Hệ thống chuyển gen bệnh xơ nang I Mở đầu Xơ nang (CF) số bệnh di truyền thường gặp người, có tỉ lệ xuất 1: 2000 trẻ sơ sinh Nam Âu Nguyên nhân gây bệnh CF đột biến lặn NST thường Tần số kiểu gen dị hợp ước tính 1/25 quần thể người Caucasia Chỉ tính riêng Mỹ có tới 30.000 người mắc bệnh Một triệu chứng dễ nhận thấy bệnh CF mồ hôi nhiều muối, triệu chứng lành tính gen đột biến Nhưng, triệu chứng khác bệnh ác tính Phổi , tụy gan bệnh nhân bị nghẹ bới lớp chất ngày đậm đặc, việc dẫn đến tượng viêm nhiễm mãn tính cuối hỏng chức quan Việc xác định gen gây bệnh CF thành công lớn ký thuật tách dòng vị trí Các phân tích sinh hóa tế bào người mắc bệnh không sai hỏng trao đổi chất hay sản phẩm đột biến gen.Đến năm 1989, Francis Collins cà Lap-Chee Tsui cộng xác định gen CF Nhờ kỹ thuật tách dòng giải mã trình tự gen CF, nhà nghiên cứu nhanh chóng xác định sản phẩm gen qua phát triển liệu pháp gen để phòng ngừa điều trị bệnh CF bệnh gây gen đơn thối hóa NST thường Trong quần thể Caucase, 20 người có người mang gen bệnh 1/2000 sơ sinh bị bệnh CF Gen tác động nằm cánh tay dài NST số có tên gen điều hòa vận chuyển màng xơ nang ( cystic fobrosis transmembrane regulator –CFTR) (Rommens cộng sự., 1989) Trình tự hệ gen vào khoảng 250 kb, chứa 27 exon mã cho mRNA khoảng 6,5 kb (Rommens cộng sự., 1989; Zielenski cộng sự., 1991) Đột biến phổ biến với CF loại bỏ cặp base exon 10 (ΔF508) chiếm khoảng 70% số NST CF (Kerem cộng sự., 1989) Có tất khoảng 400 đột biến có liên quan tới CF xác định (Tsui., 1992) II Nội dung Cơ sở lý luận Tuy CF bệnh đa gen, khía cạnh hơ hấp lại loại bệnh bị mắc nhiều số người chết bệnh nhiều nhất, đường dẫn khí đích gen trị liệu Điều đáng quan tâm việc phát triển chiến lược gen trị liệu (GTL) với CF phải thiết lập mức chuyển gen thấp mà cải thiện tiến triển bệnh CF kiểu hình bình thường người ta chứng minh cần biểu 50% mức bình thường CFTR đủ để phòng bệnh Điều thú vị in vitro in vivo chứng minh biểu gen đủ làm bình thường tiết chloride Nếu tự tải nạp 5%-20% tế bào CF hồn trả độ dẫn điện chloride (Goldman cộng sự., 1995; Johnson cộng sự., 1992; Zabner cộng sự., 1994) chuột chuyển gen CF cần biểu 5% mức bình thường Cftr thấy tiết chloride mức khác ( xấp xỉ khoảng 50% dạng hoang dã) (Dorin cộng sự., 1996) Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh chưa rõ phát có liên quan với lợi ích lâm sàng chuột chuyển gen cần biểu 5% dạng Cftr hoang dã làm giảm đáng kể bệnh đường ruột (Dorin cộng sự., 1996) Cũng cần phải lưu ý việc hiệu chỉnh cường hấp thụ natrium đòi hỏi phải có mức chuyển gen cao nhiều, có lẽ phải tới 100%(Goldman cộng sự., 1995) Ngược lại, biểu CFTR q mức vị trí khơng bình thường có cơng trình nghiên cứu đề cập tới Tuy nhiên, dẫn liệu từ nghiên cứu làm khích lệ nhà khoa học nhiều In vitro, Rosenfeld cộng chứng minh làm tăng mức protein CFTR không gây cảm ứng mức cAMP để tiết chloride vượt mức xác định (Rosenfeld cộng sự., 1994) in vivo, chuột chuyển gen biểu CFTR người chuột khơng có hiệu ứng phát triển khối lượng, hình thái học phổi phát triển chung (Whitsett cộng sự., 1992).Hầu hết hệ thống chuyển gen chuyển DNA CFTR qua trung gian thu kết đáng kể Tuy nhiên đề cập vấn đề sinh học hệ thống chuyển gen GTL bệnh CF, chi tiết khác khoa học vec tơ virus hệ thống đề cập chương trước Chuyển gen qua trung gian retrovirus Báo cáo in vitro việc hiệu chỉnh khiếm khuyết kênh chloride CF việc chuyển giao qua trung gian retrovirus cDNA CFTR tới dòng tế bào CF (Drumm cộng sự., 1990: Rich cộng sự., 1990) Khi nuôi cấy sơ cấp tế bào biểu mô tiết đáy đường dẫn khí, kể tế bào tổ tiên tải nạp vec tơ retrovirus (Halbert cộng sự., 1996) Tuy nhiên, in vivo retrovirus lại khơng thích hợp trung gian cho chuyển gen tới đường dẫn khí Sở dĩ retrovirus type C động vật có vú đòi hỏi phải có tăng sinh tế bào cho hợp provirus biểu gen biết tế bào biểu mô bề mặt đường dẫn khí lại loại tế bào biệt hóa tận phân chia xảy chậm chí khơng khả phân chia Giả thuyết có giá trị phần người ta quan sát thấy chuyển gen qua trung gian retrovirus cảm ứng qua in vivo tế bào đường dẫn khí biểu mơ bị hủy hoại - chúng kích thích tăng sinh cho phép thúc đẩy tế bào tổ tiên tăng sinh nhanh (Halbert cộng sự., 1996) Tuy nhiên, tế bào biểu mô đường dẫn tuyến niêm mạc người lại không phân chia (Leigh cộng sự., 1995) Đặc biệt nghiên cứu biểu mơ đường dẫn khí bị hủy hoại bệnh nhân CF kích thích tăng sinh, điều có nghĩa in vivo việc chuyển DNA qua trung gian retrovirus tới đường dẫn khí khả thi Cuối là, biến đổi vec tơ retrovirus sở virus gây bệnh bạch cầu chuột Moloney type C động vật có vú tiêu chuẩn (Moloney murinen leukomia virus- MoMLV) tạo lợi tế bào không phân chia Những vec tơ dựa sở HIV-1 lentivirus người (Naldini cộng sự., 1996) Goldman cộng rõ vec tơ giả HIV tải nạp in vitro tế bào biểu mô đường dẫn khí người khơng phân chia , khơng có retyrovirus MoMLV (Goldman cộng sự., 1997) Mặc dầu vậy, vec tơ HIV biểu CFTR tải nạp mơ ghép khí quản CF người chưa biệt hóa,nhưng vec tơ khơng tải nạp mơ ghép khác lồi biểu mơ biệt hóa cần phải có nghiên cứu để xác định xem liệu hệ thống vec tơ có áp dụng cho GTL bệnh CF hay không Chuyển gen qua trung gian adenovirus Adenovirus (Ad) vec tơ đặc biệt hấp dẫn vơí việc chuyển gen tới đường dẫn khí - thâm nhiễm tự nhiên biểu mơ đường hô hấp Các vec tơ adenovirus mang cDNA CFTR phát triển chủ yếu từ Ad-2 Ad-5 phân giống (subgenus) C Các nghiên cứu in vitro kiểm tra chuyển gen CFTR qua trung gain adenovirus bao hàm tải nạp dòng tế bào CF (Mitterder cộng sự., 1994), lớp đơn biểu mơ phân cực từ dòng tế bào CF (Mittereder cộng sự., 1994; Rich cộng sự., 1993; Zabner cộng sự., 1994) mẫu lấy từ phế quản mũi người, phân lập từ bệnh nhân CF (Rosenfeld cộng sự., 1994) Adenovirus xuất lần việc chuyển cDNA CFTR người tới phổi chuột in vivo vectơ Ad-5-CFTR (Rosenfeld cộng sự., 1992) mRNA CFTR phát ngày thứ chuyển gen kéo dài tuần lễ Protein CFTR người phát có tế bào biểu mơ đường dẫn khí 11-14 ngày sau cấy truyền Những kết tương tự thu nghiên cứu đơn khác chuột (Yei cộng sự., 1994) thí nghiệm lặp lại (Zabner cộng sự., 1994) Việc chuyển gen CFTR qua trung gian Ad tới khoang mũi chuột chuyển gen CF (Cftr m1UNC) đề cập Tuy nhiên, với độ chuẩn cao Ad-CFTR thấy thay đổi chút vận chuyển chloride không hiệu chỉnh khiếm khuyết natrium (Grubb cộng sự., 1994) Ngược lại, Yang cộng phát thấy protein CFTR biểu từ Ad tái tổ hợp loại bỏ E2a hệ thứ hai có mang cDNA CFTR sau chuyển tới chuột Cftr m1UNC Chuột truyền X109 pfu Ad-CFTR phát thấy CFTR 80% phế quản thời điểm 21 ngày(Yang cộng sự., 1994) Sự chuyển gen qua trung gian Ad gen CFTR tới động vậtlinh trưởng biểu qua đường dẫn khí (Brody cộng sự., 1994; Engelhard cộng sự., 1993; Zabner cộng sự., 1994) Hầu hết tế bào xác định có phổi bị thâm nhiễm kể tế bào biểu mơ bề mặt khí quản, phế quản, tiểu phế quản , tế bào đáy, tế bào biểu mô trụ, tế bào lông nhung, hạch niêm mạc túi phôi (Bouti cộng sự., 1994; Engelhard cộng sự., 1993) Người ta chứng minh in vivo, tính mẫn cảm tế bào đường dẫn khí với Ad-5 có thay đổi, tế bào hình trụ rõ ràng giảm tính mẫn cảm so với tế đáy Sự tổn thương tế bào trụ lại làm tăng tải nạp adenovirus (Grubb cộng sự., 1994) Những khác biệt hiệu ứng thâm chuyển có liên quan tới biểu khác protein kết dính chủ yếu protein hòa nhập αVB5 integrin Những protein biểu cao tế bào khơng biệt hóa biểu thấp tế bào trụ biệt hóa (Gold Wilson, 1995) Một nghiên cứu khác mở rộng tới việc kiểm tra mô bệnh nhân phát mũi khí quản khơng biểu αVB5 integrin, integrin lại có mặt tế bào biểu mơ đường dẫn khí ngoại biên (Goldman cộng sự., 1996) Trong cơng trình nghiên cứu lâm sàng chuyển gen CFTR qua trung gian Ad, Zabner cộng sử dụng vec tơ Ad-2 chuyển tới mũi bệnh nhân CF tình nguyện Niêm mạc mũi sử dụng mơ hình tốt chuyển gen tới đường dẫn khí nhạy cảm đánh giá độ an tồn tính hiệu tương đối dễ dàng Biểu mô mũi liền kề với phổi người ta biết rõ ràng đặc tính bất thường việc vận chuyển ion CF Nếu đo lượng natrium chloride vận chuyển đánh giá in vivo số đo khác biệt tiềm tang (potential difference-PD) Tất số liệu đo cho phép phân biệt cáchtin cậy bệnh nhân CF với người khơng có bệnh (Knowles cộng sự., 1995; Middleton cộng sự., 1994) Trong nghiên cứu Zabner cộng người ta quan sát thấy có viêm nhiễm cục xung quanh vị trí xử lý, có lẽ liên quan tới phương pháp chuyển gen Người ta thấy mRNA CFTR phát thấy đối tượng theo dõi biến đổi vận chuyển natrium chloride vào bệnh nhân thấy mức bình thường Những biến đổi kéo dài 10 ngày sau lần xử lý, nhiên nghiên cứu chưa thiết lập thời gian biểu (Zabner cộng sự., 1993) Những số liệu thu từ cơng trình nhỏ điều khích lệ, cần lưu ý viêm nhiễm biểu mơ làm ảnh hưởng tới vài số đo vận chuyển natrium, thí nghiệm khảo sát chuyển gen CFTR tới mũi cần phải xem xét lại phương pháp đánh giá đáp ứng với chloride Theo quy trình lâm sàng Crystal cộng sự, bệnh nhân nhận vec tơ Ad-5-CFTR biểu mơ mũi, mRNA CFTR thấy có số bệnh nhân protein thấy bệnh nhân khác (Crystal cộng sự., 1994) Các nghiên cứu điện sinh học bệnh nhân cho thấy 30% cải thiện tới mức bình thường tiết chloride tuần sau xử lý Cũng không thấy chứng hủy hoại biểu mô cảm ứng vec tơ bệnh nhân (Hay cộng sự., 1995) Thí nghiệm thứ khơng giống thí nghiệm trước, người ta bí mật đưa vào biểu mô mũi 12 bệnh nhân CF thuốc vờ (placebo) với liều lượng khác adenovirus placebo (Boucher cộng sự., 1994) mRNA CFTR từ adenovirus phát thấy số bệnh nhân nhận vec tơ liều cao Tuy nhiên, khơng thấy có biến đổi rõ ràng vận chuyển chloride natrium Ở liều thấp vec tơ không thấy có hiệu ứng gây độc liều cao (độ chuẩn 2X1010) bệnh nhân xuất viêm niêm mạc (Knowles cộngsự., 1995) Nhiều thí nghiệm khởi đầu đánh giá hiệu ứng chuyển giao Ad-CFTR tới phổi Cũng việc áp dụng adenovirus mũi, Crystal cộng sử dụng vec tơ Ad-CFTR tới đường hô hấp cách qua ống soi phế quản Một mẫu phế quản thấy dương tính với protein CFTR (Crystal cộng sự., 1994) Tuy nhiên, số bệnh nhân (những người nhận liều cao 1X10 10 pfu) tăng huyết áp, sốt có triệu chứng hơ hấp, có lẽ phản ứng viêm xảy phổi Phát chứng tỏ biến đổi liên quan tới việc tăng interleukin-6 (IL-6), có lẽ kết trực tiếp thâm nhiễm adenovirus Tất triệu chứng lâm sàng giải trọn vẹn tháng sau (McElvaney Crystal, 1995) Những kết tương tự thu thử nghiệm khác phổi Trong quy trình (Dorkin, 1998) 2X109 đơn vị thâm nhiễm (infectious units –IU) vec tơ CFTR sở Ad-2 chuyển giao ống soi phế quản ; mRNA CFTR phát thấy có liều lượng cao có thay đổi vị trí viêm nhiễm hầu hết bệnh nhân Ngược lại, khía cạnh khác nghiên cứu đề cập (Dorkin,1998) vec tơ Ad lại chuyển giao khí dung Đã phát thấy mRNA CFTR từ vec tơ khơng có độc tính kèm (David Meeker) Các số liệu từ thử nghiệm khác đánh giá việc chuyển giao khí dung vec tơ Ad-CFTR cho thấy độc tính cách rõ ràng (Bellon cộng sự., 1997) Những thí nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu lực việc lặp lại Ad-CFTR thực Nhằm mở rộng thử nghiệm GTL bệnh CF, Zabner cộng thăm dò việc sử dụng lặp lại vec tơ Ad-CFTR (Ad-2-CFTR2) biểu mô mũi (Zabner cộng sự., 1996) Sáu bệnh nhân nhận liều tăng gấp 4-5 lần (từ 2X107IU tới1X1010IU) vec tơ Ad-CFTR (Ad-2-CFTR2) 28 ngày Tuy nhiên, có lỗ mũi xử lý cho lặp lại lần thứ hai để làm đối chứng cho việc xác định hiệulực chuyển gen CFTR Mặc dầu khơng có khác biệt thống kê mũi xử lý không xử lý, bệnh nhân khơng thấy có dấu hiệu biến đổi đáp ứng kích thích tiết chloride sau xử lý Ad-2-CFTR, biến đổi đạt tối đa liều lượng 2X1010 Giảm hiệu chỉnh vận chuyển chloride song hành với chứng đáp ứng miễn dịch liều 2X109 liều cao Bản chất đáp ứng miễn dịch thay đổi, số bệnh nhân người ta thấy có tăng thời IgG huyết thanh, số khác lại biến đổi đáp ứng kháng thể protein Ad đặc hiệu có protein nhận diện epitope Một số nhà khoa học cho rằng, giảm hiệu chỉnh CFTR đáp ứng miễn dịch thể dịch adenovirus, ngăn chặn thâm nhiễm vec tơ Tuy nhiên cần phải lưu ý số liệu bước đầu từ thử nghiệm khác nhằm đánh giá việc sử dụng lặp lại vec tơ Ad-CFTR phổi lại khơng thấy chứng tăng kháng thể với vec tơ sau 2-3 lần sử dụng lặp lại adenovirus (Harvey cộng sự., 1997) Chuyển gen qua trung gian virus adeno liên hợp Virus adeno liên hợp (adeno-associated virus - AAV) virus DNA chuỗi đơn, có tiềm hợp vào hệ gen vật chủ, thường vị trí NST số 19 Các virus trợ giúp adenovirus herpes có nhiệm vụ làm tăng hiệu thâm nhiễm virus, AAV khiếm khuyết chép cách tự nhiên Khả đóng gói tối đa vec tơ AAV vào khoảng 4,5-5 kb, vừa kích cỡ cài đóng gói cDNA CFTR (Flotte cộng sự., 1992) Các vec tơ thiết kế cách loại gen rep cap Tuy nhiên, loại bỏ số protein REP tính ưu đãi việc hợp NST 19, vec tơ AAV thường tồn dạng episome (Afione cộng sự., 1996; Kearns cộng sự., 1996) Các vec tơ AAV-CFTR đượcdùng để tải nạp dòng tế bào CF (Egan cộng sự., 1992) mô sơ cấp (polyp mũi CF) in vitro (Flotte cộng sự., 1992) RNA protein CFTR ngoại sinh tồn tháng thỏ sau truyền cấu trúc AAVCFTR (Flotte cộng sự., 1993) Cũng nhóm nghiên cứu thơng báo có DNA vec tơ AAV tế bào biểu mơ đường dẫn khí khỉ rhesus macaques sau truyền vec tơ tháng(Conrad cộng sự., 1996) Không thấy hiệu ứng đối lập dùng liều 1X1011 hạt virus Các thử nghiệm lâm sàng chuyển gen AAV-CFTR tiếp tục Một công trình nghiên cứu theo dõi 30010000 đơn vị chép (replication unit-ru) AAV lỗ mũi (còn lỗ mũi nhận thuốc placebo) nghiên cứu theo dõi 3000-10000 ru đưa tới phổi ống soi phế quản (Flotte cộng sự., 1996) Những số liệu ban đầu cho thấy có chứng chuyển giao DNA Tuy nhiên, hiệu ứng đầy đủ số liệu độ an tồn phải chờ đợi Một thử nghiệm khác chuyển giao AAV-CFTR lại lấy xoang hàm mơ đích bắt đầu (Gardner,1998) Chuyển gen qua trung gian lipid cationic Bản chất việc chuyển DNA qua trung gian liposome cationic tương tác điện DNA ( thường dạng plasmid) tích điện âm với hỗn hợp lipid (thường cationic tích điện dương lipid trung tính) để tạo nên phức hợp DNA bọc lipid Bản chất tương tác chưa rõ có khác biệt loại lipidcationic Cơ chế hấp thụ vận chuyển phức hợp qua trung gian tế bào chưa rõ Khi chuyển CFTR tới tế bào HeLa COS-7 với lipidcationic DOTMA DOTAP sản sinh cAMP đặc hiệu tiết chloride dòng tế bào (Hyde cộng sự., 1993; McLachlan cộng sự., 1995) tế bào mũinhững bệnh nhân CF thâm nhiễm in vitro DC-Chol: DOPE DOTAP (McLachlan cộng sự., 1996; Srern cộng sự., 1995) In vivo việc chuyển giao DNA plasmid CFTR phức hợp với liposome đưa qua khí quản chuột thấy phiên mã mRNA CFTR đặc hiệu người có phổi tới tuần lễ (Yoshimura cộng sự., 1992) liposome cationic khác sử dụng để chuyển plasmid chứa CFTR tới chuột chuyển gen CF Hyde cộng (1993) truyền liposome cationic (DOTMA –DOPE) phức hợp với cDNA CFTR qua đường khí quản chuột chuyển gen Cftr m1Cam thấy có phục hồi cAMP kích thích tiết chloride Các phức hợp Nebulized DC-Chol: DPOE CFTR cDNA chuyển tới chuột Cftrm1HGU hiệu chỉnh khiếm khuyết chloride CF khí quản phạm vi nhỏ mũi (Alton cộng sự., 1993) nhờ việc đưa trực tiếp vào mũi truyền qua khí quản chuột chuyển gen DNA plasmid CFTR phức hợp DOTAP (McLachlan cộng sự., 1996) Trong nghiên cứu tương tự sử dụng liposome cationic DMRIE-DOPE người ta phát thấy mRNA CFTR người có chuột sau truyền ngày (Logan cộng sự., 1995) Trong hầu hết trường hợp, có chức CFTR nội sinh khồng thể phân biệt với biểu chức gen chuyển CFTR Một vài thử nghiệm lâm sàng liposome –DNA phức hợp với biểu mơ bì mũi bệnh nhân CF thực Không thấy có vấn đề tính an tồn lâm sàng phân tích bán định lượng ngẫu nhiên sinh thiết mũi Cả cDNA plasmid mRNA CFTR phát thấy sinh thiết mũi số mẫu CFTR điều trị Gill cộng có thử nghiệm ứng dụng liposome cationic DC-Chol: DPOE, công thức khác chút với cDNA CFTR hướng đoạn lặp tận RSV dài (Gill cộng sự., 1997) Trong nghiên cứu 12 đối tượng CF nhận ngẫu nhiên hai liều cDNA CFTR ( 40 400mg) placebo Không thấy có vấn đề độ an tồn cần phải cảnh báo Khi sử dụng phân tích mẫu lấy từ mũi sau ngày đưa DNA/liposome in vivo, đo PD khoảng đặn đối tượng trị liệu CFTR đối tượng chắn có thay đổi phục hồi tiết chloride Trong đa số trường hợp, mức độ hiệu đính có giới hạn định, Tuy nhiên, có bệnh nhân có đáp ứng chloride thang người không bị bệnh CF Điều thú vị biến đổi kéo dài so với số liệu báo cáo trước (chỉ kéo dài ngày) Sự khác biệt phản ánh hiệu ứng việc sử dụng promoter LTR RSV kháng lại promoter sớm SV40 dùng để biểu CFTR thí nghiệm trước.Trong quy trình khác lipid cationic sử dụng DPOTA (Boehringer,Mannheim, Mannheim, Germany) cDNA CFTR dẫn promoter CMV (Porteous cộng sự., 1997) 16 đối tượng CF nghiên cứu, người điều trị với liều 400µg người dùng thuốc placebo Cũng khơng thấy có vấn đề tính an tồn DNA vec tơ phát thấy 11/18 bệnh nhân ngày thứ thứ 7, có bệnh nhân phát thấy ngày 28 mRNA từ vec tơ phát bệnh nhân vào ngày thứ thứ 7, khơng thấy có biến đổi lớn vận chuyển chloride hiệu chỉnh, mức biến đổi trung bình 20% giới hạn bình thường Gần có liposome cationic đặc hiệu cho GTL (Lee cộng sự., 1996;Wheeler cộng , 1996) Một số liposome hệ hứa hẹn GL67 (Genzyme Corp, Framingham MA, USA) đánh giá Lipid thử nghiệm mũi DNA plasmid CFTR phức hợp với GL67 đưa vào mũi DNA plasmid CFTR đưa vào lỗ mũi Điều thú vị , có hiệu chỉnh tốt đáp ứng chloride không thấy có khác biệt rõ ràng cách điều trị, hiệu ứng tổng hiệu ứng DNA lipid (Zabner cộng sự.,1997) Một lợi GL67 tác nhân chuyển giao DNA lại làmột lipid cationic mà chuyển giao khí dung tới đương dẫn khí(Chadwick cộng sự., 1997; Eastman cộng sự., 1997; 1998) Một thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu lực khí dung chuyển giao cDNA CFTR tới phổi bệnh nhân CF hoàn tất Mặc dầu cần phải lưu ý rằng, đối tượng điều trị DNA-lipid có đáp ứng giống bị cúm nhẹ khoảng 24 (Alton cộng sự., 1998) Sự phát cho phép suy luận thiếu methyl hóa DNA từ vi khuẩn cảm ứng đáp ứng viêm Cũng chưa rõ liệu có ý nghĩa chuyển giao DNA liposome cationic dài hạn để trị liệu CF hay không chưa thấy thông báo việc cho phép sử dụng lặp lại phức hợp liposome –DNA tới chuột chuyển gen CF Trong nghiên cứu độ hiệu chỉnh tiết chloride thấy liều kép CFTR/DC-Chol:DOPE sau 10 ngày, khơng có khác biệt đáng kể với việc sử dụng liều đơn (Goddard cộng sự., 1997) Một thử nghiệm lâm sang đánh giá liều lượng thích hợp liposomeDNA cho bệnh nhân CF với thời gian 28 ngày thực Những số liệu ban đầu độ an tồn khơng có vấn đề đáng lo ngại lâm sàng không thấy trở ngại lĩnh vực miễn dịch học (Southern cộng sự., 1997) Cuối thử nghiệm khác sử dụng liposome cationic khác để chuyển cDNA CFTR tới bệnh nhân CF bắt đầu (Knowles cộng sự., 1998; Sorscher, 1998; Sorcher cộng sự., 1994) Các hệ thống chuyển gen khác Vẫn vấn đề mà cơng trình nghiên cứu cần phải tiếp tục việc kiểm tra biến đổi hệ thống chuyển gen Tuy nhiên, người ta thấy rõ việc điều trị bệnh xơ nang áp dụng liệu trình dài hạn Cách tiếp cận hứa hẹn dùng receptor đặc hiệu cho chuyển gen qua trung gian DNA gắn vào ligand thích hợp, tương tác với receptor biểu lộ bề mặt tế bào Mốt số receptor sử dụng, hầu hết nghiên cứu rõ hấp thu tế bào biểu mô đường hô hấp receptor globulin miễn dịch tổng hợp (Ferkol cộng sự., 1993) Sự thông minh chỗ thông qua bề mặt ưa kiềm tế bào biểu mô mà cộng hợp ligand-DNA phân phối tới tận tĩnh mạch Khi chuyển DNA vào phổi gan biểu tức thời kéo dài ngày (Ferkol cộng sự., 1995), xử lý lặp lại thấy biểu gen giảm đáng kể (Ferkol cộng sự., 1996) Sự giảm sút đáp ứng kháng lại thành phần kháng thể cộng hợp làm giảm tính kháng nguyên kháng thể sử dụng Có cách tiếp cận dễ chấp nhận GTL Trước hết cách kiến tạo NST nhân tạo Theo cách sử dụng trình tự hệ gen CFTR cấu trúc có chứa thành phần thiết yếu NST tâm động (centromere) phần cuối NST (telomere) Tuy lý thuyết, nghiên cứu trước người ta sử dụng NST nhân tạo nấm men có mang CFTR nên điều lại khích lệ nhà nghiên cứu (Mogayzel cộng sự., 1997) Cuối nghiên cứu nhắm vào biến đổi đặc hiệu thể đột biến ΔF508 nhờ tái tổ hợp Chiến lược biến đoạn nhỏ tương đồng thành trình tự dạng hoang dã có đột biến ΔF508 In vitro, phân tích chức phân tử cho thấy tới đích gen Tuy nhiên, tần suất tổ hợp tương đồng xác định khoảng 10-5 đến 10-6 Với tần suất vậy, điều khích lệ cho việc ứng dụng mở rộng (Kunzelmann cộng sự., 1996) III Kết luận Chúng ta rút kết luận tính thực dụng hệ thống chuyển gen việc điều trị bệnh xơ nang, đặc biệt thử nghiệm lâm sàng? Qua kết nhiều cơng trình nghiên cứu đánh giá việc chuyển gen qua trung gian Ad người ta rút số vấn đề thú vị, trước hết đáp ứng với vật chủ virus Các nghiên cứu tiền lâm sàng lâm sàng cho thấy, đưa vec tơ Ad tới đường dẫn khí bệnh nhân vùng nhiệt đới thấy viêm nhiễm phụ thuộc vào liều lượng thời điểm xử lý (Brody cộng sự., 1994; Crystal cộng sự., 1994; Engelhardt cộng sự., 1993; Knowlea cộng sự.,1995; Simon cộng sự.,1994) Theo nghiên cứu viêm nhiễm có liên quan tới tính kháng nguyên protein bọc adenovius, cảm ứng đáp ứng lympho T gây độc tế bào dẫn đến hủy hoại tế bào thâm nhiễm virus mà làm biểu gen chuyển (Yang cộng sự., 1995) Những nghiên cứu kiến tạo virus hệ thứ hai với E2a bất hoạt Những vec tơ phải biểu dài gen tái tổ hợp giảm viêm nhiễm (Engelhardt cộng sự., 1994; Yang cộng sự.,1994) Một cách khác dùng thuốc kiềm chế miễn dịch cyclosporin dexamethasone - điều hòa xuống đáp ứng miễn dịch thấy biểu gen ngoại sinh đường dẫn khí chuột kéo dài (Zsengeller cộng sự.,1995) Tuy nhiên, giới hạn việc sử dụng adenovirus sinh kháng thể trung hòa nên làm giảm khả chuyển gen virus thứ hai sử dụng (Kozarsky cộng sự., 1994; Smith cộng sự., 1993; Zabner cộng sự., 1996) Các nghiên cứu chuột chuyển gen cho thấy tế bào T góp phần quan trọng vào hình thành kháng thể trung hòa đường dẫn khí gây trở ngại cho việc chuyển gen qua trung gian adenovirus (Yang cộng sự., 1995) Vì cần phải khắc phục vấn đề tăng cường miễn dịch sử dụng lặp lại vec tơ Chẳng hạn với interleukin -12, dùng thời điểm với lần sử dụng lần đầu Ad ngăn chặn đặc hiệu sản xuất IgA làm giảm tới 20 lần độ chuẩn kháng thể trung hòa trì biểu gen sử dụng lại vec tơ (Yang cộng sự., 1995) Vấn đề có liên quan tới chuyển gen qua trung gian liposome cationic tới đường dẫn khí tính hiệu Hiên với tảng phân tử DNA vec tơ virus có hiệu liposome Cũng chưa rõ thời điểm trình vận chuyển mà lượng lớn DNA bị sau chuyển giao qua liposome Tuy nhiên, nghiên cứu trước hàng rào ngăn cản lớn lối dẫn bên tế bào màng nhân (Zabnervaf cộng sự., 1995) Nếu có tham gia tác nhân dược lý học giải vấn đề Cũng cần phải bổ sung phải có nghiên cứu cách hệ thống việc sử dụng lặp lại liposome cationic Mặc dầu vậy, người ta thấy trì biểu gen dùng lặp lại phức hợp liposome –DNA tới đường dẫn klhí (Goddard cộng sự.,., 1997; Scheule cộng sự., 1997) Cũng khơng rõ có hiệu ứng dài hạn cấu trúc phổi hay không Cuối cùng, vấn đề đặc hiệu lâm sàng CF cần phải đề cập Trong đường dẫn khí bệnh nhân CF có nhiều chất tiết thâm nhiẽm nuclease ngoại nội sinh làm biến đổi lớn hiệu ứng chuyển gen Các nghiên cứu in vitro cho thấy thực chất dịch nhầy làm ngăn cản liposome – DNA chuyển gen qua adenovirus Tuy nhiên, việc sử dụng tác nhân tiêu chất nhầy DNase lại làm giảm đáng kể hiệu ứng ức chế (Stern cộng sự., 1998) Cũng cần phải khảo sát đánh giá thêm mức độ thành công GTL bệnh xơ nang Với kỹ thuật invivo điện sinh học xác định khác biệt mũi, việc so sánh khác biệt tiềm tàng (PD) đường dẫn khí yêu cầu phải có kỹ thuật phức tạp nhiều Tuy nhiên, số liệu ban đầu chứng minh GTL khả thi bệnh xơ nang (Alton cộng sự., 1996) Mặt khác, vấn đề lâm sàng chuyên sâu cần phải đầu tư nhiều Chẳng hạn cần phải kháo sát số liệu độ kết dính vi khẩn, biến đổi lưu biến học chất nhầy (mucus rheology) MCC sàng lọc sinh học phóng xạ cần phải ápdụng quy trình sau Việc phân tích số liệu liên quan tới hậu trị liệu cần thiết tương lai GTL bệnh xơ nang nghèo nàn nguyên lý ký thuật cụ thể  ... đổi hệ thống chuyển gen Tuy nhiên, người ta thấy rõ việc điều trị bệnh xơ nang áp dụng liệu trình dài hạn Cách tiếp cận hứa hẹn dùng receptor đặc hiệu cho chuyển gen qua trung gian DNA gắn vào... kết đáng kể Tuy nhiên đề cập vấn đề sinh học hệ thống chuyển gen GTL bệnh CF, chi tiết khác khoa học vec tơ virus hệ thống đề cập chương trước Chuyển gen qua trung gian retrovirus Báo cáo in vitro... rút kết luận tính thực dụng hệ thống chuyển gen việc điều trị bệnh xơ nang, đặc biệt thử nghiệm lâm sàng? Qua kết nhiều cơng trình nghiên cứu đánh giá việc chuyển gen qua trung gian Ad người