tiềm tàng Vi khuẩn C botulinum phát triển loại thực phẩm nói trên, sinh độc tố ăn phải loại thức ăn này, triệu chứng xuất sau 18 - 36 Cá biệt, có trường hợp bệnh xuất sớm sau ăn vài muộn hơn, sau vài ngày -Thể bệnh thứ hai C botulinum gây thể trẻ em, chủ yếu trẻ 1t tuổi tháng đầu sau đẻ Nguyên nhân chủ yếu cho trẻ ăn phải thức ăn mật ong, sữa, bột… có nhiễm C botulinum dạng nha bào Sau vào đường tiêu hóa, C botulinum phát triển sinh ngoại độc tố -C botulinum gây bệnh nhiễm qua vết thương Thể hay gặp người chích ma túy, người bị vết thương nhỏ không ý vô khuẩn đầy đủ Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương, nhân lên sinh độc tố gây hại Đồ hộp thực phẩm ưu tiên sử dụng chuyến xa, lúc bận rộn nhịp sống đại ưu điểm tiện lợi nhanh chóng Tuy nhiên, mua sử dụng không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Nha bào vi khuẩn chịu nhiệt độ 1200C phút C botulinum sống đất, bùn, bụi bẩn, ruột cá, ruột gia súc đặc biệt phát triển mạnh thức ăn ôi thiu, môi trường kín thịt hộp để lâu ngày (đã có vụ ngộ độc hàng loạt độc tố C botulinum ăn thịt hộp) Các triệu chứng dấu hiệu: Độc tố C botulinum vào thể ngăn chặn giải phóng chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine đầu mút thần kinh tiền sinap Vì vậy, xung động thần kinh bị ngưng trệ dẫn đến triệu chứng liệt vận động chủ yếu Các dấu hiệu bao gồm nói khó; khó nuốt; khơ miệng; liệt mặt; liệt dây thần kinh vận nhãn gây nhìn đơi; sụp mi; liệt hơ hấp (cơ liên sườn, hồnh, ức đòn chũm, thang) gây khó thở, chí gây ngừng thở dẫn đến tử vong Bệnh tiến triển nặng dẫn đến liệt toàn thân Thể bệnh nhiễm qua thức ăn thường có triệu chứng đau bụng, nơn mửa, tiêu chảy Táo bón xuất sau có triệu chứng liệt Ở trẻ em, táo bón thường dấu hiệu trước xuất yếu cơ, khóc yếu, thở yếu, chảy nước dãi, sụp mi, bỏ bú không bú được, suy hơ hấp liệt tồn thân Tất trường hợp nhiễm C botulinum cần theo dõi sát sở y tế để theo dõi tiến triển dấu hiệu liệt Thuốc có hiệu 16 sử dụng globulin miễn dịch botulism dùng đường tiêm tĩnh mạch (Botulism Immune Globulin Intravenous Human - BIG-IV) Kháng độc tố C botulinum chiết xuất từ ngựa thường sử dụng với liều từ 50.000 100.000 đơn vị Khi có biểu suy hơ hấp, ý dấu hiệu ho khạc, thở gắng sức hơ hấp phụ… để có định đặt ống nội khí quản cho thở máy Tiên lượng bệnh nhiễm C botulinum tùy theo mức độ liệt Nếu liệt nhiều cơ, hô hấp phải thở máy, tỷ lệ tử vong tới 60 - 70% Cơ chế hoạt động độc tố Butalinum: Độc tố C.botulinum xem có độc tính mạnh biết đến, với liều lượng gây tử vong cho người trưởng thành vào khoảng 10^(-8)g Chúng protein có khối lượng phân tử lớn (150kDa) bị bất hoạt nhiệt độ 80°C 10 phút Trong tự nhiên, độc tố C.botulinum sản xuất pha tăng trưởng log dạng phức hợp tiết môi trường xung quanh phân giải tế bào Trong phức hợp nhỏ phức hợp (phức hợp M), độc tố thần kinh kết hợp với protein khác có kích thước tương tự (chưa rõ hoạt tính sinh học) Trong đó, phức hợp lớn (như phức hợp L), hợp chất hemmaglutinin đồng thời diện Như vậy, độc tố thần kinh tổng hợp thành chuỗi tiền protein hoạt hóa cách cắt phân giải tạo thành phân tử gồm thành phần: chuỗi nhẹ (Mr 50kDa) chuỗi nặng (Mr 100kDa), nối với cầu nối disulfide Nếu sinh vật khơng có khả tự tổng hợp enzyme phân giải tiền protein hoạt hóa enzyme trypsin ruột Tuy nhiên bị phân giải mạnh độc tố bị bất hoạt Chính điều mà phức hợp tự nhiên có số chế tự vệ, liều lượng độc tố A gây tử vong tiêm thẳng vào màng bụng chuột cao gấp 104-105 lần bình thường Chuỗi nặng có tác dụng giúp độc tố bám lên tế bào thần kinh, chuỗi nhẹ giúp chúng xâm nhập vào bên tế bào Chuỗi nhẹ có chất endopeptidase nhân kẽm, hoạt hóa khử cầu nối disulfide protein Endopeptidase sau cắt rời thành phần phức hợp bám dung hợp màng cúc synapse (nơi chứa chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine) Khi protein công, nối peptide đặc hiệu thủy giải loại độc tố khác Độc tố loại B, D, F G thủy giải loại nối peptide khác protein bám màng cúc synapse (còn gọi synaptobrevin) Độc tố loại A E công vào nối khác thể synapse (SNAP-25), loại C1 cơng SNAP-25 lẫn syntaxin Người ta thấy gene mã hóa cho độc tố (ít loại C D) gắn liền với phage ơn hòa Gene tồn thể vi khuẩn prophage, kết hợp phân chia với nhiễm sắc thể vi khuẩn mà không gây ly giải tế bào Tình trạng tiềm tan diện phổ biến loài vi khuẩn tự nhiên, thường khơng gây biến đổi tính chất vi sinh vật 17 Botulism trẻ sơ sinh khác với triệu chứng thơng thường chúng bắt nguồn từ tạo khuẩn lạc C.botulinum đường ruột trẻ tiết độc tố vị trí khuẩn lạc Tiệt trùng đồ hộp: Bào tử yếm khí Clostridium botulinum mục tiêu trình chế biến nhiệt vì: - Có thể sản sinh độc tố làm chết người dù liều lượng thấp - Có khả thành lập bào tử, bền nhiệt - Clostridium botulinum tìm thấy nơi đâu, hầu hết nguyên liệu nhiễm vi sinh vật này, nên chúng quan hệ mật thiết tới lĩnh vực an tồn thực phẩm Chính lý trên, Clostridium botulinum xem nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Để tránh "bùng nổ" ngộ độc, nhà chế biến thực phẩm cần : - Giảm mật số bào tử Clostridium botulinum đến mức chấp nhận thực phẩm - Ngăn cản phát triển Clostridium botulinum (bào tử) trình sản sinh độc tố Trong thực tế khó vơ hoạt bào tử Clostridium botulinum, để tránh hư hỏng đòi hỏi phải xử lý nhiệt độ cao, nguyên nhân dẫn đến việc giảm tính chất dinh dưỡng, cảm quan thực phẩm, khơng đáp ứng đòi hỏi người tiêu dùng Chính thế, việc ngăn cản hư hỏng thực phẩm thường hạn chế phát triển nhanh bào tử Clostridium botulinum vô hoạt Việc xử lý nhiệt thành công để phá hủy bào tử Clostridium botulinum kết hợp với nhiều yếu tố (yếu tố bên bên ngoài) pH, nhiệt độ, oxy, độ hoạt động nước, phụ gia bảo quản kết hợp với nhóm vi sinh vật cạnh tranh Thơng thường bào tử Clostridium botulinum khơng hình thành phát triển thực phẩm có pH < 4,6 Vì vậy, pH : 4,6 chọn ranh giới phân chia thực phẩm acid acid - Trong thực phẩm acid (pH < 4,6) bào tử Clostridium botulinum diện, khơng có dấu hiệu liên quan đến phát triển nhanh, áp dụng xử lý nhiệt trung bình để phá hủy chúng (thanh trùng) - Trong thực phẩm acid (pH > 4,6) xử lý nhiệt mức độ tương đối sử dụng với mục đích tiêu diệt bào tử Clostridium botulinum, phải kết hợp với trình bảo quản mát Trong trường hợp này, trình tiệt trùng thường áp dụng KẾT LUẬN Qua nội dung tìm hiểu trên, thấy thực phẩm đóng vai trò quan trọng mắc xích với giới vi sinh vật Rõ ràng thực phẩm môi trường lý 18 tưởng cho chúng sinh sôi phát triển Sự có mặt vi sinh vật loại thực phẩm phần có lợi, song nhiều trường hợp chúng mối đe dọa lớn người Clostridium botulinum loài đáng sợ nhiều thập kỷ trước Việc tránh tác hại loại thực phẩm điều vô cần thiết Trong sản xuất chế tạo sản phẩm thực phẩm cần tuân thủ điều kiện vệ sinh tránh nhiễm vi sinh vật nhiều loại có hại khác Bên cạnh tác hại thấy rõ, y học ngày biết cách khống chế sử dụng độc tố botulin liều thuốc làm trẻ hóa Điển hình Botox sản phẩm Botulinum Toxin type A công ty Allergan (Mỹ) sản xuất, có tác dụng xóa nếp nhăn vùng hai chân mày, trán mắt Cần phải có hiểu biết Clostridium botulinum độc tố Botulin loài vi sinh vật để tránh tác hại đáng tiếc xảy Hi vọng tiểu luận giúp phần để đạt mong muốn nói 19 ... Do vi khuẩn có nhiều tự nhiên nên dễ nhiễm vào thực phẩm trình sản xuất, chế biến, vận chuyển bảo quản Vì vậy, để vi c sử dụng đồ hộp loại thực phẩm khác cách an tồn, nhóm tìm hiểu vi khuẩn C Botulinum. .. điều kiện yếm khí * Chọn khuẩn lạc vi khuẩn C .botulinum điển hình - Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình vi khuẩn C .botulinum phát triển độc lập Những khuẩn lạc có đặc điểm gỗ cao hay dẹt,... III CLOSTRIDIUM BUTALINUM TRONG ĐỒ HỘP: C botulinum gây thể bệnh -Thứ thể nhiễm qua thức ăn (foodborne botulism) Tất loại thức ăn bị nhiễm bảo quản không kỹ nguồn lây bệnh chủ yếu qua loại đồ hộp