BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban) Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS TRẦN CÔNG LUẬN Họ tên sinh viên: VÕ DUY LÊ SƠN Ngành: Cơng nghệ Hóa học Niên khóa: 2008-2012 Tháng 8/2012 ĐỊNH TÍNH – ĐỊNH LƯỢNG – CHIẾT TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỢP CHẤT ALKALOID TRONG CÂY THUỐC THƯỢNG (Phaeanthus vietnamensis Ban) Tác giả VÕ DUY LÊ SƠN Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Kỹ sư ngành Cơng nghệ Hóa học Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS TRẦN CÔNG LUẬN Tháng 8/2012 i LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn xin chân thành gửi đến ba mẹ dì Yến tạo điều kiện từ tinh thần đến vật chất, chỗ dựa thật vững để yên tâm học tập hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM tạo điều kiện cho em học tập suốt năm qua Các thầy Bộ mơn Cơng nghệ Hóa học thầy cô trực tiếp giảng dạy em suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS-TS Trần Công Luận, giám đốc Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM thầy cô trung tâm tạo điều kiện tận tình huớng dẫn em suốt thời gian thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM tận tình bảo, truyền đạt kinh nghiệm cho em Cảm ơn bạn Tôn Nữ Thanh Trà, anh Bùi Thanh Phong tất anh, chị bạn sinh viên thực đề tài Trung tâm Sâm Dược liệu Tp.HCM giúp đỡ, khuyến khích, động viên, tơi vượt qua lúc khó khăn suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Sinh viên thực VÕ DUY LÊ SƠN ii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Định tính – định lượng – chiết tách khảo sát hoạt tính kháng khuẩn hợp chất alkaloid Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban)” tiến hành trung tâm Sâm Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012 Giảng viên hướng dẫn: PGS-TS TRẦN CÔNG LUẬN Ngày nay, phủ nhận tầm quan trọng việc điều trị dược phẩm tây y bên cạnh hiệu điều trị, dược phẩm thường để lại tác dụng phụ Vì thế, xu hướng giới quay lại nghiên cứu nguồn thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật Cây Thuốc thượng phát núi Bà Nà – Đà Nẵng thường người dân dùng để trị bệnh lý nhiễm trùng chưa nghiên cứu rộng rãi Để bảo tồn phát triển dược liệu việc định danh nghiên cứu cách khoa học có hệ thống công tác cần thiết Đề tài áp dụng phương pháp hóa học, kĩ thuật sắc kí lớp mỏng, kĩ thuật chiết tách lỏng – lỏng lỏng – rắn để định tính – định lượng – chiết tách hợp chất alkaloid Thuốc thượng (Phaeanthus vietnamsis Ban) Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất alkaloid xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch Những kết đạt sau: - Định tính phản ứng hóa học sắc kí lớp mỏng cho thấy Thuốc thượng có hợp chất alkaloid - Định lượng alkaloid phương pháp cân cho thấy hàm lượng alkaloid tổng mẫu nghiên cứu 3,925% - Hoạt tính kháng khuẩn cao alkaloid tổng chủng Gram dương Gram âm mạnh cao nước cao n-butanol iii ABSTRACT Research of “Qualitative analyse – quantification analyse – extract and explore antibacterial activities compounds of alkaloid in Phaeanthus vietnamensis Ban” was conducted at HCMC Research Center of Ginseng and Medicinal Materials from 01/2012 to 8/2012 Instructor: PhD Tran Cong Luan Nowadays, we can not deny the importance of drugs therapy, besides the treatment effect, drugs are usually left side-effect Thus, current trends in the world is back to research sources of medicines derived from plants Phaeanthus vietnamensis Ban found at Mount Ba Na – Da Nang has been commonly used to treat many infectious diseases but it has not been widely researched To preserve and develop this medicinal plant, the present research is established The study applied phytochemical methods, thin layer chromatography techniques, liquid – liquid and liquid – solid extraction techniques in order to qualitative analyse – quantification analyse – extract alkaloid fractions The antibacterial activity of alkaloid fractions were determined by petridish distribution method The results revealed that: - Qualitative analyse by chemical reactions and thin layer chromatography showed that the main compound of Phaeanthus vietnamensis Ban is alkaloid - Quantification analyse by means of weight showed that the total alkaloid content in research prototype is 3.925% - The antibacterial activity of total alkaloid extract is stronger than the aqueous extract and n-butanol extract iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU .1 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Mục đích phạm vi đề tài 1.3.Ý nghĩa đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Tổng quan Thuốc thượng (Hội đồng dược điển Việt Nam, 2002) 2.2.Tổng quan alkaloid 2.2.1.Khái niệm alkaloid .3 2.2.2.Phân bố alkaloid thiên nhiên 2.2.3.Danh pháp .5 2.2.4.Tính chất chung alkaloid 2.2.4.1.Lý tính .6 2.2.4.2.Hóa tính 2.2.5.Chiết xuất, tinh chế phân lập alkaloid .9 2.2.5.1.Chiết xuất .9 v 2.2.5.2.Tinh chế phân lập (Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM) 11 2.2.6.Định tính định lượng alkaloid (Trần Hùng 2006 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM.) 14 2.2.6.1.Định tính alkaloid 14 2.2.6.2.Định lượng alkaloid .14 2.2.7.Cấu tạo hóa học phân loại alkaloid 17 2.3.Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc hợp chất hữu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2005) 19 2.4.Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn (Bộ mơn vi sinh Giáo trình thực tập vi sinh học Khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM, 2002) 19 2.4.1.Phương pháp khếch tán đĩa thạch 19 2.4.2.Phương pháp pha loãng 20 2.5.Vi khuẩn thử nghiệm 20 2.5.1.Escherichia coli (E coli) 20 2.5.2.Staphylococcus aureus (MSSA) 21 2.5.3.Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa) 22 Chương 23 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1.Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 23 3.2.Nội dung nghiên cứu 24 3.3.Vật liệu thí nghệm .24 3.3.1.Đối tượng nghiên cứu 24 3.3.2.Trang thiết bị thí nghiệm 24 3.3.3.Hóa chất, dung mơi .24 3.4.Phương pháp nghiên cứu .25 vi 3.4.1.Định tính alkaloid (Trần Hùng, Giáo trình thực tập dược liệu Bộ mơn dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược, Tp.HCM, 2007) .25 3.4.1.1.Định tính alkaloid phản ứng hóa học 25 3.4.1.2 Định tính sắc kí lớp mỏng 26 3.4.2.Định lượng alkaloid phương pháp cân (Phương pháp nghiên cứu dược liệu Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Tp.HCM, 2007) 26 3.4.2.1.Xác định độ khối lượng làm khô .26 3.4.2.2.Định lượng alkaloid phương pháp cân 27 3.4.3.Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc alkaloid (Nguyễn Kim Phi Phụng Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2007) 28 3.4.3.1.Chiết xuất alkaloid (theo giảng dược liệu, Bộ môn Dược Liệu, trường đại học dược Hà Nội, 2002; Trần Hùng, 2006) .28 3.5 Xác định hoạt tính kháng khuẩn Thuốc thượng hợp chất alkaloid số chủng vi sinh vật phương pháp khuếch tán đĩa thạch 28 Chương 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 4.1.Kết .30 4.1.1.Định tính alkaloid phản ứng hóa học 30 4.1.2.Định tính alkaloid SKLM 30 4.1.3.Định lượng alkaloid phương pháp cân 31 4.1.3.1 Độ ẩm nguyên liệu 31 4.1.3.2 Hàm lượng alkaloid tồn phần có dược liệu .31 4.1.4.Chiết xuất, phân lập alkaloid 31 4.1.4.1.Phân lập alkaloid SKC pha thuận 32 4.1.5 Kết xác định khả tạo thành vòng kháng khuẩn số cao chiết phương pháp đục lỗ 35 4.2.Thảo luận .38 vii 4.2.1.Định tính alkaloid 38 4.2.2.Định lượng alkaloid phương pháp cân 38 4.2.2.1.Độ ẩm nguyên liệu .38 4.2.2.2.Hàm lượng alkaloid tồn phần có dược liệu 38 4.2.3.Chiết xuất, phân lập alkaloid 38 4.2.4 Xác định khả tạo thành vòng kháng khuẩn số cao chiết phương pháp khuếch tán thạch .39 Chương 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1.Kết luận 39 5.2.Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC .42 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BuOH Butanol CHCl3 Chroloform COSY Correlation Spectroscopy HCl Acid Clohydric HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation H2SO4 Acid Sulfuric Me Methyl (-CH3) MeOH Methanol Na2SO4 Natri Sulfate NH4OH Amoniac NMR Nuclear Magnetic Resonance OMe Methoxy (-OMe) SKC Sắc kí cột SKDC Reparative thin layer chromatography (Sắc kí điều chế) SKLM Thin layer chromatography (Sắc kí lớp mỏng) Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh TP Tồn phần TT Thuốc thử UV Ultra Violet ix UV 254 nm UV 365 nm Dragendorff Hình 4.5: Sắc kí lớp mỏng phân đoạn cột II (I4 – I4-1 – I4-2 – I4-3 – I4-4 – I4-5) Từ sắc kí phân đoạn lắc, ta thấy mẫu nguyên liệu có alkaloid phân cực không phân cực Ta tiến hành sử dụng cao alkaloid tổng (hay gọi alkaloid tồn phần) để chạy cột sắc kí I Ở cột I, phân đoạn tách theo vệt từ phân cực đến phân cực mạnh (các tạp phân cực phân cực mạnh, tạp màu loại bớt) Dựa kết SKLM, phân đoạn I4 có vết alkaloid nằm riêng biệt có khối lượng tương đối nhiều so với phân đoạn khác nên tiến hành chọn phân đoạn I4 để chạy cột sắc kí II Ở cột II, phân đoạn I4-5 có vết alkaloid 4.1.5 Kết xác định khả tạo thành vòng kháng khuẩn số cao chiết phương pháp đục lỗ Do không đủ thời gian để tiến hành tiếp, ta lấy phân đoạn thu thử hoạt tính kháng khuẩn E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) Cao tổng (1:4) Lần Lần Lần 17 16 17 16 17 17 Lần 18 16 Lần 17 16 Lần 16 17 Trung Bình 16,83 16,5 15 16 15 14 15 16 15,17 16 17 17 17 17 17 16,83 Bảng 4.5: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn cao tổng 35 E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) Cao alkaloid (1:4) Lần Lần Lần 26 26 26 24 25 24 Lần 27 24 Lần 26 24 Lần 27 25 Trung Bình 26,33 24,33 28 28 26 28 27 28 27,5 28 28 26 28 28 28 27,67 Bảng 4.6: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn cao alkaloid E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) Cao chloroform (1:4) Lần Lần Lần 18 17 17 15 15 14 Lần 17 16 Lần 18 16 Lần 18 15 Trung Bình 17,5 15,17 20 18 18 18 18 19 18,5 14 15 16 16 14 15 15 Bảng 4.7: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn cao chloroform E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) Cao n-butanol (1:4) Lần Lần Lần Lần 16 16 14 15 13 13 13 13 Lần 16 13 Lần 14 13 Trung Bình 15,17 13 13 14 13 13 13 13 13,17 10 10 10 10 10 10 10 Bảng 4.8: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn cao n-butanol E.coli ATCC 25922 P.aeruginosa ATCC 27853 Sta.aureus ATCC 25953 Cao nước (1:1) Lần Lần Lần 14 12 13 13 14 13 15 15 15 36 Lần 14 14 16 Lần 14 13 15 Lần 13 13 15 Trung Bình 13,33 13,33 15,17 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) 13 13 14 12 12 13 12,83 Bảng 4.9: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn cao nước Cao tổng (1:4) Cao alkaloid (1:4) Cao CHCl3 (1:4) Cao nbutanol (1:4) Cao nước (1:1) Chứng âm Chứng dương E.coli ATCC 25922 17 26 18 15 13 28 P.aeruginosa ATCC 27853 17 24 15 13 13 22 Sta.aureus ATCC 25953 15 28 19 13 15 36 Sta.aureus ATCC 43300 17 28 15 10 13 34 Bảng 4.10: Bảng đường kính vòng kháng khuẩn trung bình cao kháng khuẩn Ghi chú: - E.coli ATCC 25922, Sta.aureus ATCC 25953 (MSSA) Sta.aureus ATCC 43300 (MRSA) sử dụng kháng sinh Cephaclor nồng độ 30 µg/đĩa - P.aeruginosa ATCC 27853 sử dụng kháng sinh Gentamicin nồng độ 10 µg/đĩa Nhận xét: Kết cho thấy cao alkaloid tổng kháng khuẩn mạnh mẫu vi khuẩn, điều cho thấy khả kháng khuẩn chủ yếu tập trung vào alkaloid tổng Cao chloroform cao tổng kháng khuẩn mạnh để minh chứng cho khả Thuốc thượng việc ức chế vi khuẩn gây hại 37 4.2.Thảo luận 4.2.1.Định tính alkaloid Định tính alkaloid phản ứng hóa học, dung dịch có chứa alkaloid có biến đổi màu sắc làm dung dịch có màu đậm lên hay đổi màu Và đối chiếu với màu sắc ống đối chứng với ống thêm thuốc thử, ta thấy có đổi màu từ khơng màu sang màu cam, chứng tỏ có alkaloid Định tính sắc kí lớp mỏng, mẫu đem chấm sắc kí dùng thuốc thử Dragendorff cho vệt màu cam, chứng tỏ có alkaloid 4.2.2.Định lượng alkaloid phương pháp cân 4.2.2.1.Độ ẩm nguyên liệu Theo bảng kết độ ẩm, mẫu dược liệu có độ ẩm 13%, phù hợp với độ ẩm đa số dược liệu Muốn bảo quản dược liệu tránh meo mốc, tránh biến đổi hoạt chất dược liệu độ ẩm dược liệu phải khơng q độ ẩm an tồn khoảng 13% Như mẫu dược liệu phơi, sấy khô tránh meo mốc Điều giúp bảo quản mẫu cho trình nghiên cứu tốt 4.2.2.2.Hàm lượng alkaloid tồn phần có dược liệu Kết hàm lượng alkaloid tồn phần có dược liệu 3,9246 g tương đối nhiều Và sở cho bước thí nghiệm chiết tách sau 4.2.3.Chiết xuất, phân lập alkaloid Quá trình lắc phân đoạn nhiều nguyên nhân học tác động bên nên quan sát mắt thường khơng xác độ dịch lắc phân đoạn, từ dẫn đến việc lắc phân đoạn chưa triệt để Từ sắc kí phân đoạn lắc, ta thấy mẫu nguyên liệu có alkaloid phân cực khơng phân cực Sau đó, tiến hành sử dung cao alkaloid tổng để chạy cột sắc kí Song song đó, ta mang cao thu sau lắc phân đoạn thử hoạt tính kháng khuẩn Cột chạy qua hệ dung môi khai triển ether dầu hỏa (60:90): aceton, aceton , aceton: methanol 38 Từ phân đoạn cột I, qua kết sắc kí ta tìm phân đoạn thích hợp để nạp vào cột II Do hiệu tách cột I chưa tốt nên sau khai triển thử nghiệm số hệ dung môi, lần ta thay đổi hệ dung môi sang chloroform: methanol để đạt hiệu tách tốt Sau qua cột II không đủ thời gian nên ta dừng lại giai đoạn thu số phân đoạn 4.2.4 Xác định khả tạo thành vòng kháng khuẩn số cao chiết phương pháp khuếch tán thạch Nhìn chung lồi cao alkaloid tổng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh Cao cho kết kháng khuẩn thấp cao nước cao n-butanol Sở dĩ cao nước cao n-butanol có hoạt tính kháng khuẩn hầu hết hợp chất kháng khuẩn (chủ yếu nhóm alkaloid) thu nhận phân đoạn cao trước Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Sau thực hiện, đề tài có kết luận sau: - Định tính alkaloid phản ứng hóa học sắc kí lớp mỏng cho thấy Thuốc thượng có hợp chất alkaloid - Định lượng alkaloid phương pháp cân cho thấy hàm lượng alkaloid tổng mẫu nghiên cứu 3,925% 39 - Chiết ngấm kiệt kg nguyên liệu với cồn 96%, lắc phân đoạn với diethyl ete, CHCl3, n-BuOH bão hòa nước thu 1,5535 g alkaloid tổng để nạp cột - Phân lập alkaloid 1,5535 g cao alkaloid tổng SKC thu phân đoạn, thời gian không đủ để làm tiếp nên đề tài xác định phân đoạn phân lập có chứa alkaloid có hoạt tính kháng khuẩn thơng qua việc xác định hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán thạch - Cao alkaloid tổng có hoạt tính kháng khuẩn hai chủng Gram dương Gram âm mạnh cao nước cao n-butanol 5.2.Đề nghị Do thời gian thực đề tài có hạn, số nội dung nghiên cứu chưa hoàn thiện Đề tài xin đề nghị nghiên cứu tiếp tục sau: - Phân lập xác định cấu trúc alkaloid từ phân đoạn - Định lượng alkaloid phân lập có mẫu kĩ thuật HPLC - Thử hoạt tính kháng khuẩn số cao phân đoạn hợp chất tinh khiết TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ môn dược liệu, trường đại học Dược Hà Nội 2002 Bài giảng dược liệu Hà Nội Bộ môn sinh hóa, trường đại học KHTN 2005 Thực tập hợp chất tự nhiên Tp HCM Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 2001 Bài giảng chiết xuất dược liệu Đại học Y Dược Tp HCM Hội đồng dược điển, 2002 Dược điển Việt Nam Bộ Y tế Phạm Thị Như Hồng 2006 Khảo sát thành phần hoá học Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất, Luận văn cao học, đại học KHTN Trần Hùng 2006 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Bộ môn dược liệu, khoa dược, đại học Y Dược, Tp HCM 40 Trần Hùng 2007 Giáo trình thực tập dược liệu Bộ môn dược liệu, khoa dược, đại học Y Dược, Tp HCM Nguyễn Kim Phi Phụng 2005 Phổ NMR sử dụng phân tích hữu NXB đại học Quốc gia Tp HCM Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB đại học Quốc gia Tp HCM 10 Bộ môn vi sinh Giáo trình thực tập vi sinh học Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM, 2002 11 Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đơng Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn Bộ môn vi sinh Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM Kỷ yếu cơng trình khoa học công nghệ dược, 433-438, 2001 12 Trần Anh Tuấn, Trần Thu Hương, Trần Hồng Quang, Nguyễn Tiến Hùng, Phan Văn Kiệm, Châu Văn Minh 2007 Nghiên cứu thành phần hoá học Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack) Trong: Tạp chí dược học, trang 12-15 13 Viện dược liệu 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập II NXB Khoa học kĩ thuật, Tp.HCM 14 Viện dược liệu 2005 Nghiên cứu thuốc từ thảo dược NXB Khoa học kĩ thuật, Tp HCM Tài liệu tiếng Anh Choo C Y., Chan K L 2001 HPLC analysis of Canthinone alkaloids from Eurycoma longifolia Planta Medica 68: 382 - 384 Mitsunaga K., Koike K., Tanaka T., Ohkawa Y., Kobayashi Y., Sawaguchi T and Ohmoto T 1994 Canthin-6-one alkaloids from Eurycoma longifolia Phytochemistry vol 35: 799 - 802 Kuo P C., Damu A G., Lee K H and Wu T S 2004 Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia Bioorganic & Medicinal Chemistry 12: 537 - 544 Kuo P C., Shi L S., Damu A G., Su C R., Huang C H., Ke C H., Wu J B., Lin A J., Bastow K F., Lee K H., Wu T S 2003 Cytotoxic and antimalarial β-carboline alkaloids from the roots of Eurycoma longifolia Journal of Natural Products 66: 1324 - 1327 41 Kardono B S., Angerhofer C K., Tsauri S., Padmawinata K., Pezzuto J M and Kinghorn D 1991 Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia Journal of Natural Products 54: 1360 - 1367 Nurhanan M Y., Azimahtol H L P., Mohd I A., Mohd S M A 2005 Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma longifolia Jack Phytothepary Research 19: 994 - 996 Tan S., Yuen K H., Chan K L 2002 HPLC analysis of plasma 9-methoxycanthin6-one from Eurycoma longifolia and its appliacation in a Bioavailability/ Pharmacokinetic studies Planta Medica, 68: 355 - 358 Thoi L V and Sương N N 1968 Constituents of Eurycoma longifolia Jack The Journal of Organic Chemistry 35: 1104 - 1109 PHỤ LỤC Acid hydrocloric (acid hydrocloric đậm đặc) HCl = 36,46 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng khơng màu, bốc khói Tỷ trọng 20°C: khoảng 1,18 Hàm lượng HCl: 35 – 38% (khối lượng/khối lượng), khoảng 11,5 M Bảo quản nhiệt độ không 30°C, bao bì polyethylene hay vật liệu khơng phản ứng với acid hydrocloric Dung dịch acid hydrocloric 10% 42 Pha lỗng 24 ml acid hydrocloric (thể tích) với nước vừa đủ 100 ml Acid sulfuric (acid sulfuric đậm đặc) H2SO4 = 98,08 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng sáng, ăn mòn mạnh Khối lượng riêng: khoảng 1,84 g/ml Hàm lượng: khoảng 96% (khối lượng/khối lượng) Dung dịch acid sulfuric 10% (acid sulfuric loãng) Cho từ từ ml acid sulfuric (thể tích) vào 50 ml nước, lắc liên tục Làm nguội, thêm nước vừa đủ 100 ml Dung dịch acid sulfuric 2% Pha loãng gấp lần dung dịch acid sulfuric 10% (thể tích) với nước Dung dịch acid sulfuric ethanol Pha dung dịch acid sulfuric khác, thay nước ethanol 96% (thể tích) Nếu khơng ghi rõ nồng độ, dùng dung dịch sau: cẩn thận làm lạnh liên tục, khuấy 20 ml acid sulfuric (thể tích) với 60 ml ethanol 96% (thể tích), để lạnh pha lỗng thành 100 ml với ethanol 96% (thể tích) Dung dịch pha dùng Amoniac (amoniac đậm đặc) NH3 = 17,03 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, khơng màu, mùi mạnh đặc biệt Tỷ trọng 20°C: khoảng 0,91 Hàm lượng: khoảng 25% (13,5 M) Dung dịch amoniac loãng (dung dịch amoniac 10%) Lấy 440 ml amoniac (thể tích) hòa vào nước thêm nước vừa đủ 1000 ml Anhydrid acetic (CH3CO)2O = 102,09 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, khơng màu, mùi hắc Dung dịch nước bị thủy phân nhanh tỏa 43 mùi acid acetic Điểm sôi: 136 – 142 °C Hàm lượng: khơng 97,0% Butanol n-Butanol, Butan-1-ol CH3(CH2)2CH2OH = 74,12 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu Tỷ trọng 20°C: khoảng 0,81 Điểm sôi: 116 – 119 °C Chloroform Trichloromethan CHCl3 = 119,38 Dùng loại tinh khiết phân tích chứa 0,4 đến 1% (khối lượng/khối lượng) ethanol Chất lỏng trong, không màu, mùi đặc biệt Điểm sôi: khoảng 60°C Tỷ trọng 20°C: 1,475 – 1,481 Ether Ether ethylic; Diethylether C4H10O = 74,12 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng khơng màu, suốt, dễ bắt lửa, dễ bay hơi, mùi đặc biệt Tỷ trọng 20°C: 0,713 - 0,715 Điểm sôi: 34 – 35 °C Chú ý: cất ether đạt phép thử sau: Peroxyd: cho ml dung dịch hồ tinh bột có kali iodid (thể tích) vào ống nghiệm nút mài dung tích 12 ml, đường kính khoảng 1,5cm, đổ đầy ống nghiệm với ether cần thử Đậy nút, lắc mạnh để yên tránh ánh sáng 30’ Khơng có màu tạo thành 44 Bào quản tránh ánh sáng, nhiệt độ không 15°C Trên nhãn phải ghi tên nồng độ chất bảo quản đưa vào Ether dầu hỏa Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, không màu, dễ bay hơi, dễ bắt lửa, chứa hỗn hợp dãy hydrocarbon parafin bậc thấp, chia thành phân đoạn sau: Khoảng sôi 30 – 40 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,63 g/ml Khoảng sôi 40 – 60 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,64 g/ml Khoảng sôi 50 – 70 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,66 g/ml Khoảng sôi 60 – 80 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,67 g/ml Khoảng sôi 80 – 100 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,70 g/ml Khoảng sôi 100 – 120 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,72 g/ml Khoảng sôi 120 – 160 oC; khối lượng riêng: khoảng 0,75 g/ml Ethyl acetat CH3COOC2H5 = 88,11 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng khơng màu, mùi thơm hoa Tan nước, hòa lẫn với ethanol Tỷ trọng 20°C: 0,901 – 0,904 Điểm sôi: 76 – 78 °C Kali hydroxyd KOH = 56,11 Dùng loại tinh khiết phân tích, chứa khơng 85% lượng kiềm tính theo KOH không 2% K2CO3 Hạt, que hay phiến màu trắng, dễ chảy nước Dung dịch kali hydroxyd 5% Hòa tan 50 g kali hydroxyd (thể tích) nước vừa đủ 1000 ml Magnesi Mg = 24,31 45 Dùng loại tinh khiết hóa học Bột màu xám hay vỏ bào màu trắng bạc Methanol Alcol methylic CH3OH = 32,04 Dùng loại tinh khiết phân tích Chất lỏng trong, khơng màu, dễ bắt lửa Trộn lẫn với nước ethanol Tỷ trọng 20°C: 0,791 – 0,793 Điểm sôi: 64 – 65 °C Natri hydroxyd NaOH = 40,00 Dùng loại tinh khiết phân tích, chứa khơng 97% lượng kiềm tồn phần tính theo NaOH khơng q 2% Na2CO3 Phiến hay hạt màu trắng, dễ hút ẩm Dễ tan nước ethanol Dung dịch natri hydroxyd 10% Hòa tan 100 g natri hydroxyd (thể tích) nước, để nguội, pha loãng thành 1000 ml với nước Để lắng gạn lấy phần Natri sulfat khan NaSO4 = 142,0 Dùng loại tinh khiết phân tích Bột kết tinh màu trắng, dễ hút ẩm Tan nước, không tan ethanol Mất khối lượng sấy khô 130°C không 0,5% Dung dịch sắt (III) clorid 5% Hòa tan g sắt (III) clorid (thể tích) nước vừa đủ 100 ml Thuốc thử Dragendorff Dung dịch kali iodobismuthat Dung dịch 1: hòa tan 0,85 g bismuth nitrat base (thể tích) 40 ml nước 10 ml acid acetic (thể tích) Dung dịch 2: hòa tan g kali iodid (thể tích) 20 ml nước 46 Trộn đồng thể tích dung dịch dung dịch Thêm 100 ml nước 20 ml acid acetic (thể tích) vào 10 ml hỗn hợp thu Thuốc thử Fehling Dung dịch A: hòa tan 34,66 g đồng sulfat (thể tích) nước acid hóa – giọt acid sulfuric lỗng (thể tích) vừa đủ 500 ml Dung dịch B: hòa tan 173 g natri kali tartrat (thể tích) 50 g natri hydroxyd (thể tích) 400 ml nước, làm nguội, thêm nước vừa đủ 500 ml Khi dùng, trộn đồng thể tích dung dịch A dung dịch B Pha loãng ml thuốc thử Fehling với ml nước đun sôi, dung dịch phải trong, không xuất vết tủa Thuốc thử Mayer Dung dịch kali iodomercurat Hòa tan 1,358 g thủy ngân diclorid (thể tích) 60 ml nước, thêm 10 ml dung dịch kali iodid 50% thêm nước vừa đủ 100 ml Vanillin 4-Hydroxy-3-methoxy benzaldehyd C8H8O3 =152,2 Dùng loại tinh khiết phân tích Bột kết tinh hay tinh thể hình kim trắng màu kem, có mùi thơm vani Dễ tan ethanol, chloroform ether, tan dầu dung dịch natri hydroxyd Điểm chảy: khoảng 81°C, xác định cách không sấy trước Dung dịch vanilin 1% acid sulfuric đậm đặc Hòa tan g vanilin (thể tích) acid sulfuric đậm đặc (thể tích) vừa đủ 100 ml Dung dịch pha dùng Dung dịch vanilin 2% acid sulfuric Hòa tan 0,1 g vanilin (thể tích) ml acid sulfuric (thể tích), pha dùng Xanthydrol 9-Hydroxyxanthen; Xanthen-9-ol C13H10O2= 198,2 47 Dùng loại tinh khiết hóa học chứa khơng 90,0% C13H10O2 Bột màu trắng hay vàng nhạt Điểm chảy: Khoảng 123°C Xanthydrol dung dịch methanol chứa 9,0 - 11.0% C13H10O2 Định lượng: Cân 0,3 g chế phẩm vào bình nón 250 ml, hay lấy ml dung dịch Thêm 50 ml acid acetic băng (thể tích) giọt 25 ml dung dịchure 2%, lắc liên tục Để yên 12 giờ, lọc lấy tủa qua phễu xốp thủy tinh (16 mm) Rửa tủa với 20 ml ethanol 96% (thể tích), sấy 100 – 105 °C cân Mỗi g tủa tương ứng với 0,9429 g xanthydrol Bảo quản tránh ánh sáng Nếu sử dụng dung dịch methanol, bảo quản ống nhỏ, hàn kín lọc cần trước sử dụng Môi trường nuôi cấy thử nghiệm môi trường NA Pepton: g/l Casein: g/l Yeast extract: g/l Glucose: g/l Agar: 15 g/l Nước cất vừa đủ 1000 ml Mơi trường hoạt hóa vi khuẩn: Casein: 10 g/l Nước cất vừa đủ 1000 ml Bảng phụ lục thuốc thử dùng sắc kí Hợp chất Alkaloid Anthraquinon Thuốc thử màu Dragendorff KOH/MeOH Hợp chất Iridoid Khơng no Coumarin Steroid Hữu nói chung Diazo-hố Liebermann-Burchard H2SO4 20% (khơng đặc hiệu) 48 Thuốc thử màu Trim-Hill Hơi Iod (không đặc hiệu) Polyphenol NaOH/MeOH, FeCl3 Saponin VS, AS, hỗn dịch máu Terpenoid VS, AS (không đặc hiệu) 49 ... Chromatography HSQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation H2SO4 Acid Sulfuric Me Methyl (-CH3) MeOH Methanol Na2SO4 Natri Sulfate NH4OH Amoniac NMR Nuclear Magnetic Resonance OMe Methoxy (-OMe)... kết tinh từ vỏ Canhkina đặt tên “Cinchonino” Sau Pelletier P J Caventon J B xác định cinchonino hỗn hợp chất quinin cinchonin Năm 1818, Pelletier Caventon lại phân lập chất có tính kiềm từ loài... alkaloid thường có cơng thức cấu tạo tương tự nhau, nghĩa chúng có nhân chung Ví dụ: Isopelletierin methylisopelletierin từ vỏ rễ lựu có nhân piperidin; chất tropin, hyoscyamin, atropine Benladon có