SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HCM TRUNG TÂM THÔNG TIN VÀ THỐNG KÊ KH&CN  BÁO CÁO PHÂN TÍCH XU HƯỚNG CÔNG NGHỆ Chuyên đề: XU HƯỚNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP – SAPONIN TỪ NHÂN SÂM Biên soạn: Trung tâm Thông tin Thống kê Khoa học Công nghệ Với cộng tác của:  TS Hà Thị Loan Phó Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh  Ths Vũ Huỳnh Kim Long Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh TP.Hồ Chí Minh, 05/2017 MỤC LỤC I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.1.Tình hình sử dụng hợp chất thứ cấp 1.2.Phương pháp sán xuất hợp chất thứ cấp 1.3.Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất hợp chất thứ cấp- hoạt chất Saponin từ nhân sâm II PHÂN TÍCH XU HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NHÂN SÂM TRÊN CƠ SỞ SỐ LIỆU SÁNG CHẾ QUỐC TẾ 2.1.Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo thời gian 2.2.Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia 2.3.Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo hướng nghiên cứu 12 III NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH VÀ NHÂN SÂM SINH KHỐI THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP SAPONIN 14 3.1.Nghiên cứu tạo dòng rễ tóc sâm Ngọc Linh 14 3.2.Thành phần hoạt chất saponin rễ tóc sâm Ngọc Linh 16 3.3.Ảnh hưởng yếu tố lên nhân nhanh sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh 17 3.4.Các phương pháp chiết xuất, phân tích đánh giá chất lượng sâm Ngọc Linh 19 XU HƯỚNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP-SAPONIN TỪ NHÂN SÂM ************************** I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH ỨNG DỤNG CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.1 Tình hình sử dụng hợp chất thứ cấp Cây trồng nguồn quan trọng để sản xuất thuốc hàng ngàn năm qua Theo thống kê tổ chức y tế giới 80% dân số giới dựa vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khỏe chủ yếu thuốc từ cỏ Ngồi ra, trồng nguồn nguyên liệu để sản xuất nhiều loại thuốc đại sản xuất analgesic, aspirin, có nguồn gốc từ loài Salix Spiraea; thuốc chống ung thư paclitaxel vinblastine Trong 30 năm qua có 25% loại thuốc đăng ký dựa phân tử có nguồn gốc thực vật (hợp chất thứ cấp) khoảng 50% thuốc bán chạy hàng đầu có nguồn gốc từ hợp chất thứ cấp biết trước (Gómez-Galera cộng sự, 2007) Cây trồng tiếp tục cung cấp sản phẩm hợp chất để sản xuất loại thuốc kỷ tiếp theo, hợp chất hóa học đa số lồi thực vật chưa xác định Cơng nghệ hóa học tổng hợp ngày phát triển phụ thuộc vào nguồn sinh học số chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm dược phẩm đặc tính cấu trúc phức tạp chúng khó tổng hợp (Rao and Ravishankar, 2002) Ở nước ta, người dân có truyền thống sử dụng dược liệu, có y học dân tộc, dân gian phong phú, đồng thời chịu ảnh hưởng y học cổ truyền Trung Quốc nên sử dụng dược liệu thiên nhiên lớn Hằng năm cần khoảng 60.000 dược liệu cho ngành dược, nước có khả đáp ứng 20-25%.Trong năm qua thị trường thảo dược tăng mạnh Nạn khai thác mức làm nguồn dược liệu tự nhiên ngày cạn kiệt Thủ tướng phủ ký định 1976, quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến 2030, Việt nam có vùng trồng nguyên liệu nước Dự kiến đến năm 2020 khả đáp ứng nhu cầu dược liệu nước 60% năm 2030 đáp ứng 80% 1.2 Phương pháp sán xuất hợp chất thứ cấp a Chiết xuất từ trồng Các hợp chất thứ cấp quan trọng ngành dược thu cách chiết xuất từ tự nhiên Tuy nhiên, phương pháp dẫn đến tuyệt chủng số loài thực vật nguy cấp Taxus brevifolia Podophyllum hexandrum, gây ảnh hưởng sinh thái nghiêm trọng Trồng cánh đồng mẫu lớn để cung cấp nguồn vật liệu có giá trị gặp nhiều khó khăn lợi nhuận thấp tăng trưởng chậm, yếu tố khí hậu khơng thích hợp canh tác nhiều nơi khác nhau, sâu hại, dịch bệnh trồng, tình trạng thiếu lao động canh tác thu hái Trong năm gần xu hướng nhân sinh khối phòng thí nghiệm với quy mô lớn giải pháp thay dần phương pháp truyền thống Bảng 1: Các hợp chất quan trọng ngành dược có nguồn gốc từ trồng Sản phẩm Công dụng Loại trồng Ajmalicine Antihypertensive Catharentus roseus Artemisinin Antimalarial Artemisia annua Berberine Intestinal Coptis japonica Camptothecin aliment Antitumour Camptotheca Capsaicin Counterirritant acuminata Capsicum frutescens Castanospermine Glycoside Catanospermum Codeine inhibitor Sedative australe Papaver Colchicine Antitumour sommiferum Colchium autumnale Digoxin Heart stimulant Digitalis lanata Diosgenin Steroidal Dioscorea deltoidea Ellipticine precursor Antitumour Orchrosia elliptica Forskolin Bronchial Coleus forskolii Ginsenosides asthma Health tonic Panax ginseng Morphine Sedative Papaver somniferum Podophyllotoxin Antitumour Podophyllum Quinine Antimalarial petalum Cinchona ledgeriana Sanguinarine Antiplaque Sanguinaria Shikonon Antibacterial canadenis Lithospermum Taxol Anticancer Vincristine Antileukemic erythrhizon Taxus brevifolia P.somnuferum Catharenthus roseus Vinblastine Antileukemic Catharentus roseus b Nuôi cấy tế bào Sản xuất hoạt chất thứ cấp từ nuôi cấp tế bào thực nhiều loài dược liệu khác nhau: sản xuất solasodine từ callus Solanum eleagnifolium; cephaelin emetine từ callus Cephaelis ipecacua; quinoline alkaloids từ nuôi cấy dịch treo tế bào Cinchona ledgeriana Ở nhật sản xuất thương mại hóa shikonin, berberine saponins từ ni cấy tế bào Nuôi cấy mô tế bào sâm Hàn Quốc Ngọc Linh Nuôi cấy mô tế bào cà rốt bioreactor nhựa Hình 1: Ứng dụng cơng nghệ ni cấy tế bào Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy tế bào tồn dòng tế bào khơng ổn định, tích lũy hoạt chất thấp, tăng trưởng chậm gặp khó khăn sản xuất quy mơ lớn Do hướng ni cấy rễ tóc để sản xuất hoạt chất thứ cấp cho hệ số nhân sinh khối lớn, ổn định chứa hàm lượng hoạt chất cao, số trường hợp cao tự nhiên c Ni cấy rễ tóc Vi khuẩn A rhizogenes (chứa plasmide pRi – root inducing) tác nhân gây bệnh tạo rễ tóc (hairy root) cho thực vật Nó cảm ứng kích thích tạo rễ xâm nhiễm vào tế bào thực vật điểm bị thương Những rễ tóc sinh trưởng tốt điều kiện nuôi cấy in–vitro mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Rễ sản xuất hoạt chất thứ cấp mức độ tương đồng vượt xa so với khả rễ mẹ hay rễ nuôi cấy rễ bất định in–vitro không chuyển gen Theo Kuzovkina and Schneider (2006), có 185 loại trồng thuộc 41 họ nghiên cứu ni cấy rễ tóc Bảng 2: Nghiên cứu ni cấy rễ tóc số loại trồng Plant species Product References Bidens spp Polyacetylenes McKinely et al (1993) Cinchona ledgeriana Quinolene alkaloids Hamill et al (1987) Cichorium intybus Esculetin Bais et al (1999) Datura ssp Tropane Rhodes (1989) Cassia ssp Anthroquinonnes Ko et al (1988) Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Mano et al.(1988) Echinacea purpurea Alkaloids Trypsteen et al (1991) Glycyrrhiza uralensis Glycyrrhizin Ko et al (1989) Hyoscyamusalbus Alkaloids Shimomura et al (1991) Panax ginseng Saponin Yoshikawa and Furuya Salvia miltorrhiza Diterpenes Hu and Alfermann (1987) (1993) Artemisiaabsynthium Volatine Kennedy et al (1993) Lithospermum Shikonin Shimomura et al.(1986) Rauvolfiaserpentina erythrorhizon Rubia cordifolia Ajmaline, serpentine Benjamin et al (1994) Anthroquinones Shin and Kim (1996) Glycyrrhizaglabra Isoprnylated Asada et al (1998) Panax ginseng Ginsenoside flavonoids Hyoscyamine Kunshi et al (1998) Hyoscyamus muticus Sevon et al (1998) Hình 2: Ni cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh trung tâm CNSH TP HCM 1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất hợp chất thứ cấp- hoạt chất Saponin từ nhân sâm Qua báo, công trình nghiên cứu cho thấy tình hình ứng dụng cơng nghệ sinh học sản xuất hợp chất thứ cấp-hoạt chất Saponin từ nhân sâm sau: Theo Yoshikawa Furuya (1987) ni cấy rễ tóc sâm Triều Tiên rễ tóc tổng hợp saponin, ginsenoside tương tự rễ tự nhiên cao gấp 2,4 lần, trường hợp so với rễ bình thường khơng chuyển gen cao gấp lần dựa khối lượng khô Bên cạnh đó, Yu cộng (2000) nghiên cứu tăng khả sản xuất ginsenoside Jamonic acid vài tiền chất rễ tóc Kết Jasmonic acid nồng độ 1.0 ± 5.0 mg/ l cải thiện mạnh ginsenoside tổng số Theo nghiên cứu Mallol cộng (2001) ảnh hưởng gen rol gây kiểu hình thái rễ tóc nhân sâm khác hàm lượng hoạt chất ginsenoside biến đổi tùy theo kiểu hình Kết nghiên cứu Sivakumar cộng (2005) nuôi cấy rễ tóc sâm Triều tiên hệ thống bioreactor báo cáo thành phần khống chất đóng vai trò quan trọng tăng trưởng sinh khối, elicitor làm giảm sinh khối làm tăng hàm lượng ginsenoside Jung cộng (2006) tạo 193 dòng rễ sâm P gisneng Các dòng rễ chia thành nhóm tùy thuộc vào kiểu hình chúng Trong kết nghiên cứu, Zhou cộng (2007) báo cáo oligosaccharides, a heptasaccharide (HS) an octasaccharide (OS), từ Paris polyphylla var yunnanensis kích thích sinh trưởng rễ tóc sâm Triều Tiên tích lũy saponin Trong báo cáo Mathur cộng (2010) nghiên cứu rễ tóc sâm Mỹ P Quinquefolium: rễ tóc có tốc độ sinh trưởng mạnh tăng 4–10 lần khoảng thời gian nuôi cấy từ 3–8 tuần cải thiện khả tổng hợp ginsenoside (saponin) Rễ tóc sản xuất hoạt chất saponin tốt từ tuần thứ đến tuần thứ sau ni cấy II PHÂN TÍCH XU HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NHÂN SÂM TRÊN CƠ SỞ SỐ LIỆU SÁNG CHẾ QUỐC TẾ Lịch sử sử dụng nhân sâm 4500 năm trước Trung Quốc, sau sâm biết đến nước phương Tây phát nhân sâm Mỹ vào năm 1716 Ottawa, Canada Năm 1843, nhà thực vật học người Nga Carl A.Meyer đặt tên cho nhân sâm Châu Á tên thực vật “Panax” có nghĩa tiếng Hy Lạp chữa bệnh tồn diện phân loại theo gia đình Panax gồm Panax quinquefolius (nhân sâm Mỹ), Panax notoginseng (nhân sâm Trung Quốc), Panax japonicus (nhân sâm Nhật Bản), Panax vietnamensis (nhân sâm Việt Nam), sân Hàn Quốc, Siberian ginseng (nhân sâm Siberi) Nhâm sâm xem thảo dược chăm sóc sức khỏe điều trị bệnh Châu Á ngày lan rộng đến nhiều quốc gia giới Tại Việt Nam, nhiều đề tài nhân sâm nghiên cứu thời gian gần như: Năm 2012, Viện Sinh học Tây Nguyên có thực đề tài “Nghiên cứu nhân giống vơ tính sản xuất sinh khối rễ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis et Grushvo)” đề tài “Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy bioreactor” Năm 2002, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực đề tài “Nghiên cứu trồng thử nghiệm nhân sâm Hàn Quốc theo công nghệ Hàn Quốc Sơn La” 2.1 Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo thời gian Trên sở số liệu sáng chế tiếp cận được, trung tâm tiến hành phân tích tra cứu khoảng 6326 sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm Vào kỷ 19 có sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ vấn đề này, số sáng chế tăng dần từ năm 2000 đạt số lượng nộp đơn nhiều 653 sáng chế vào năm 2014 Số sáng chế 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 1 653 615 604 438 449 434 371 351 340 222 197 112 24 15 32 15 30 15 6 11 39 40 86 22 29 142 189 252 212 101 1964 1968 1972 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008 2012 2016 Biểu đồ 1: Tình hình nộp đơn bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo thời gian Trong tổng số 6326 sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm có 103 sáng chế đăng kí bảo hộ tổng hợp hợp chất thứ cấp từ nhân sâm, số sáng chế có xu hướng tăng giai đoạn 2005 20 Số sáng chế 18 18 16 14 12 10 10 1 1 1 1 3 10 2 1985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013 2015 2017 Biểu đồ 2: Tình hình nộp đơn bảo hộ sáng chế nghiên cứu tổng hợp hợp chất thứ cấp từ nhân sâm Phân tích theo giai đoạn thấy rõ gia tăng lượng sáng nộp đơn đăng ký bảo hộ về nghiên cứu ứng dụng nhân sâm sau: - Thập niên 60: sáng chế - Thập niên 70: 47 sáng chế - Thập niên 80: 187 sáng chế - Thập niên 90: 384 sáng chế - Giai đoạn 2000-2009: 2138 sáng chế - Giai đoạn 2010-2016: 3544 sáng chế Số lượng sáng chế đăng kí bảo hộ tăng nhanh chóng giai đoạn 2000-2009 nửa đầu thập niên 2010-2016 3544 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 2138 Thập niên 60 384 187 47 Thập niên 70 Thập niên 80 Thập niên 90 Giai đoạn 2000-2009 Giai đoạn 2010-2016 Biểu đồ 3: Tình hình nộp đơn bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo giai đoạn Bên cạnh số lượng sáng chế đăng kí, xu hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm thể rõ qua số lượng báo khoa học công bố Số báo 6110 7000 5310 6000 5000 3620 4000 2050 3000 2000 1000 241 667 Thập niên 60 Thập niên 70 Thập niên 80 Thập Giai đoạn Giai đoạn niên 90 2000-2009 2010-2016 Biểu đồ 4: Số lượng báo khoa học công bố nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo giai đoạn Dựa nguồn liệu Google Scholar, tra cứu khoảng 241 báo khoa học công bố chủ đề thập niên 60, số lượng báo tăng theo thời gian Đến giai đoạn 2000-2009 số lượng báo công bố chủ đề đạt nhiều 6110 báo Qua số liệu số lượng sáng chế báo khoa học, ta nhận thấy xu hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm chủ đề quan tâm nghiên cứu giới 2.2 Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia Sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm nộp đơn bảo hộ 41 quốc gia tổ chức từ châu lục: Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Úc Châu Phi Trong đa số sáng chế tập trung nộp đơn bảo hộ Châu Á Hình 3: Sự phân bố khu vực có sáng chế nộp đơn bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm giới Châu Á: có 5576 sáng chế đăng kí bảo hộ 11 quốc gia Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hong Kong, Ấn Độ, Singapore, Việt Nam, Philippine, Israel Malaysia Châu Âu: có 485 sáng chế đăng kí bảo hộ 21 quốc gia Nga, Đức, Pháp, Tây Ban Nha, Anh, Ý, Ba Lan, Thụy Sỹ, Hungary, Hà Lan, Bỉ, Đan Mạch, Bồ Đào Nha, Thụy Điển, Áo, Czech, Croatia, Moldova, Đan Mạch,Hy Lạp, Uraina tổ chức: EP WO Châu Mỹ: có 211 sáng chế đăng kí bảo hộ quốc gia Mỹ, Canada, Mexico Braxin, Ecuador Chile Châu Úc: có 50 sáng chế đăng kí bảo hộ quốc gia Úc Newzeland Châu Phi: có sáng chế đăng kí bảo hộ quốc gia Nam Phi 5576 6000 5000 4000 3000 2000 1000 485 211 50 Châu Á Châu Âu Châu Mỹ Châu Úc Châu Phi Biểu đồ 5: Số lượng sáng chế nộp đơn bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo châu lục Trong đó, bốn quốc gia dẫn đầu nhận đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm Trung Quốc (3111 SC), Hàn Quốc (1925 SC), Nhật (437 SC) Mỹ (159 SC) 2312 2500 2000 1500 728 892 1000 12 500 19 27 99 898 59 107 109 18 140 68 Trung Quốc Hàn Quốc 69 Nhật 67 Thập niên 60 Thập niên 70 Thập niên 80 Mỹ Thập niên 90 Giai đoạn 2000-2009 Giai đoạn 2010-2016 Biểu đồ 6: Tình hình nộp đơn bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia dẫn đầu theo giai đoạn 10 Do đặc điểm sinh trưởng nhân sâm, chủ yếu trồng nước Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Canada… Đây bốn quốc gia có sản lượng nhân sâm chiếm 99% sản lượng nhân sâm giới, nguồn chủ yếu sản xuất nhân sâm cho giới: đứng đầu Trung Quốc với 44.749 tấn, Hàn Quốc 27.480 tấn, Canada xếp thứ ba 6.486 Mỹ 1.054 (J Ginseng Res Vol 37) Bên cạnh đó, theo báo cáo tổng quan xu hướng nghiên cứu nhân sâm khảo sát năm 2010, có tổng cộng 29 quốc gia nghiên cứu nhân sâm Hàn Quốc đứng đầu số lượng báo công bố chiếm 35,7%, Trung Quốc xếp thứ hai với 32,3%, Mỹ chiếm 11,3%, Nhật chiếm 3,4% Từ số liệu lí giải Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ , Nhật quốc gia dẫn đầu nhận đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm Trung Quốc quốc gia nhận nhiều đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm Vào thập niên 80 có 12 sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ vấn đề này, số sáng chế tăng mạnh giai đoạn sau giai đoạn 2000-2009 728 sáng chế giai đoạn 2010-2016 2312 sáng chế Tại Hàn Quốc, thập niên 70 nhận đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm đầu tiên, số lượng sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ vấn đề tăng dần theo giai đoạn Vào giai đoạn 2000-2009, Hàn Quốc vượt qua nước nhận nhiều đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nhân sâm với 892 sáng chế Nhật Bản nhận đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm từ sớm-thập niên 60, số sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ vấn đề tăng theo giai đoạn Vào thập niên 90, Nhật Bản vượt qua nước quốc gia nhận nhiều đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm với 109 sáng chế Mỹ vào thập niên 70 nhận đơn đăng kí bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm, số sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ vấn đề tăng theo giai đoạn 11 2.3 Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo hướng nghiên cứu Theo bảng phân loại sáng chế quốc tế IPC, số lượng sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm tập trung chủ yếu vào hướng nghiên cứu sau: - Hướng nghiên cứu chế phẩm, thuốc, chiết xuất từ nhân sâm chiếm 34% tổng lượng sáng chế - Hướng nghiên cứu hoạt tính trị liệu hợp chất, chiết xuất từ nhân sâm chiếm 22% tổng lượng sáng chế - Hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm thực phẩm, thực phẩm chức năng, thức uống chiếm 15% tổng lượng sáng chế - Hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm sản phẩm chăm sóc da chiếm 8% tổng lượng sáng chế hướng nghiên cứu khác Hướng nghiên cứu chế phẩm, thuốc, chiết xuất từ nhân sâm chiếm 34% tổng lượng sáng chế 8% Hướng nghiên cứu hoạt tính trị liệu hợp chất, chiết xuất từ nhân sâm chiếm 22% tổng lượng sáng chế 15% 34% Hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm thực phẩm, thực phẩm chức năng, thức uống chiếm 15% tổng lượng sáng chế 22% Hướng nghiên cứu ứng dụng nhân sâm sản phẩm chăm sóc da chiếm 8% tổng lượng sáng chế Biểu đồ 7: Tình hình nộp đơn đăng ký bảo hộ sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm theo số phân loại sáng chế quốc tế IPC Các sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia phân bố vào hướng nghiên cứu tập trung chủ yếu vào hướng nghiên cứu chế phẩm, thuốc, chiết xuất từ nhân sâm Trên thực tế, nhân sâm thương mại quốc gia nhiều sản phẩm khác như: nhân sâm tươi, nhân sâm khô, sản phẩm liên quan thực phẩm chức năng, thuốc, sản phẩm chế biến Tại Trung Quốc, sản phẩm tiêu thụ chủ yếu 12 rễ sâm Mỹ Nhật Bản sản phẩm từ rễ sâm viên nang, viên nén, thuốc bổ sung dinh dưỡng… Tại Hàn Quốc, nhân sâm tiêu thụ rộng rãi thực phẩm tươi, thuốc Các sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia phân bố vào hướng nghiên cứu tập trung chủ yếu vào hướng nghiên cứu chế phẩm, thuốc, chiết xuất từ nhân sâm Biểu đồ 8: Tình hình đăng kí sáng chế bảo hộ hướng nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng nhân sâm quốc gia dẫn đầu Kết luận: Nhân sâm dược liệu nghiên cứu ứng dụng từ cách khoảng 4500 năm quốc gia Châu Á, điển hình Trung Quốc Vào kỷ 19 có sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ, có khoảng 6326 sáng chế nộp đơn đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm Châu Lục, dẫn đầu nhận đơn bảo hộ sáng chế quốc gia thuộc Châu Á (3111 SC), Hàn Quốc (1925 SC), Nhật (437 SC) Trong tổng số sáng chế đăng kí bảo hộ nghiên cứu ứng dụng nhân sâm có 103 sáng chế đăng kí bảo hộ tổng hợp hợp chất thứ cấp saponin từ nhân sâm, số sáng chế bắt đầu tăng giai đoạn 2005 Dựa vào bảng phân loại số sáng chế quốc tế cho thấy sáng chế nghiên cứu ứng dụng nhân sâm tập trung vào đăng kí bảo hộ hướng chiết xuất hợp chất (chiếm 34%) hoạt tính trị liệu hợp chất chiết xuất từ nhân sâm (chiếm 22%) 13 III NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TÓC SÂM NGỌC LINH VÀ NHÂN SÂM SINH KHỐI THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP SAPONIN 3.1 Nghiên cứu tạo dòng rễ tóc sâm Ngọc Linh Sâm Ngọc Linh loại sâm phát độ cao 1500-2000 m thuộc vùng núi Ngọc Linh thuộc hai huyện Trà My (Quảng Nam) Đak Tô (Kon Tum) Đây loại thảo ưa ẩm, ưa bóng, mọc rải rác tán rừng kín ẩm ướt, nhiệt độ 15-18°C, sinh trưởng mạnh vào mùa xuân-hè, mùa hoa tháng 5-10, phần mặt đất lụi tàn hàng năm Việc di thực trồng sâm khó khăn, thời gian ni trồng dài, sinh trưởng chậm cho suất thấp, thân rễ năm tuổi nặng khoảng 60g/cây Đồng thời, chi phí trồng, chăm sóc bảo vệ tốn nhiều Vì vậy, nước có đơn vị ứng dụng công nghệ sinh học: nuôi cấy tế bào, ni cấy rễ bất định, ni cấy rễ tóc tạo rễ sâm Ngọc Linh đáp ứng nhu cầu sâm ngày nhiều Tại học viện Quân Y kết hợp với viện nghiên cứu Hàn Quốc ứng dụng nuôi cấy tế bào sản xuất rễ sâm hay Viện Sinh học nhiệt đới áp dụng nuôi cấy rễ bất định tạo rễ sâm Từ 2011, trung tâm Công nghệ sinh học kết hợp với trường Đại học Picardie Jules Verne – Pháp nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh dựa ni cấy rễ tóc để hạn chế chất kích thích sinh trưởng Các phương pháp tạo rễ tóc trung tâm Sinh học sau: - Phương pháp 1: sử dụng sâm lấy mẫu từ Kon Tum, khử trùng sau ni cấy invitro để tạo Calli MS sau nhân lên cho lây nhiễm với loại vi khuẩn dạng dại TR7, TR107, 15834 với loại trồng khác áp dụng phương pháp nhanh tạo rễ sâm Ngọc Linh khó tạo rễ cách - Phương pháp 2: tiến hành sở kết nghiên cứu giới ngâm ni cấy đoạn cuống có bổ sung acetonsyringone kích thích q trình lây nhiễm vi khuẩn, nhiên phương pháp tỉ lệ thành cơng thấp - Phương pháp 3: dùng invitro, tiến hành lây nhiễm sinh rễ Từ rễ thu tiến hành kiểm tra diện gen vi khuẩn đưa vào, nuôi cấy diệt vi khuẩn đi, nhân nhanh lên thu dạng sinh khối 14 Các kiểu hình rễ tóc mà trung tâm thu qua trình nghiên cứu có tỉ lệ chuyển gen vi khuẩn vào sâm Ngọc Linh thấp 1% Trung tâm tiến hành thử nghiệm thu 500 rễ 31 dòng rễ thực chất gene vi khuẩn đưa vào chia làm kiểu hình khác nhau: - Nhóm 1: rễ mọc mỏng, khả phân nhánh - Nhóm 2: phân nhánh đều, rễ đạt - Nhóm 3: phân nhánh nhiều rễ to - Nhóm 4: tạo u sinh khối không tạo rễ Tiếp theo, trung tâm tiến hành khảo sát xem nhóm rễ sinh trưởng nhanh có hàm lượng saponin cao để chọn dòng thích hợp ni cấy Hình 4: Các kiểu hình rễ tóc ni cấy trung tâm thu Sau trung tâm tiến hành phân tích PCR để kiểm tra gen rol chuyển từ vi khuẩn vào tạo rễ (bảng 3) Bảng 3: Kết phân tích kiểu hình khả sinh khối rễ tóc Dòng rễ Kiểu hình Sinh khối (g) sau 60 ngày 62 Nhóm 2.6 ± 0.19 (e) 15 D Nhóm 8.3 ± 0.29 (a) 16 Nhóm 5.7 ± 0.58 (c) 35 Nhóm 7.0 ± 0.13 (b) 69 Nhóm 5.1 ± 0.23 (c,d) 268 Nhóm 5.2 ± 0.67 (c,d) A Nhóm 7.3 ± 0.2 (b) 277 Nhóm 4.7 ± 0.32 (d) 81 Nhóm 3.2 ± 0.15 (e) Nhóm Lost Từ kết phân tích, trung tâm nhận thấy rễ có sinh khối lớn sau 60 ngày thuộc nhóm D; 35 nhóm 3A Đồng thời, kết phân tích hàm lượng saponin rễ nhóm D&35 nhóm 3A cao (hình 5) 100000 Peak areas 80000 60000 40000 20000 62 D 16 35 69 268 A 277 81 lines Hình 5: Kết phân tích hàm lượng Saponin rễ tóc 3.2 Thành phần hoạt chất saponin rễ tóc sâm Ngọc Linh Hợp chất saponin chiết xuất từ rễ tóc sau ni cấy theo quy trình sau: rễ tóc tươi đặt tủ -800C vòng 24-48 tiếng để ngưng q trình chuyển hóa hợp chất sau sấy khơ nghiền đem chiết xuất lần với methanol 80% thu dịch chiết quay Dung dịch cuối đem phân tích LC/MS thu kết phân tích hàm lượng hợp chất saponin mẫu 16 Hình 6: Quy trình tách chiết hợp chất Saponin rễ tóc Kết phân tích hàm lượng saponin dòng rễ nhóm 2-35 so với rễ năm tuổi tự nhiên, ta nhận thấy có diện chất tương tự khác nồng độ cường độ peak số 12, 16 nhóm Ginsenoside rễ sâm tự nhiên cao rễ tóc; ngược lại cường độ peak số 11của nhóm vinaginsenoside R1 rễ tóc ni cấy lại cao sâm tự nhiên Ngoài ra, rễ tóc ni cấy xuất nhóm Pseudoginsenoside F11 peak số Hình 7: Kết phân tích hợp chất saponin rễ tóc nuôi cấy rễ sâm tự nhiên năm tuổi 3.3 Ảnh hưởng yếu tố lên nhân nhanh sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh a Mật độ rễ tóc Khảo sát ảnh hưởng mật độ rễ đến tốc độ nhân sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh tiến hành thí nghiệm khảo sát tháng theo bảng sau: 17 Bảng Ảnh hưởng mật độ nuôi cấy đến khối lượng hệ số nhân rễ tóc sâm Ngọc Linh sau tháng nuôi cấy Mật độ mẫu ban đầu (g) Khối lượng rễ tươi (g) Hệ số nhân (lần) 7,18 c 7,18 b 39,57 a 13,29 a 36,91 a 7,38 b 23,12 b 3,22 c CV 22,1% 17,67% Kết cho thấy với khối lượng ban đầu g cho hệ số nhân cao b Tần suất bơm hệ thống TIS Khảo sát ảnh hưởng tần suất bơm hệ thống TIS đến tốc độ nhân sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh tiến hành thí nghiệm khảo sát tháng theo bảng sau: Bảng Ảnh hưởng tần suất bơm đến khối lượng hệ số nhân rễ tóc sâm Ngọc Linh sau tháng ni cấy Tần suất bơm (giờ/lần) Khối lượng rễ tươi (g) Hệ số nhân (lần) 12,32 b 4,11 b 40,50 a 13,50 a 39,46 a 13,15 a CV 10,2% 9,8% Kết quả: sau nuôi cấy tháng, khối lượng rễ tóc hệ số nhân đạt cao với tần suất bơm từ – giờ/lần 18 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm hệ thống TIS đến tốc độ nhân sinh khối rễ tóc sâm Ngọc Linh tiến hành thí nghiệm khảo sát tháng theo bảng sau: Bảng Ảnh hưởng thời gian bơm đến khối lượng hệ số nhân rễ tóc sâm Ngọc Linh sau tháng ni cấy Thời gian bơm (phút/lần) Khối lượng rễ tươi (g) Hệ số nhân (lần) 23.29 b 7.76 b 44.68 a 14.89 a 18.33 b 6.11 b CV 13.3% 13.34% Kết quả: Thời gian bơm hệ thống TIS thích hợp phút/lần ni cấy rễ tóc sâm Ngọc Linh chuyển gen 3.4 Các phương pháp chiết xuất, phân tích đánh giá chất lượng sâm Ngọc Linh a Phương pháp chiết xuất sâm Ngọc Linh Các phương pháp chiết xuất sâm Ngọc Linh gồm phương pháp sau: - Phương pháp ngâm: phương pháp đơn giản chiết xuất chất từ dược liệu Đây kỹ thật chiết lạnh gián đoạn thực nhiệt độ thường, dược liệu ngâm ngập dung môi sau khoảng thời gian định rút dịch chiết Phương pháp có ưu điểm đơn giản, rẻ tiền suất thấp, thời gian, chiết kiệt hoạt chất dược liệu - Phương pháp ngấm kiệt: phương pháp chiết lạnh nhiệt độ thường cho dung môi chảy chậm liên tục qua lớp dược liệu nằm yên Bột dược liệu ngâm dung môi, rút nhỏ giọt dịch chiết dưới, bổ sung dung mơi phía Ưu điểm chiết kiệt hoạt chất dược liệu, nhược điểm suất thấp, thủ công, tốn dung môi 19 - Phương pháp đun hồi lưu: phương pháp chiết nóng, gián đoạn, kèm khuấy trộn Ưu điểm suất cao dược liệu chất chiết tiếp xúc liên tục với nhiệt tạo chất chuyển hóa, phải chiết lặp lại nhiều lần - Phương pháp Soxhlet: phương pháp chiết nóng liên tục, dược liệu ln chiết dung môi mới, chất chiết tiếp xúc liên tục với nhiệt Ưu điểm thiết bị tự động hóa, chiết kiệt hoạt chất, nhược điểm chất chiết tiếp xúc với nhiệt liên tục áp dụng quy mô nhỏ - Phương pháp siêu âm: Sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào, tăng tiếp xúc, xáo trộn, làm nóng chỗ Ưu điểm phương pháp chiết kiệt hoạt chất thời gian ngắn sử dụng phòng thí nghiệm chưa áp dụng cơng nghiệp - Chiết xuất sóng vi ba: sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào, tăng tiếp xúc, xáo trộn, làm nóng chỗ Ưu điểm hiệu chiết cao, nhược điểm thiết bị phức tạp, quy mô nhỏ, chất tiếp xúc với nhiệt - Dùng chất lỏng siêu tới hạn: sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để chiết xuất Ưu điểm độ nhớt thấp, khả khuếch tán cao, độ chọn lọc cao, thân thiện môi trường thiết bị phức tạp, đắt tiền b Phương pháp phân tích sâm Ngọc Linh Các phương pháp phân tích sâm Ngọc Linh gồm nhóm chính: - Vi học (soi bột, vi phẫu): mục đích kiểm nghiệm thực vật học, có ý nghĩa phân biệt loài khác giả mạo Ưu điểm phương pháp nhanh chóng, rẻ tiền khó phân biệt lồi chi Pana Đây bước kiểm nghiệm ban đầu, cần có bước kiểm nghiệm hóa học - Phân tích định tính phát diện saponin phản ứng hóa học tạo bọt Lierbermann-Buchard, sắc ký lớp mỏng - Phân tích định lượng định lượng saponin phương pháp cân, phương pháp đo quang, sắc kí mỏng, sắc kí lỏng hiệu cao, đầu dò UV-PDA, đầu dò RID, đầu dò ELSD, đầu dò khối phổ MS 20 c Đánh giá chất lượng sâm Ngọc Linh Để đánh giá chất lượng sâm Ngọc Linh dùng phương pháp định tính SKLM phương pháp định lượng HPLC-PDA Kết định lượng cho thấy mẫu sâm thị trường phần lớn khơng có G-Rd mẫu sâm Ngọc Linh G-Rd lại cao, tương đương với G-Rb1 Các mẫu sâm thị trường đa số có hàm lượng V-R2 cao 0,5% hay số mẫu cao khoảng 2-4%, sâm Ngọc Linh thấp < 0,2 % Các mẫu sâm thị trường có N-R1 cao 1%, mẫu sâm Ngọc Linh thấp khoảng 0,1% 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alice S T Wong, Chi-Ming Cheb and Kar-Wah Leung, Recent advances in ginseng as cancer therapeutics: a functional and mechanistic overview, The Royal Society of Chemistry 2014 In-Ho Baeg* and Seung-Ho So, The world ginseng market and the ginseng (Korea), J Ginseng Res Vol 37, No 1, 1-7 (2013) Si-Kwan Kim and Jeong Hill Park, Trends in Ginseng Research in 2010, J Ginseng Res Vol 35, No 4, 389-398 (2011) 22 ... nhân sâm sau: - Thập niên 60: sáng chế - Thập niên 70: 47 sáng chế - Thập niên 80: 187 sáng chế - Thập niên 90: 384 sáng chế - Giai đoạn 200 0-2 009: 2138 sáng chế - Giai đoạn 201 0-2 016: 3544 sáng... thị trường phần lớn khơng có G-Rd mẫu sâm Ngọc Linh G-Rd lại cao, tương đương với G-Rb1 Các mẫu sâm thị trường đa số có hàm lượng V-R2 cao 0,5% hay số mẫu cao khoảng 2-4 %, sâm Ngọc Linh thấp < 0,2... khuẩn đưa vào chia làm kiểu hình khác nhau: - Nhóm 1: rễ mọc mỏng, khả phân nhánh - Nhóm 2: phân nhánh đều, rễ đạt - Nhóm 3: phân nhánh nhiều rễ to - Nhóm 4: tạo u sinh khối không tạo rễ Tiếp