Phương Pháp Điện Di (Electrophoresis) PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn Bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương Pháp Điện Di Mục tiêu - Hiểu nguyên tắc hoạt động điện di mao quản Dàn - Lòch sử - Đònh nghóa - Phân loại - Điện di mao quản Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Lòch sử 1791 1877 1897 1897 1923 1930 1939 1950 1955 1958 1967 1967 1969 1969 1970 1970 1972 1979 1981 Faraday Helmholtz Nernst Kohlrausch Kendall, Crittenden Tiselius Svenson Haglund, Tiselius Smithies Hjertén Martin, Everaerts Hjertén Giddings Virtanen Everaerts, Arlinger, Routs Verheggen Mikkers Jorgenson 1984 Terabe 1991 Jandik, Jones 1991 Knox Nguyễn Đức Tuấn Laws of Electrolysis Charged Solvent Layer Closed to Surface of a Wall Properties of Small Ions Kohlrausch Function describing the Order of Migration of Ions and their Concentration Rare Earth Metal Separation by "Ion Migraion Method" Thesis: Moving Boundary Method for Electrophoresis of Proteins (Nobel Price 1948) Development of Zone and Displacement Electrophoresis Electrophoresis Tube filled with Glass Beads and Glass Powder Gel Electrophoresis Electrophoresis in Free Solution Displacement Electrophoresis in Glass Tube with Hydroxyethylcellulose Elimination of Electroosmosis by Coating of Glass Tubes Non-Diffusional Model of Concentration Distribution in Free Zone Electrophoresis Glass Capillaries 0.2 - 0.5 mm I.D Capillary Isotachophoresis UV-Detection Conductivity Detection Use of High Voltage and TEFLON Capillaries Use of 75 µm I.D Open Tubular Glass Capillaries: "High Performance Capillary Electrophoresis – HPCE" Combination of electrophoretic and chromatographic Separation: "Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography – MECC" Use of Surface Active Electrolyte Additives for Reversal of Electroosmotic Flow "Capillary Electrochromatography – CEC" Đại học Y Dược TPHCM Anion hữu vô Standard thiosulfate 16 phosphite bromide 17 chlorite chloride 18 galacturate sulfate 19 carnonate nitrite nitrate 20 acetate 21 ethanesulfonate molybdate 22 propionate azide tungstate 23 propanesulfonate 24 butyrate 67 13 10 10 14 11 16 17 15 20 18 22 19 21 12 1.5min Nguyễn Đức Tuấn 23 24 25 26 28 27 89 seconds 30 29 3.1min 10.fluorophosphate 25 butyrsulfonate 11 chlorate 26 valerate 12 citrate 27 benzoate 13 fluoride 28 glutamate 14 formate 29 pentanesulfonate 15 phospahate 30 D-gluconate Đại học Y Dược TPHCM Đònh nghóa  Quá trình tách tiểu phân ion hóa hòa tan hay phân tán dung dòch điện giải tác dụng điện trường  Độ dòch chuyển điện di (linh độ điện di: electrophoretic mobility, EP) phụ thuộc:  Bản chất tiểu phân: hình dạng, kích thước, điện tích  Dung dòch điện giải: chất, nồng độ, pH, độ nhớt,… Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Đònh nghóa  Chiều chuyển dòch ion phụ thuộc vào điện tích  B  ep (B) Nguyễn Đức Tuấn ep (A) A  ep(C) + D + + C +  ep(D) Đại học Y Dược TPHCM Phân loại  Điện di dung dòch tự (Moving Boundary Electrophoresis) - +  Không dùng chất mang  EP phụ thuộc vào điện trường E, chất tiểu phân  Xác đònh chất có PTL lớn khuếch tán  Kiểm tra độ tinh khiết protein Nguyễn Đức Tuấn Moving Boundary Electrophoresis Đại học Y Dược TPHCM Phân loại  Điện di vệt (điện di vùng: Zone Electrophoresis)  Sử dụng chất mang: giấy, cellulose acetat, gel agar, gel polyacrylamid  EP phụ thuộc vào E, chất tiểu phân, dòng bay (nhiệt Joule), dung dòch điện giải  Tách chất có PTL nhỏ kích thước nhỏ, lượng mẫu Nguyễn Đức Tuấn Điện di gel Đại học Y Dược TPHCM Điện di mao quaûn (Capillary Electrophoresis) Capillary Detector UV, Fluorescence (direct, indirect); electrochemical conductometric MS o.d 200-400µm i.d 5-100µm (2µm) Fused Silica, Teflon coated (RP, Ion exchange) or filled (RP, ) Pt Electrodes Separation Electrolyte Injection Salt solution (borate, phosphate); pH 1-12 organic solvent (0-100%) hydrostatic, vacuum, electromigrative 0-±30 kV 5-150 A Data Processing High Voltage Power Supply Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Điện di mao quản 363µm a) 12µm 50µm b) Fused Silica Capillary I [µA] 300 Liquid cooling 10m/s air cooling w/o cooling 250 200 Hydrodynamic flow profile and chromatographic peak form a) pressure driven b) electroosmosis 150 100 50 0 10 20 30 U [kV] Ohm's Law: U=R.I Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Group 3: Statin derivatives • Optimized electrophoretic conditions mAU ATOR 10 LOV SIM 240 260 280 300 320 340 nm Electrophoretic conditions: 15% methanol in 15 mM borate buffer at pH 8.0 containing 50 mM SDC; fused-silica capillary (57 cm x 50 m i.d., 48.5 cm); injection: 5s at 50 mbar; 30 kV; 30oC; detection wavelength: 237 nm Application – Natural products Analyte Additives Ref Flavonoid (rutin, isoquercitrin, quercitrin, kaempferol, quercetin, etc) 50 mM SDS P.G Pietta, et al; J Chromatogr (549) 367 Opium alkaloids (6 mixture) 12 mM SDS + 25 mM Tween 20 I Bjornsdottir, et al; J Pharm Biomed Anal (13) 687 Amphetamines and related substances 25 mM CTAB + 11% V.C Trenerry, et al; J DMSO + 1% ethanol Chromatogr A (708) 169 Cocaine and related substances 50 mM CTAB + 7.5% ACN V.C Trenerry, et al; Electrophoresis (15) 103 Codeine and its by products 40 mM SDS M Korman, et al; J Chromatogr (645) 366 Application – Optical purity testing of drugs • Use area percentage method for purity testing of drugs as in HPLC • Normalize peak areas with migration times • Identify impurities above apparent levels of 0.1% Application – Dexchlorpheniramine maleate 12 10 14,469 18,393 mAU 14 Pseudoephedrine HCl (IS) Levochlorpheniramine maleate Dexchlorpheniramine maleate 17,994 Optical purity testing of dexchlorpheniramine maleate by CE with -CD 2.5 7.5 10 12.5 15 17.5 Conditions: Capillary: 76.5 cm (68 cm effective length) x 50 m I.D.; Background electrolyte: 0.05 M Tris buffer pH 3.5 + mM -CD; Detection: 214 nm; Applied voltage: 20 kV; Injection: 50 mbar x 10 sec.; Temperature: 25oC Chemical structure of drug substances O O * F NCH 10 N CH3 Nefopam N4 N * 1O CH O OH O 4' Cl 2' CH3 2'' Cl Cl O CH 4'' Cl Ketoconazole * O * * N Brompheniramine CH3 N N CH 10 * CH3 CH3 N CH Propranolol O * Cl OH O COOCH 2CH Cl N Miconazole Amlodipine O N O N N * * CH 3OOC Cl N1 Ofloxacin N S Promethazine NH2 Effect of the CD types and their concentrations on Rs Rs Electrophoretic conditions: 50 – 100 mM tris-phosphate buffer pH 2.5 – 3.0, 20% methanol (for propranolol) or 25% acetonitrile (for nefopam); capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = max of each compound; 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Electropherograms for the chiral separation of enantiomers Miconazole mAU mM -CD 4 3 2 mAU mM HP-CD 0 10 15 mM HB-CD 1 mAU 10 15 10 15 Optimized electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 228 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Electropherograms for the chiral separation of enantiomers Brompheniramine 10 mM CD 25 mM HP-CD 15 mM HB-CD Optimized electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 3.5; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 230 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Electropherograms for the chiral separation of enantiomers Nefopam 30 mM -CD 30 mM HP--CD 20 mM HB--CD Optimized electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5, 25% MeCN; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 275 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Electropherograms for the chiral separation of enantiomers Amlodipine mAU 10 mM HP-5 CD 10 15 20 25 Ofloxacin mAU mM HB-CD 10 4 2 mAU 30 mM HP-CD 10 15 20 25 Optimized electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 360 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar 30 mM HB--CD 0 mAU 10 15 20 25 10 15 20 Optimized electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 294 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Electropherograms for the chiral separation of enantiomers Ketoconazole Propranolol mAU mAU 30 mM HP-CD 2 0 20 mAU mAU 15 mM HB--CD 30 mM HB--CD 10 10 20 mM HB--CD Promethazine 30 40 4 2 0 10 Optimized electrophoretic 20 30 40 conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5, 20% MeOH; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 288 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar 10 15 20 15 25 35 min Optimized electrophoretic conditions: Tris-phosphate; 63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm; 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar KET: 50 mM BGE pH 3.0;  = 227 nm PRM: 100 mM BGE pH 2.5, 30% MeOH;  = 254 Application mAU 15 R-amlodipine S-amlodipine R-amlodipine 30 mAU mAU 20 10 15 10 S-amlodipine S-amlodipine tablet S-amlodipine drug substance S-amlodipine Amlodipine racemic spiked R-amlodipine -5 20 10 15 min Electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5, 10 mM 10 20 25 25 HP--CD; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 360 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Application Ofloxacin racemic spiked levofloxacin Levofloxacin tablet mAU mAU 16 Levofloxacin 12 12 Ofloxacin Levofloxacin 16 0 10 15 20 10 15 20 Electrophoretic conditions: 50 mM tris-phosphate buffer pH 2.5, 30 mM HB--CD; capillary (63.5 cm x 50 m i.d., 54 cm);  = 294 nm, 25oC; 20 kV; injection: 5s at 50 mbar Conclusion CZE and MEKC can be used for drug analysis as a complementary or alternative method to HPLC Conclusion Advantage • One-run separation of every kind of drug, including cationic, neutral and anionic is possible within a relatively short time • MEKC is especially powerful for the separation of complex mixtures because of its high resolution • Direct enantiomer separation also can be successful using chiral selectors Disadvantage • For much wider use it is still desirable for the precision in quantitative analysis to be improved to be comparable to those in HPLC .. .Phương Pháp Điện Di Mục tiêu - Hiểu nguyên tắc hoạt động điện di mao quản Dàn - Lòch sử - Đònh nghóa - Phân loại - Điện di mao quản Nguyễn Đức Tuấn Đại học... dòch điện giải tác dụng điện trường  Độ dòch chuyển điện di (linh độ điện di: electrophoretic mobility, EP) phụ thuộc:  Bản chất tiểu phân: hình dạng, kích thước, điện tích  Dung dòch điện. .. thước nhỏ, lượng mẫu Nguyễn Đức Tuấn Điện di gel Đại học Y Dược TPHCM Điện di mao quaûn (Capillary Electrophoresis) Capillary Detector UV, Fluorescence (direct, indirect); electrochemical conductometric