CHỈ SỐ KHÚC XA QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ (F.S - Fluorescence spectrophotometry) QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ (F.S - Fluorescence spectrophotometry) MỤC TIÊU: - Trình bày chế qúa trình phát huỳnh quang phân tử - Nêu cấu hình máy quang phổ huỳnh quang - Nêu ứng dụng cách đọc phổ huỳnh quang PHÂN TỬ HẤP THU UV-VIS PHÁT XẠ F.S I.R QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ (F.S - Fluorescence spectrophotometry) QUANG PHỔ PHÁT XẠ PHÂN TỬ (F.S - Fluorescence spectrophotometry) Electron trạng thái kích thích trạng thái đơn (singlet) hay trạng thái ba (triplet) • Trạng thái đơn (singlet): electron trạng thái kích thích có spin đối song với electron trạng thái bản, có độ bội M = 2S + = 2(-1/2+1/2) + = (singlet) • Trạng thái ba (triplet): chúng có spin song song độ bội M = 2S + = 2(1/2+1/2) + = (Triplet) Theo định luật Hund, electron singlet có mức lượng cao electron triplet CHỈ SỐ KHÚC XA Các phân tử hấp thu photon ánh sáng vùng UV-VIS mà không phát quang: phân tử chuyển từ trạng thái lượng đơn (Singlet) S0 sang trạng thái lượng kích thích đơn (Singlet) S1 trở trạng thái mà không phát xạ (q trình khử hoạt hay q trình phục hồi khơng xa), lượng dư chuyển thành nhiệt cho mơi trường Các phân tử có tính chất phát huỳnh quang : Khi hấp thu xạ l1 vùng UV-VIS, phân tử chuyển từ trạng thái lượng S0 sang trạng thái lượng kích thích đơn (Singlet) S1 từ mức lượng cao trạng thái kích thích đơn trở mức lượng thấp trạng thái kích thích đơn, giải phóng phần lượng TỰ VA CHẠM, gọi trình bất hoạt hay dao động hồi phục CHỈ SỐ KHÚC XA  Q trình chuyển nội hệ : electron trở trạng thái S0 làm phân tử phát xạ huỳnh quang l3 giải phóng lượng lại Sự phát huỳnh quang sau tắt nguồn kích thích (10-8 s) Năng lượng phát huỳnh quang ln ln thấp lượng kích thích (một phần lượng TỰ va chạm), nghĩa : EPX < EKT hay l3 > l1 lPX > lKT (ĐL Stokes) Các phân tử có tính chất phát lân quang : Các phân tử có tính chất phát lân quang : • Q trình vượt nội hệ: electron trạng thái • Q trình chuyển nội hệ: electron Triplet trở trạng lượng kích thích đơn (Singlet) S1 chuyển sang trạng thái thái S0 phát xạ l4 với bước sóng dài lượng kích thích ba (Triplet) T1 (có mức xạ kích thích xạ huỳnh quang Sự phát lượng thấp hơn) xạ kiểu gọi phát lân quang, thời gian phát lân quang dài sau tắt nguồn xạ kích thích (10-4 – 101 s dài hơn) Sự phát lân quang xảy môi trường rắn nhiệt độ thấp CHỈ SỐ KHÚC XA ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG  Hiệu suất lượng tử huỳnh quang F tỉ số số phân tử phát huỳnh quang tổng số phân tử bị kích thích: F = Số phân tử phát huỳnh quang / tổng số phân tử bị kích thích  Cường độ phát xạ huỳnh quang IF tỉ lệ với : - hiệu suất lượng tử huỳnh quang F - cường độ xạ kích thích bị hấp thu mẫu = Io – It IF = F (Io – It) = F.Io(1 – It / Io) = F.Io (1 – T) Maø: A = -logT = e.C.l T = 10 IF = F.Io (1 – 10 -e.C.l) IF = F.Io.(e.C.l ) [1 – (e.C.l)2 / 2! + (e.C.l)3 / 3! + (e.C.l)n/ -e.C.l n!] Trường hợp dung địch loãng (C nhỏ), e.C.l nhỏ, viết phương trình rút gọn lại sau : Nguồn: Quantitative chemical analysis, Daniel C Harris, nd Ed., Freeman ĐỊNH LUẬT BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG IF = F.Io.(e.C.l ) = k’.Io.C (3) k’ = F e.l  Cường độ xạ huỳnh quang IF phụ thuộc tuyến tính vào cường độ xạ kích thích Io  Tăng độ nhạy tăng cường độ xạ kích thích (dùng đèn cơng suất lớn) tỷ số tín hiệu/nhiễu lớn,  Tín hiệu huỳnh quang khơng đo theo giá trị tuyệt đối mà biểu thị theo nghĩa huỳnh quang tương đối, nghĩa so sánh tín hiệu huỳnh quang chuẩn thử IF = F.Io.(e.C.l ) (3) LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG • Các chất vơ cơ, hydrocarbon no khơng hấp thu ánh sáng UV-VIS khơng có tính phát huỳnh quang, trừ số nguyên tố đất Lantanit • Các hydrocarbon thơm có hệ liên hợp - có khả phát huỳnh quang, hợp chất thơm đa vòng ngưng tụ phát huỳnh quang mạnh benzen (bước chuyển p*  p) • Các nhóm chức cho điện tử làm tăng hiệu suất huỳnh quang (OH, NH2 , alkyl, aryl…), nhóm chức hút điện tử làm giảm hiệu suất huỳnh quang ( halogen, NO2 , NH3+, COOH…) NH2 NH3 O O N Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu CHỈ SỐ KHÚC XA LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG  Các phân tử dị vòng đơn khơng phát huỳnh quang O S furan thiophen H N N pyrol pyridin  Hệ vòng ngưng tụ dị vòng có hệ số hấp thụ cao thời gian sống trạng thái kích thích ngắn so với dị vòng đơn nên khả phát huỳnh quang cao N N N H LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG  Các phân tử có cấu tạo cứng nhắc có khả phát huỳnh quang cao phân tử có khung cấu trúc quay tự quanh liên kết C-C Φbiphenyl = 0,2 Φfloren = biphenyl quinolin Indol > CH2 isoquinolin LIEÂN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG • Thay đổi hố học Adrenaline  adrenochrome Thiamin  thiochrome • Thay đổi dung mơi: • Thay đổi pH: Floren O O - O O O C COO- pH= 7, phenol, anisol phát quang COO- Florescen Phenolphtalein pH= 12, phenolat không phát quang OH OCH3 Phổ phát xạ 6-bromoacetyl-2dimethylaminonapthalen (lKT 380 nm) N O Zn - N N O OH 8-oxyquinolin phức Zn 8-oxyquinolin phenol anisol CHỈ SỐ KHÚC XA LIÊN QUAN CẤU TRÚC VÀ TÍNH PHÁT HUỲNH QUANG CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG • Quencher: chất làm tắt huỳnh quang Phản ứng chất phát huỳnh quang Quencher giải thích va chạm phân tử trạng thái kích thích Quencher Đây tính đặc hiệu hợp chất phát huỳnh quang ứng dụng định tính định lượng Sự phân cực Liên kết hydro Điện Phân tử phát huỳnh quang Quencher Áp suất Nhiệt độ CÁC YẾU TỐ KHÁC ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT HUỲNH QUANG Độ nhớt MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG • Nhiệt độ dung mơi Hiệu suất lượng tử phát huỳnh quang bị giảm nhiệt độ tăng (tần số va chạm tăng) làm cho khả khử hoạt thuận lợi Dung môi chứa kim loại nặng, làm giảm phát huỳnh quang phân tử (3) (1) (2) (4) (6) (5) • Oxy khơng hòa tan Oxy khơng hòa tan thường làm giảm cường độ phát huỳnh quang dung dịch Hiệu ứng oxi hóa cảm ứng quang hóa vật phát huỳnh quang tính thuận từ oxi phân tử (số proton số neutron chẵn) chuyển hóa phân tử bị kích thích sang trạng thái ba (triplet)  Nguồn sáng Có cường độ mạnh nguồn sáng quang phổ hấp thu UV Đèn hồ quang thủy ngân phát xạ vạch phổ 254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 773 nm (HQ kế) Đèn hồ quang xenon áp suất cao, phát xạ liên tục từ 300 – 1300 nm, công suất mạnh từ 75 – 450 W (QP HQ) CHỈ SỐ KHÚC XA MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG  Bộ tạo đơn sắc • Kính lọc hấp thụ kính lọc giao thoa huynh quang kế • Cách tử 1200 vạch/mm quang phổ huỳnh quang Có hai tạo đơn sắc dùng cho nguồn sáng kích thích dùng cho xạ huỳnh quang Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG  Detector • Đặt vng góc với tia kích thích nên có phần xạ huỳnh quang đến detector, • Detector có độ nhạy cao, thường dùng ống nhân quang điện (photomultiplier) hay detector dãy diode quang (Diode array) cho quang phổ huỳnh quang chiều  Cốc đo (cuvette) Hình trụ tròn (HQ kế) hay chữ nhật (QP HQ) thủy tinh hay silic oxit tinh khiết (thạch anh Vị trí cuvet máy đặt cho nằm đường tia kích thích Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu CHỈ SỐ KHÚC XA ỨNG DỤNG  Định tính : lKT = ? PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VƠ CƠ lBX = ?  Định lượng : so sánh cường độ phát quang tương đối mẫu chuẩn mẫu thử Cường độ phát quang tương đối thay đổi theo môi trường đo, nên môi trường đo phải thật ổn định (nhiệt đo ổn định, dung môi tinh khiết quang học, máy phải chuẩn hoá thường xuyên với chất chuẩn)  Phân tích huỳnh quang hợp chất vơ Dựa việc tạo phức chất chelat ion kim loại với thuốc thử hữu đo phát huỳnh quang chúng PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ Ag 2,3-napthotriazol Eosin + 1,10-phenanthrolin Acid 8-hydroxy-quinolin-5-sulfonic 0,02 0,004 0,01 Al Acid 3-hydroxy-napthoic 0,0002 Cu 2-amino-1-propen Thiamin 0,01 3,0 Fe Luminol + H2O2 0,0008 Hg Rhodamin B 0,002 Mg N,N’-bissalicyliden-2,3-diaminobenzofuran 0,002 Mn Zn 8-hydroxy-quinolin 0,002 g/ml  Một số kim loại chuyển tiếp có tính thuận từ (e- phân lớp d có spin song song) làm tăng tốc độ giao hệ sang trạng thái ba (triplet), dẫn đến phát lân quang  Thuốc thử đo huỳnh quang phần lớn có cấu tạo vòng thơm chứa hai nhiều nhóm chức cho electron để dễ tạo chelat với ion kim loại OH N OH OH HO O O ON N N OH SO3Na O 8-oxyquinolin Flavanol lizavin benzoin PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VƠ CƠ Xác định acid amin thơm pH = + phenylalanin (Phe) có lKT = 280 nm, lBX = 348 nm + tyrosin (Tyr) có lKT = 274 nm, lBX = 303 nm + triptophan (Trp) có lKT = 254 nm, lBX = 282 nm Chuyên luận USP XXIII + Định lượng vitamin B1 : chuyển thành thiochrome, đo huỳnh quang iso-BuOH với lKT = 365 nm, lBX = 450 nm CHỈ SỐ KHÚC XA PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VÔ CƠ CH2 N H3C N CH3 N S NH2 K3[Fe(CN)6] CH2CH2OH OH- CH2 N H3C N N CH3 N S CH2CH2OH Chuyên luận USP XXIII + Định lượng vitamin B2 : đo huỳnh quang CH3COOH 0,02 M với lKT = 440 nm, lBX = 530 nm PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VƠ CƠ  Xét nghiệm sinh hố + Định lượng phenothiazin nước tiểu, sau ly trích, đo huỳnh quang môi trường H2SO4 0,02 M với lKT = 310 nm, lBX = 460 nm + Định lượng salycylat máu, sau ly trích, đo huỳnh quang môi trường kiềm với lKT = 370 nm, lBX = 460 nm  Miễn dịch huỳnh quang + Acridine chất chẩn đoán tổ chức bị ung thư kính hiển vi huỳnh quang + Định lượng reserpin HNO3 cho phát quang vàng với lKT = 390 nm, lBX = 510 nm [Szalkowski Mader ] N acridin PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG • Định nghĩa + Phép đo quang phổ huỳnh quang đo cường độ phát quang tương đối (relative intensity) hợp chất kích thích nguồn ánh sáng vùng UV-VIS Nguồn sáng kích thích phát xạ có bước sóng tuân theo định luật Stock phương trình cường độ phát quang tương đối tuân theo phương trình: IF = F.Io.(e.C.l ) Trong phép đo quang phổ huỳnh quang ta thu nhận loại phổ : phổ kích thích phổ huỳnh quang PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG  Phổ kích thích + Đường biểu diễn phụ thuộc cường độ phát quang tương đối theo bước sóng nguồn sáng kích thích : IF = f(lKT) + Cố định bước sóng phát xạ (lBX) cách chọn lBX tạo đơn sắc nguồn phát xạ (phải có giá trị lớn cho lKT) ghi phổ thay đổi bước sóng kích thích + Bước sóng mà ta có IF lớn bước sóng kích thích tối ưu mẫu đo  Phổ phát xạ + Đường biểu diễn phụ thuộc cường độ phát quang tương đối theo bước sóng nguồn sáng phát xạ IF = f(lBX) CHỈ SỐ KHÚC XA PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG IF Phổ kích thích + Cố định bước sóng kích thích (lKT) cách chọn lKT tạo đơn sắc nguồn kích thích (thơng thường có giá trị vùng 220 – 380 nm, dựa vào giá trị lKT biết trước) ghi phổ thay đổi bước sóng phát xạ + Bước sóng mà ta có IF lớn bước sóng phát xạ tối đa mẫu đo Phổ phát xạ l Đường biểu diễn phụ thuộc cường độ phát quang tương đối theo bước sóng nguồn kích thích IF = f(lKT) = F.Io.(e.C.l ) PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG lKT = 369 nm Vit B1 oxy hoá lPX = 449 nm PHÉP ĐO QUANG PHỔ HUỲNH QUANG • Phổ huỳnh quang chiều: + xác định lKT lBX đồng thời lần đo mà khơng phải thăm dò lần đo + Phổ đường viền: + Phổ 3D 10 CHỈ SỐ KHÚC XA 254 Trái:ZnS, phải: Sr aluminate Trong tối Trong toái sau 4’ 365 Kunzite phát quang UV http://en.wikipedia.org/wiki/File:Phosphorescent.jpg#filelinks 11 ... BEER TRONG SỰ PHÁT HUỲNH QUANG  Hiệu suất lượng tử huỳnh quang F tỉ số số phân tử phát huỳnh quang tổng số phân tử bị kích thích: F = Số phân tử phát huỳnh quang / tổng số phân tử bị kích thích... Triệu MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG Nguồn: phương pháp phân tích Vật lý & Hoá lý - Nguyễn Đình Triệu MÁY QUANG PHỔ HUỲNH QUANG  Detector • Đặt vng góc với tia kích thích nên có phần xạ huỳnh quang đến... thường xuyên với chất chuẩn)  Phân tích huỳnh quang hợp chất vô Dựa việc tạo phức chất chelat ion kim loại với thuốc thử hữu đo phát huỳnh quang chúng PHÂN TÍCH HUỲNH QUANG CÁC HỢP CHẤT VƠ CƠ Ag