1 Chương Sự thu nhận sinh khối tế bào I Tiêu chuẩn chủng Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền Các nguyên liệu thích hợp carbohydrate (rỉ đường, dịch kiềm sulfid, cellulose, tinh bột, cặn sữa), cacbuahydro (parafin, methane, hoá chất từ dầu hoả methanol) Ngoài ra, lượng xạ mặt trời tảo sử dụng vào việc cố định CO tự dưỡng Vi sinh vật sử dụng nguồn carbon lượng với hiệu suất cao Carbohydrate chuyển tới 50%, cacbuahydro tới 100% thành chất khô tế bào Tốc độ sinh trưởng Vi sinh vật khác với sinh vật khác chỗ thời gian nhân đôi ngắn Ở vi khuẩn, thời gian khoảng 0,3 - giờ, nấm men tảo - Do vậy, với vi sinh vật sản xuất nhiều sinh khối đơn vị thời gian Đối với tính kinh tế phương pháp sinh khối tổng hợp đơn vị thời gian có ý nghĩa Hàm lượng protein cao Vi sinh vật đơn bào có hàm lượng protein khoảng 50 - 60% chất khô Hàm lượng có tính đặc hiệu lồi chịu ảnh hưởng nhiều điều kiện nuôi Cần tạo phương pháp nhằm trì thành phần khác tế bào, ví dụ chất dự trữ, mức thấp tốt để đạt hàm lượng protein tương đối cao Cần ý rằng, hàm lượng protein bao hàm protein “thật sự” không gồm thành phần nitơ phi protein xác định nitơ theo Kjeldahl, nucleic acid peptide thành tế bào vi khuẩn Chất lượng protein cao Hàm lượng amino acid không thay qui định chất lượng protein Tiêu chuẩn có tính đặc hiệu lồi mức độ định chịu ảnh hưởng điều kiện ni Nhiều amino acid có mặt protein vi sinh vật với hàm lượng cao giống sản phẩm thịt, sữa Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lysine Trái lại, hàm lượng amino acid chứa lưu huỳnh thấp Khả tiêu hoá cao protein Khả tiêu hoá protein vi sinh vật mặt bị hạn chế thành phần nitơ phi protein (ví dụ nucleic acid, peptide thành tế bào vi sinh vật), mặt khác “bao bọc” protein thành tế bào vi sinh vật, thành khó cho enzyme tiêu hoá qua Đối với protein tách khỏi tế bào khơng cần quan tâm đến vấn đề Tuy nhiên, để tách riêng protein vấn đề lại khả hoà tan thành tế bào Vì chất thành tế bào tiêu chuẩn cho việc lựa chọn vi sinh vật thích hợp An tồn độc tố Vi sinh vật gây bệnh thể chứa thành phần độc nghi ngờ sinh lý dinh dưỡng dạng khó tách riêng khơng dùng để sản xuất protein đơn bào Việc chứng minh thành phần không tồn dạng vết khó khăn đòi hỏi xét nghiệm kéo dài nhiều năm mặt độc tố sinh lí dinh dưỡng Vì protein đơn bào dùng dinh dưỡng động vật Thuận tiện kỹ thuật Vi sinh vật sử dụng cho sản xuất công nghiệp phải dễ tách dễ xử lý Các tế bào lớn nấm men tách ly tâm dễ nhiều so với tế bào vi khuẩn Chỉ vi sinh vật sinh trưởng tốt mật độ cao đạt suất cao Khả sinh trưởng tốt nhiệt độ cao thể ưa nhiệt chịu nhiệt làm giảm chi phí cho việc làm nguội Tính khơng mẫn cảm với nhiễm tạp tiền đề cho việc sản xuất protein không vô trùng II Mối quan hệ với sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng Tốc độ sinh trưởng có tính đặc hiệu lồi phụ thuộc vào điều kiện ni Nói chung vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng cao kích thước nhỏ tỷ lệ diện tích bề mặt với thể tích tế bào lớn Sự phối hợp trình trao đổi chất riêng rẽ điều khiển nhiều chế điều hồ có tính đặc hiệu lồi Ngồi ra, tốc độ sinh trưởng cực đại có chủng môi trường khác điều kiện nuôi thường không giống Chẳng hạn, Escherichia coli môi trường phức hợp canh thang có thời gian hệ 20 phút, mơi trường tổng hợp chứa glucose - 50 phút, chứa acetate - 80 phút Sự khác biệt định hệ enzyme cần cho sinh trưởng chất khác Trên mơi trường muối khống với glucose nguồn carbon lượng, tế bào sinh trưởng với tốc độ nhỏ so với môi trường phức hợp hữu Khi nuôi cấy môi trường acetate vi sinh vật phải tổng hợp enzyme trình tái tạo glucose Trong việc sử dụng chất chất khác bên trao đổi chất trung gian trung tâm chất thơng thường (ví dụ cacbuahydro) phản ứng enzyme phạm vi trao đổi chất ngoại vi có vai trò chủ chốt hạn chế tốc độ sinh trưởng Chẳng hạn hoạt hố acetate “phản ứng chốt” Để ni cấy vi sinh vật với tốc độ sinh trưởng cực đại tiền đề nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu (thành phần dịch dinh dưỡng, thơng khí, nhiệt độ) Trao đổi protein nucleic acid Khoảng 90% protein tế bào vi sinh vật protein enzyme, 10% lại protein cấu trúc màng thành tế bào Các protein có khả hoạt động có cấu trúc xác định trật tự amino acid quy định Do đó, tổng hợp protein, vấn đề không nối amino acid với nhờ liên kết peptide mà nối phải diễn theo trật tự xác định Thông tin trật tự amino acid protein chứa chất liệu di truyền tế bào, tức DNA, dạng trật tự bazơ nucleotide Để truyền thông tin di truyền từ nhân sang ribosome nơi tổng hợp protein, thông tin nhiều protein ghi lên RNA thông tin (RNAm) Sự phiên âm thực việc tổng hợp RNAm RNAm sợi chứa thông tin di truyền operon Đó thơng tin hay nhiều enzyme đơn vị enzyme, đơn vị tạo thành đơn vị chức Operon lactose Escherichia coli chứa thông tin ba enzyme Ở Salmonella typhimurium operon tham gia vào tổng hợp histidine chứa enzyme Trong trình phức tạp tổng hợp protein, trình gắn liền với phối hợp ba thành phần phản ứng có tính đặc hiệu, tức 20 amino acid khác nhau, aminoacyl - RNAt - synthetase phân tử RNAt, ngồi có nhận biết phản ứng codon anticodon tổng hợp protein phản ứng quy định tốc độ sinh trưởng cực đại Trong trình sinh trưởng gen biểu tế bào có chế điều hồ hoạt động cho enzyme cần thiết cho tế bào điều kiện nuôi định tổng hợp Cũng gen gen cấu trúc Tức gen chứa thông tin cho protein hay cho chuỗi polypeptide protein enzyme Nhiều gen có chức điều hồ Khoảng 1000 gen biểu tác dụng Tế bào chứa khoảng 1000 protein khác Có số loại protein mà tế bào chứa vài phân tử (ví dụ protein chất kiềm chế) tế bào lại chứa tới hàng nghìn enzyme đường trao đổi chất trung tâm Những enzyme xúc tác tổng hợp chất trao đổi mà tế bào chứa lượng nhỏ (ví dụ vitamin) tồn với khoảng trăm Sự đồng hoá nguồn carbon khác 3.1 Carbohydrate Những phụ phẩm phế phẩm sau công nghiệp dùng để sản xuất protein đơn bào: - Các sản phẩm chứa saccharose công nghiệp đường (rỉ đường củ cải rỉ đường mía, bã mía, cặn rỉ đường, nước rửa thơ) khác chứa nhiều đường - Nước thải xí nghiệp sữa chứa lactose - Dịch kiềm sulfid chứa pentose hexose dịch thuỷ phân gỗ cặn bã chúng - Việc sử dụng phần thực vật giàu tinh bột (khoai lang, sắn, khoai tây) cellulose (ví dụ rơm rạ) khơng qua thuỷ phân trước thành monosaccharide disaccharide chưa phổ biến sản xuất Để sử dụng chất giàu tinh bột người ta mô tả phương pháp nuôi hỗn hợp Endomycopsis fibuliger Candida utilis (phương pháp Symba) Các nguyên liệu chứa cellulose (rơm rạ xử lý NaOH) chuyền hố có kết thành protein qui mơ phòng thí nghiệm nhờ phối hợp Trichoderma viride với Candida utilis Saccharomyces cerevissiae 3.2 Hydrocarbua - Methane thành phần khí mỏ, tạo thành qua đường vi sinh vật nhờ lên men methane sinh bể chứa bùn mục nát thiết bị làm Việc đồng hoá methane nhờ vi khuẩn nghiên cứu mạnh mẽ nhằm mục tiêu sản xuất protein qui mô công nghiệp Sử dụng methane có số ưu điểm so với alkan mạch dài Chẳng hạn rửa tế bào cách tốn hexan dung môi khác cần thiết cho việc loại bỏ parafin sót lại Việc cung cấp tối ưu chất dạng khí cho tế bào ni chìm gặp nhiều khó khăn Việc cung cấp methane khó khăn nhu cầu ơxy để ơxy hố CH4 chất có tính khử mạnh tất nguồn carbon Vì người ta nghiên cứu sử dụng hỗn hợp ơxy - methane (có bổ sung CO2 N2) cần phải tránh tỉ lệ hỗn hợp gây nổ Do tính hồ tan O2 CH4 đưa dòng khí vào lần chất khơng sử dụng hồn tồn; việc tái tuần hồn dòng khí nâng cao mức độ sử dụng chất Có thể tránh vấn đề nêu lên thay methane methanol thu từ methane nhờ ơxy hố hố học Tuy nhiên methanol đắt nhiều so với methane khí mỏ Thu hoạch tế bào từ methanol thấp Nhưng methanol dễ tan nước nên dùng nồng độ cao (2 - 3%) - Alkan: Việc sản xuất protein vi sinh vật sở alkan thực nhờ nấm men thuộc giống Candida (ví dụ C utilis, C tropicalis, C guilliermondii) Vi khuẩn, đặc biệt đại diện giống Pseudomonas, Flavobacterium, Mycobacterium Nocardia có khả sử dụng alkan (C6 - C18) hydrocarbua khác, khả chưa sử dụng rộng rãi công nghiệp 3.3 Sự cố định CO2 tự dưỡng CO2 nguồn C tái sinh không ngừng vòng tuần hồn tự nhiên, sớm ý đặc biệt việc sản xuất protein đơn bào Hai q trình có ý nghĩa vi sinh vật học công nghiệp là: - Sự cố định CO2 quang hợp nhờ tảo - Sự cố định CO2 hoá tổng hợp với hydro nguồn lượng nhờ vi khuẩn hydro Sự ơxy hố hydro: lồi tập hợp tên chung vi khuẩn khí nổ có khả ơxy hố hydro dạng khí tạo lượng để thực q trình đồng hố CO2 theo đường Calvin Thuộc nhóm vi khuẩn có đại diện giống Hydrogenomonas, thuộc loại tự dưỡng khơng bắt buộc Một số lồi vi khuẩn khác Nocardia opaca có khả Trong việc ni tảo loại tảo lục đơn bào Chlorella Scenedesmus ý Sản lượng protein tảo đạt 10 - 15 tấn/năm, cao nhiều lần so với nông nghiệp Muốn đạt sản lượng cần có điều kiện khí hậu thuận lợi, ánh sáng mặt trời mạnh kéo dài để có đầy đủ lượng Ngồi ra, q trình ni tảo đòi hỏi thiết bị nuôi cấy đặc biệt Thông thường người ta dùng bể phẳng máng phẳng uốn khúc có hệ thống lật đảo nhằm hạn chế lắng tế bào đưa tế bào trở lại bề mặt chiếu sáng Việc cung cấp nồng độ CO tối ưu (4 - 5%) cần thiết Sự phát triển sản xuất protein đơn bào từ tảo đẩy mạnh nhờ việc dùng tảo lam Spirulina maxima Tảo sinh trưởng thành sợi tách phương pháp lọc Chúng cho sản lượng cao, protein có giá trị khơng đáng ngại mặt độc tố Về phương diện kinh tế việc ni tảo góp phần làm mơi trường thuỷ vực tránh tượng phú dưỡng III Chất lượng sản phẩm Chất lượng protein Chất lượng protein quy định trước hết hàm lượng tỷ lệ cân đối amino acid không thay protein tế bào Thông tin di truyền DNA quy định thành phần amino acid Tương ứng với sai khác thông tin di truyền thể ta thấy có khác thành phần amino acid nhóm thể riêng biệt lồi giống Vì vậy, việc tìm kiếm thể có hàm lượng đặc biệt cao amino acid không thay có triển vọng Cũng có khác biệt nhỏ thành phần amino acid culture chủng môi trường khác pha nuôi cấy khác Trong điều kiện khác diễn tạo thành hệ enzyme khác Thành phần amino acid protein enzyme riêng biệt khác Chẳng hạn pyrophosphatase nấm men bánh mì chứa 1,6% methionin, triosophosphatdehydrogenase chứa 2,8% Những khác biểu yếu tồn protein chúng san vô số protein enzyme khác Như vậy, khác biểu protein tương ứng chiếm tỷ lệ phần trăm lớn tổng số protein Nhờ đột biến tăng lượng enzyme lên khoảng 5% protein tổng số tế bào Những thể đột biến trì q trình ni liên tục tốc độ sinh trưởng khơng bị giảm so với chủng ban đầu Việc nghiên cứu di truyền vi khuẩn có khả đưa vào vật liệu thông tin di truyền protein đặc hiệu giàu amino acid khơng thay Tính ổn định tính thích hợp chủng lên men cơng nghiệp cần kiểm tra Sinh học phân tử di truyền học nêu điểm tựa nhằm tối ưu hoá chất lượng protein vi sinh vật phạm vi định Khi xem xét hàm lượng amino acid tế bào cần lưu ý, amino acid hồ tan chiếm khoảng 5% chất khơ tế bào Đối với chất lượng protein đơn bào vitamin có ý nghĩa; số chúng tồn phần protein cofactor enzyme Vitamin chiếm tỷ lệ định so với protein tế bào Hàm lượng vitamin ecgosterine Candida utilis chuyển thành vitamin D2 (calciferol) chiếu tia UV lên chúng Thông thường, hàm lượng ecgosterine nấm men chiếm khoảng 0,5 - 1% chất khô Hàm lượng protein Một tế bào vi khuẩn sinh trưởng nhanh điều kiện ni tối ưu có hàm lượng protein khoảng 50%, tế bào nấm men khoảng 40% Không thể nâng cao tỷ lệ này, phần lại vật chất tế bào cần thiết cho khả sống tế bào Trong số có RNA (10 20%), DNA (2%), thành phần thành tế bào (20% murein vi khuẩn, polysaccharide kitine nấm men nấm sợi), lipid màng tế bào (5 - 10%), viên gạch cấu trúc có phân tử lượng thấp chất trao đổi trao đổi chất trung gian (5 - 10%) Trên môi trường không cân đối hàm lượng chất dự trữ tăng lên mạnh, chúng chiếm tới 50% chất khơ Khi thừa carbohydrate thiếu nitơ việc tổng hợp mỡ nhờ vi sinh vật (sự tích luỹ mỡ nội bào) diễn Ở vi khuẩn, chất dự trữ thường gặp acid poly -  - hydroxybutyric, nấm men, nấm sợi tảo mỡ glycogen Sự tích luỹ chất dự trữ tránh được, phổ biến thơng qua q trình ni cấy Cũng đột biến mà khả tổng hợp chất dự trữ bị ngừng Hàm lượng thành phần tế bào cần cho sống nucleic acid, polymer thành tế bào, lipid màng giảm cách đáng kể mà không gây tổn hại làm hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho sinh trưởng Trong phạm vi định thành tế bào ngoại lệ Cho tới chưa rõ liệu thành phần độ dày thành tế bào chủng tồn tự nhiên có cần thiết chủng sản xuất hay khơng Có lẽ đột biến mà thành phần tế bào bị giảm không ảnh hưởng đến sinh trưởng Làm giảm độ dày thành tế bào thay đổi thành phần khơng có tác dụng dương tính đến phần protein, mà đến hấp thụ chất đến tính bị phân huỷ tế bào việc tách protein, đến độ tiêu hoá protein Hàm lượng nucleic acid Hàm lượng cao nucleic acid vật chất tế bào vi sinh vật làm hạ thấp phần protein mà bất lợi cho việc sử dụng vật chất tế bào vào dinh dưỡng người Khi tiêu hố nucleic acid nucleotide giải phóng, sau hấp thụ lại chúng bị phân huỷ qua adenine guanine tới acid uric Sự phân huỷ tiếp tục acid không xảy người khơng có uricase Nếu nồng độ nucleic acid thể cao gây chứng thấp khớp, ngồi có nguy tạo sỏi thận sỏi bàng quang độ hoà tan thấp acid Lượng nucleic acid hấp thụ qua dinh dưỡng không 2g ngày Trong dinh dưỡng động vật vấn đề quan trọng hơn, chúng có khả phân huỷ tiếp tục acid uric Hàm lượng nucleic acid sinh khối bị giảm nhờ biện pháp sau đây: - Giảm mạnh tốc độ sinh trưởng Mặc dù điều thực thông qua giai đoạn thứ hai nuôi liên tục không kinh tế - Chiết rút RNA, ví dụ dung dịch NaCl 10% nóng - Thuỷ phân RNA kiềm tách protein hoà tan kết tủa - Phân huỷ RNA enzyme nhờ nuclease đưa vào hay nuclease thân tế bào Các nucleotide sinh phân huỷ nucleic acid dùng chất thơm chất gây vị (IMP, GMP), chất ban đầu hoạt chất (ví dụ kinetine hợp chất sinh học) IV Giống khởi động Nấm men bánh mì 1.1 Vi sinh vật Nấm men sử dụng xí nghiệp sản xuất men bánh mì loại Saccharomyces cerevisiae Trong công nghiệp tuyển chọn chủng nấm men phải đảm bảo đặt tính sau: - Có khả nở bột tốt, làm khối bột nhào nhẹ xốp - Dễ hồ với nước - Có đặt tính sinh hố ổn định độ bền vững tốt (khó bị tự phân) - Bền nhiệt, kéo dài hoạt tính enzyme nhiệt độ cao - Có khả lên men nguồn đường glucose, fructose, maltose, saccharose - Khả sinh sản nhanh, cho suất cao trình lên men - Dễ tách sinh khối dễ bẻ gãy sau ép 1.2 Sinh hóa điều hồ - Kiềm chế dị hố glucose: sinh trưởng hiếu khí nấm men bánh mì, nồng độ 20 - 40 mg/l glucose mơi trường, hoạt tính enzyme hô hấp bị ức chế Nhờ ôxy hiệu ứng giảm nhẹ bị triệt tiêu Khi có mặt ơxy nồng độ glucose cao (30%) tạo cytochrome không bị ức chế hoàn toàn - Cạnh tranh ADP phosphate vơ cơ: q trình phosphoryl hố chất phosphoryl hố chuỗi hơ hấp cần đến ADP Pvc Do hai phản ứng có cạnh tranh ADP Pvc Khi giảm nồng độ ADP Pvc tế bào dẫn đến giảm tiêu thụ glucose ngược lại Sự điều hồ phosphofructokinase: enzyme S cerevisiae bị kìm hãm hiệu ATP, ITP, GTP, CTP chất cho P song khơng phải chất kìm hãm giống ATP, chúng khơng có vai trò điều hồ Trong tính đặc hiệu trung tâm xúc tác nhỏ trung tâm điều hồ tính đặc hiệu lại cao enzyme dị lập thể AMP chất hiệu ứng dương, triệt tiêu sự kìm hãm ATP Ở Escherichia coli, ADP có tác động chất hiệu ứng dương Phosphofructokinase bị kìm hãm citrate, ATP tăng cường kìm hãm Ở S cerevisiae có mối phụ thuộc hoạt tính enzyme với tỉ lệ ATP/AMP Khi tế bào nấm men sinh trưởng kị khí, bị loại ơxy mà phosphoryl hố qua chuỗi hơ hấp khơng thể xẩy quan sát thấy biến đổi tỉ lệ ATP/AMP phía tăng AMP Kết phản ứng phosphofructokinase thúc đẩy - Tác dụng nồng độ CO2 cao: nồng độ 40% CO2 có mặt khơng khí bắt đầu kìm hãm sinh trưởng nồng độ 50% kìm hãm biểu rõ rệt - Ảnh hưởng ôxy: tổng hợp cytochrome S cerevisiae phụ thuộc vào ôxy Ở nồng độ ơxy hồ tan 0,05 µM/l thấp cytochrome a, b, c không tổng hợp Tuy nhiên, nấm men bánh mì loại vi sinh vật tuỳ tiện có khả sinh trưởng điều kiện có khơng có ơxy Khi sinh trưởng điều kiện có ơxy, nấm men cần bổ sung biotin, nhu cầu inositol acid pantotenic thay đổi tuỳ chủng Ngoài nhu cầu này, sinh trưởng điều kiện kị khí nghiêm ngặt nấm men cần thêm thành phần khác acid béo chưa bão hồ, ergosterol số chủng cần acid nicotinic Thiếu thành phần môi trường sinh trưởng nấm men diễn sau vài hệ sau dừng hẵn Quan hệ nấm men ôxy phức tạp Ngồi “hiệu ứng Pasteur” có hiệu ứng “Pasteur ngược” (sự kiềm chế dị hoá) “hiệu ứng Pasteur âm” Nồng độ đường nhân tố qui định sinh trưởng tốc độ lên men nấm men Sinh trưởng S.cerevisiae môi trường chứa glucose có thơng khí xem sinh trưởng kép glucose - ethanol Glucose trước hết chuyển hoá thành ethanol pha sinh trưởng logarid thứ tế bào có tốc độ sinh trưởng cao Pha sinh trưởng thứ hai bắt đầu đường môi trường gần bị tiêu thụ hết Pha tách biệt với pha đầu thời gian pha lag rõ Tốc độ sinh trưởng tế bào pha thứ hai thấp pha lên men thể đường cong sinh trưởng có độ dốc Ngược lại, tốc độ sinh trưởng pha hô hấp phụ thuộc rõ rệt vào mức độ thơng khí Trong sản xuất cơng nghiệp men bánh mì người ta quan sát thấy độ dài hệ - rượu tạo thành nhiều môi trường khơng có rượu Trong ni cấy tĩnh, cường độ thơng khí gây hiệu nhỏ khơng gây hiệu lên giai đoạn lên men lên vị trí pha lag Trong pha sinh trưởng logarid đầu tiên, chu trình TCA hoạt động để tạo khung carbon cho mục đích sinh tổng hợp Hoạt tính enzyme thuộc chu trình ơxy hố thấp, hoạt tính tăng lên pha thứ hai sinh trưởng kép Nếu nồng độ glucose vượt mức độ định enzyme không tạo thành tạo thành mức độ thấp Có thể tránh tượng kiềm chế dị hố cách ni cấy nấm men theo phương thức nồng độ đường trì mức độ thấp hệ thống nuôi cấy liên tục Nấm men chứa enzyme hoạt động cho trao đổi chất ơxy hố chuyển trao đổi chất từ ơxy hố sang lên men nồng độ đường vượt giới hạn định Ngoài khả ức chế tạo thành enzyme ơxy hố (kiềm chế dị hố), glucose có khả kiềm chế hoạt tính enzyme 1.3 Kĩ thuật sản xuất * Cơ chất: Nấm men bánh mì phát triển tốt mơi trường có nguồn carbon glucose, fructose, maltose, saccharose, công nghiệp thường dùng rỉ đường mía rỉ đường củ cải để sản xuất Sự cung cấp oxygen có tính chất định đến kỹ thuật sản xuất dấm Trước q trình tiến hành phương pháp ni bề mặt nhờ lớp váng Acetobacter xylinum (phương pháp Orléans), vi khuẩn cố định vỏ bào gỗ giẻ Vỏ bào đựng thùng gỗ hình trụ (generator) thơng khí từ phía tưới dung dịch chứa rượu (ví dụ loại rượu vang phẩm chất) từ phía (hình 9.4) Ngày phương pháp chìm ngày có ý nghĩa Hiện người ta dùng nồi lên men đặc biệt (acetator) thơng khí mạnh dịch dinh dưỡng thay phần dịch dinh dưỡng bổ sung thơng khí đầy đủ Sau ethanol chuyển hoá thành acid acetic, phần lớn dịch dinh dưỡng nồi lấy thay vào dịch dinh dưỡng Nhờ đạt phương thức giống nuôi cấy liên tục Quá trình lên men tiến hành nhờ chủng chọn lọc Acetobacter suboxygendans dịch dinh dưỡng chứa glucose với 10-12% ethanol Ethanol gần chuyển toàn thành acid acetic Nồng độ acid acetic cao đạt 13% Quá trình diễn 28o 30 C kéo dài khoảng 48 Trong phương pháp cổ điển Orléans, lên men kéo dài tới tuần lễ Trong phương pháp đại với nồng độ rượu acid acetic cao 12%, ngừng thơng khí từ 10 đến 20 giây làm chết tới phần ba số vi khuẩn nồng độ chất thấp hơn, phụ thuộc vào oxygen không khắt khe tới Vi sinh vật oxygen hóa ethanol thành acid acetic thường gọi vi khuẩn acetic, vi khuẩn thực trao đổi chất pH môi trường thấp, điều phân biệt chúng với vi khuẩn khác Các vi khuẩn acid acetic bọn đa hình, tế bào từ hình elip tới hình que thẳng cong 0,5-0,8  0,9-4,2 m, đứng mình, thành cặp thành chuỗi có dạng khơng chuyển động dạng chuyển động với tiên mao cực vòng quanh thể Chúng bọn hiếu khí bắt buộc, số tạo thành sắc tố, số tạo thành cellulose Người tìm cách phân loại vi khuẩn acid acetic Hansen (1894) Ngày vi khuẩn acid acetic phân lập xếp vào hai chi chính, Acetobacter, Gluconobacter Các lồi Acetobacter (trên 60) chứa đặc điểm: có mặt catalase, oxygen hóa ethanol qua acid acetic tới CO2 H2O, oxygen hóa lactate thành cacbonate, oxygen hố glycerol thành DHP sản sinh acid gluconic từ glucose Các vi khuẩn chi Acetobacter thường chia thành bốn nhóm : oxygen hố mạnh, oxygen hố, oxygen hố trung bình oxygen hố yếu Hình 9.4: Thiết bị sản xuất dấm theo phương pháp cổ điển IV Sản xuất vitamin C ( acid L-ascocbic ) Đa số động vật tổng hợp toàn lượng vitamin C cần thiết cho nhu cầu vitamin tìm thấy mô chúng (chủ yếu gan thận với nồng độ 10-40 mg/100g) Tuy nhiên, người số động vật có xương sống trùng lại phụ thuộc hồn tồn vàọ nguồn vitamin C từ bên Chủ yếu rau (bắp cải, spinat, cà chua, 30-150 mg/100g) (cam, chanh, 40-50mg/100g).đã cung cấp cho người lượng vitamin C cần thiết (45-70 mg/ngày) Một số vi sinh vật (nấm, nấm men, tảo) sản sinh lượng nhỏ acid L-ascocbic cần cho trình trao đổi chất chúng Cho đến chưa tìm thấy acid ascorbic vi khuẩn, chúng khơng cần acid Ở động vật có vú (trừ bọn linh trưởng số khác) acid L1 ascorbic tổng hợp từ D-glucose C glucose trở thành C acid ascorbic ngược lại Sự tổng hợp diễn từ D-glucose tới acid D-glucuronic sau thành lacton acid L-gulonic Sự oxy hố sau gulonolacton vị trí C , xúc tác L-gulonolacton dehydrogenase, enzyme khơng tìm thấy người, theo sau enol hóa cho acid L-ascorbic (hình 9.5) thực vật, acid Lascorbic tạo thành từ D-glucose hay D-galactose qua số đường chuyển hóa Một đường giữ không làm cho trật tự chuỗi cacbon bị thay đổi, song sản phẩm trung gian đường sinh tổng hợp chưa biết rõ Có thể đường giống đường tổng hợp động vật Hình 9.5: Con đường sinh tổng hợp acid L-ascocbic Từ 50 năm nay, cơng nghiệp đáp ứng nhu cầu ngày tăng vitamin C người nhờ phương pháp bán tổng hợp từ glucose Nhiều trình hố học sinh hóa tham gia vào trình tất qua sản phẩm trung gian acid 2-keto-L- gulonic, từ thu acid L-ascorbic nhờ đtrờng hố học cách lacton hố đồng phân hố (hình 9.6) Acid-keto-Lgulonic Methyl-2keto-Lgulonate Acid L-ascobic Hình 9.6: Sự chuyển hố hố học acid 2-keto-L-gulonic thành acid Lascocbic Các quy trình chuẩn bị acid 2-keto-L-gulonic xếp thành hai nhóm: (1) nhóm bắt đầu khử D-glucose làm đảo ngược trật tự cacbon, (2) nhóm bắt đầu oxygen hóa D-glucose khơng có đảo ngược chuỗi cacbon 1.Các quy trình bắt dầu khử D-glucose Quy trình cơng nghiệp Reinstein Gruessner đề từ năm 1934 đến sử dụng Nó bao gồm bước phản ứng nhau, tất đạt sản lượng tới 90-95% (hình 9.7) Hình 9.7: Sự tổng hợp acid 2-keto-Lgulonic từ D-glucose qua Dsocbitol L-socboza Khử D-glucose thành D-sorbitol với có mặt niken Raney, sau loại tới mức tối đa niken hòa tan cách xử lý dung dịch sorbitol với nhựa cation Oxygen hóa D-sorbitol thành L-sorbose nhờ vi sinh vật : có nhiều chủng Acetobacter chịu nồng độ niken tới 10-20 mg/l, thực nhanh chóng phản ứng môi trường chứa nồng độ sorbitol o cao Quá trình lên men diễn 30 C môi trường chứa 200 g/l sorbitol, 10 g/l cao ngô, 0,5 g/l CaCO3 với chủng Acetobacter suboxygendans hoàn tất 24 cho khoảng 180g sorbose lit Sau lọc, loại ion cô đặc dịch nuôi, sorbose kết tinh (tới độ tinh khiết 99%) Tạo thành diacetone-sorbose để bảo vệ nhóm khơng tham gia vào giai đoạn sau Oxygen hóa hóa học diacetone-sorbose thành acid diacetone-2keto-L-gulonic Giải phóng acid diacetone-2-keto-L-gulonic nhờ thuỷ phân Giữa năm 1960 1975 nhiều sở nghiên cứu Mỹ Nhật tìm cách giảm số bước quy trình Reinstein cách oxygen hóa trực tiếp D-sorbitol hay L-sorbose nhờ kỹ thuật vi sinh vật thành acid 2-keto-L-gulonic sử dụng chủng Acetobacter Pseudomonas Tất nghiên cứu không cho kết khả quan, suất vượt g/l điều kiện tốt với sản lượng vào khọảng 10% so với sản phẩm ban đầu Vào năm 1981, nhà nghiên cứu Trung Quốc cho biết sản xuất 37 g/l acid 2-ketoL-gulonic từ 100 g sorbose sử dụng chủng Gluconobacter oxygendans Đây cải thiện đáng kể so với kết trước 2.Các quy trình bắt đầu oxygen hóa D-glucose Hai đường nghiên cứu : (1) gọi đương acid Liđonic bắt đầu oxygen hóa glucose vị trí cacbon số ; (2) đường acid 2,5-diketo-D-gluconic a) Con đường acid L-idonic Con đường gồm ba bước : (1) oxygen hố sinh hóa học D-glucose thành acid 5-keto-D-gluconic qua acid D-gluconic ; (2) khử hóa học (hoặc sinh hóa học) acid 5-keto-D-gluconic thành acid Lidonic ; (3) oxygen hóa sinh hóa học acid L-iđonic thành acid 2-keto-Lgulonic (hình 9.8) Phản ứng dễ dàng thực Acetobacter suboxygendans Chủng ATCC 621 chuyển hóa 100 g/l glucose 33 với sản lượng 90% Một số phương pháp đề nhằm khử acid 5-ketoD-gluconic Trong thực tế, có phương pháp hố học Grey đề xuất (1947) có giá tri Trong phương pháp này, khử đạt nhờ hiđro hố có xúc tác áp lực không may dẫn đến việc tạo thành hai đồng phân, acid L-idonic acid D-gluconic theo tỷ lệ tương đối mà điều kiện tốt 70 30% Hai phương pháp loại acid D-gluconic vừa tạo thành ý : (1) nhờ lên men với Acetobacter suboxygendans, bị oxygen hóa trở lại thành acid 5keto-o-gluconic, chất sau quay vòng, hay (2) hỗn hợp lên men với vi sinh vật (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Acetobacter melanogenus), bọn sử dụng acid D-gluconic để sinh trưởng phân giải hồn tồn lúc với việc chuyển hố acid L-idonic thành acid 2-keto-L-gulonic Bằng phương người ta thu kết tốt : 67 g/l acid 2-keto-L-gulonic tạo từ 100 g/l hỗn hợp chứa 70% acid L-idonic, song có vấn đề kỹ thuật chưa chấp nhận quy mô cơng nghiệp Hình 9.8 Sự chuyển hố D-glucose thành acid 2-keto-L-gulonic qua acid L-inonic b) Con đường acid 2,5-diketo-D-gluconic Con đường , chủ yếu nghiên cứu từ năm 1970, gồm hai bước sinh hoá học : (1) oxygen hóa D-glucose thành acid 2,5-diketo-Dgluconic qua acid D-gluconic acid 2-keto-D-gluconic ; (2) khử acid 2,5-diketo-D-gluconic thành acid 2-keto-L-gulonic (hình 9.9) Bước khơng gặp trở ngại nghiêm trọng Ngay từ năm 1974 nhà nghiên cứu Nhật Bản cho biết suất 220 g/l 2,5diketo-D-gluconat canxi đạt từ 200 g/l glucose sau ngày lên men nhờ Acetobacter fragi Vào năm 1982 nhà nghiên cứụ Shionogi sử dụng : (1) cho bước một, thể đột biến Erwinia có khả sản xuất 328 g/l 2,5-diketo-D-gluconat canxi 26 giờ; (2) bước hai, họ sử dụng chủng đột biến Corynebacterium tạo 106 g/l 2keto-L-gluconat canxi 66 D-Glucose Acid D-gluconic Acid 2-keto- Acid 2,5-diketo- Acid 2-ketoD-gluconic D-gluconic L-gluconic Hình 9.9: Sự chuyển hố D-glucose thành acid 2keto-L-gulonic qua acid 2,5diketo-D-gluconic Sau bước lên men đầu tiên, môi trường nuôi Erwinia khử trùng o cách xử lý với 0,25 g/l đođecylsulfate natri 28 C Sau làm lạnh, người ta bổ sung glucose (0,2 kg/kg acid 2,5-diketo-Dgluconic) dùng làm chất cho hiđro phản ứng khử, từ sinh acid 2-keto-L-gulonic Chất đươc đưa vào môi trường nuôi Corynebacterium vào cuối pha sinh trướng Sản lượng chuyển hóa tính theo phân tử gam 94% bước hai 92% so với 2,5-diketo-Dgluconat canxi sử dụng Xét toàn bộ, sản lượng phân tử gam acid 2keto-L-gulonic thu vào cuối bước lên men thứ hai so với lượng glucose sử dụng bước lên men thứ 86% Đây quy trình hiệu sản xuất acid 2-keto-Lgulonic kể từ quy trình Reinstein đời vào năm 1934 loại bỏ tất bước hóa học Số lượng bước giảm từ năm xuống hai Việc tách acid 2-keto-L-gulonic vào cuối bước lên men thứ hai đạt với sản lượng 90% cách xử lý dịch nuôi với carbonate natri cách cô đặc tới lúc 2-keto-L-gluconat natri kết tinh Đã có cơng bố kết qnả nghiên cứu nhằm thu nhận acid 2keto-L-gulonic từ glucose lần lên men Các chuyên gia hãng Genetech vào năm 1985 đạt điều nhờ việc nhân lên chủng Erwinia herbicola ATCC 1988, chủng thực tốt bước quy trình Shionogi, gen mã hóa cho việc tổng hợp acid 2,5 diketogluconic reductase tách từ Corynebacterium sp ATCC 31090 Gen biểu tốt tế bào chủ song quy trình lâu sử dụng cho sản xuất công nghiệp Nồng độ glucose cực đại thể tái tổ hợp chấp nhận mức tương đối thấp suất nghèo nàn (0,6 g/l acid 2-keto-L- gluconic tạo sau 57 môi trường chứa 20 g/l glucose) Vì sinh tổng hợp acid L-ascorbic động vật biết rõ, người ta hy vọng ngày đưa gen mã cho enzyme có liên quan vào vi sinh vật thích hợp để cuối thu nhận vitamin C trực tiếp từ glucose V Sản xuất destran Đa số polysaccharide ngoại bào từ vi sinh vật sản phẩm chuyển hóa nội bào chất thành sản phẩm trung gian, cuối thành polime Destran khác polysaccharide này, chất không thâm nhập vào tế bào vi sinh vật mà chuyển hóa bên ngồi tế bào thành -D-glucan phân nhánh, tức destran Chỉ có saccharose dùng làm chất cho phản ứng Như vậy, polysaccharide sản xuất cảc tế bào ngun vẹn mơi trường ni tạo từ chế phẩm phi tế bào chứa phức hệ enzyme destransaccharase (-1,6-glucan : D-fructose 2glucosyltransferase) Enzyme giải phóng fructose chuyển gốc glucose lên phân tử chất nhận liên kết với enzyme : (1,6--D-glucosyl)n + saccharose  (1,6--D-glucosyl)n+1 + fructose Năng lượng tự lên kết glucoside phân tử disaccaride nằm vào khoảng 23 kJ lượng tự liên kết glucoside bên destran thấp chút (12-17 kJ) Do phản ứng diễn theo chiều từ trái sang phải kèm với giảm lượng tự Trong trình polime hóa chuỗi destran dài liên kết chặt chẽ với enzyme, mức độ polime hoá tăng phân tử chất nhận (trong trường hợp đơn giản phân tử chất) giải phóng chuỗi polime khỏi enzyme Các thành viên thấp oligosaccharide khơng phải phân tử chất nhận có hiệu quả, lực enzyme tăng dần theo độ dài chuỗi Tuy nhiên, hạn chế độ khuếch tán tăng theo trọng lượng phân tử Bởi vậy, điều kiện thơng thường, destran có trọng lượng phân tử cao đtrợc tạo thành, đặc biệt nồng độ chất thấp Để sản xuất destran có trọng lượng phân tử trung bình, cần phải tiến hành thuỷ phân sản phẩm có trọng lượng phân tử cao (bằng acid enzyme) phải phân đoạn sản phẩm điều kiện kiểm sốt cẩn thận Trong đó, polime trọng lượng phân tử thấp đồng lấy dùng làm nguyên liệu ban đầu cho phản ứng khác để sản xuất destran có mức độ trùng hợp mong muốn Các nồng độ saccharose cao maltose dùng làm nguyên liệu ban đầu tạo nên điều kiện thuận lợi để tổng hợp destran mồi trọng lượng phân tử thấp đồng kiểu Destran sản xuất hàng loạt loài vi khuấn, Streptobacterium destranicum, Streptococcus mutans loài khác Streptococcus mutans giữ vai trò quan trọng bệnh sâu Sản phẩm phụ thuộc vào chủng lẫn vào điều kiện sử dnng cho sinh trưởng tổng hợp polime số chủng, destransaccharase nằm dạng hòa tan chủng khác, liên kết phần hay hoàn toàn với tế bào Sản xuất destran công nghiệp dùng Leuconostoc mesenteroides để tạo polime chứa khoảng 95% liên kết -1,6 (phần lại liên kết -1,3) trọng lượng phân tử 4-5  10 dalton Các destran sử dụng ngành dược để làm chất dãn máu (chất thay huyết tương) Tuy nhiên destran phải có trọng lượng phân tử thấp nằm phạm vi nhỏ (75000  25000) Các sản phẩm với trọng lượng phân tử thấp loại khỏi hệ tuần hồn q nhanh nên khơng có giá trị điều trị đầy đủ sản phẩm có trọng lượng phân tử cao lại tham gia vào ngưng kết máu Các dung dịch chứa 6% loại destran có giá trị độ nhớt tập tính keo-thẩm thấu giống với huyết tương người Vì destran khơng bị phân giải amylase thể người nên khả phá hoại gan thấp so với chất thay huyết tương khác Các destran mô thể hấp thụ tốt, sử dụng cho nhiều loại dược phẩm, chẳng hạn sắt điều trị bệnh thiếu máu Gần đây, người ta cho destran sử dụng để tạo nên lớp ưa nước bề mặt vết bỏng rộng hấp thụ chất tiết từ vết thương Trong việc sản xuất destran, việc trì cung cấp oxygen giữ vai trò quan trọng đặc biệt trình lên men dung dịch trở nên nhớt Hiện người ta chưa có khả tính tốn mối tương quan lượng khuấy trộn đưa vào tốc độ chuyển động oxygen dung dịch với tập tính phi Newton dịch lỏng nên đa số trường hợp người kỹ sư sinh học biết dựa vào kinh nghiệm thân Mơi trường lên men chứa muối vô cơ, 2% cao ngô saccharose Sắt mangan nguyên tố vết quan trọng Dung dịch khử trùng sức nóng, chuyển sang bể lên men cấy giống sau làm lạnh o Lên men tiến hành 25 C, trình này, chủ yếu tạo thành acid lactic, giá trị pH giảm từ 6,5-7,0 xuống 4,0 Dung dịch lên men khuấy liên tục thông khí Khi destran tạo thành, dung dịch trở nên đậm đặc trình kết thúc sau hay ngày, khối dạng keo tạo thành Dịch lên men chứa chủ yếu destran, fructose tự do, acid lactic, etanol vi sinh vật Destran sau kết tủa methanol Dịch chắt lại methanol thu hồi phương pháp cất Nếu lên men dẫn đến việc tạo thành destran có trọng lượng phân o tử cao chúng thuỷ phân acid chlohydric 100-105 C Sự hoàn tất thuỷ phân xác định độ nhớt Sau giai đoạn phản ứng định, phản ứng lúc đầu làm chậm lại cách làm lạnh sau dừng lại hồn tồn cách bổ sung hydroxygenate natri Dung dịch trộn với yếu tố hấp phụ lọc qua kizengua Cuối destran kết tủa phân đoạn với methanol, phân đoạn mong muốn tái hòa tan, lọc, đặc sấy phun Vì việc thuỷ phân acid khó kiểm sốt việc phân đoạn thường khơng thu phần có thành phần mong muốn, nên người ta tìm cách tổng hợp trực tiếp destran có trọng lượng phân tử thấp Để làm điều cần có kiến thức chắn động học phản ứng Trọng lượng phân tử bị ảnh hưởng : a) nồng độ saccharose, b) chất nhận glucose, c) nhiệt độ phản ứng Chẳng hạn vắng mặt chất nhận, dung dịch saccharose 10%, thu sản phẩm với trọng lượng phân tử lớn 108 dalton nồng độ 70% saccharose, phân tử destran chủ yếu có trọng lượng phân tử thấp tạo thành Nếu destran trọng lượng phân tử thấp đưa vào làm mồi enzyme có nhiều điểm khởi đầu polime tương đối đồng tạo thành Điều quan trọng tế bào vi khuẩn không chứa vết destran có trọng lượng phân tử cao Vì nguyên liệu cấy phải rửa vài lần dung dịch muối để loại destran bám vào Như hỗn hợp 2% (w/v) chất nhận có trọng lượng phân o tử thấp (1000-25000) với nồng độ đường 10% 15 C pH 5,0 cho sản phẩm mà 50% có trọng lượng phân tử phạm vi mong muốn 50000 100000 dalton Các destran sử dụng bệnh viện không bị phân giải thủy phân Theo tính tốn sản lượng destran vào năm 1980 Tây Âu 1000 tấn, giới 200.000 Trong hầu hết polysaccharide ngoại bào sử dụng dạng không bị biến đổi mặt hóa học destran dùng cho ngành dược nhiều mục đích khác lại chuyển hóa thành phân đoạn có trọng lượng phân tử tương đối thấp 40000 70000 dalton nhờ quy trình thuỷ phân thích hợp (thuỷ phân acid loãng) Thị trường chủ yếu dẫn xuất destran dạng chế phẩm liên kết chéo chứa cấu trúc khơng gian ba chiều mà nhóm chức gắn vào nhờ liên kết ete với gốc glucose phòng thí nghiệm sinh hóa học Để sản xuất loại gel cho mục đích sinh hóa, destran có trọng lượng phân tử tương đối cao dùng để tổng hợp sản phẩm có tính thu hồi nước cao Phản ứng với destran dung dịch kiềm dùng epichlorohydrin để thu nhận gel, gel sau nghiền trung hòa Vì phản ứng epichlorohydrin polysaccharide phản ứng tỏa nhiệt, cần ý để nhiệt tỏa loại bỏ khỏi hệ thống Điều đặc biệt quan trọng gel tạo thành phản ứng có tính dẫn nhiệt thấp Vì gốc đường khử tận phân tử destran có tính phản ứng capo dễ bị phân giải phản ứng polime nên chúng bị khử thành sorbitol borohydride dung dịch kiềm trước bổ sung epichlorohydrin Mặc dầu gel liên kết chéo thuộc loại sephađex thân chúng có ích việc phân đoạn nguyên liệu hoạt động mặt sinh học, song chuyển hóa chúng thành dẫn xuất ete làm tăng giá trị tiềm tàng chúng Các ete carboxymethyl hay dimethylaminoethyl sản phẩm kiểu Những hợp chất khác biệt nhiều với destran liên kết chéo tập tính trương chúng dịch lỏng Các sản phẩm có độ liên kết chéo khác cho chất hấp phụ có lỗ khác giới hạn phân đoạn khác Việc đưa nhóm hóa học khác vào phân tử cho chất hấp phụ mang đặc điểm ưa lipit Chúng dùng để phân đoạn lipit, v.v dùng dung mơi lỏng dung môi hữu phân cực Một số destran khác dùng làm chất mang quy trình ni cấy tế bào Dưới dạng (có tên thương mại hãng dược phẩm AB Thụy Điển đặt Sephađex), destran ứng dụng rộng rãi để tách khiết phân tử sinh học khác điện tích, kích thước phân tử v.v Protein khơng bị biến tính mạng lưới polime ưa nước hấp phụ không đặc hiệu thấp Câu hỏi ôn tập chương Dựa vào sơ đồ sau đây, nêu nguyên tắc chuyển hóa steroid: Nêu bước q trình sản xuất steroid hormone Phân biệt vi khuẩn acetic peroxydant suboxydant Nêu khác biệt phương pháp sản xuất dấm (Orleans, Spring, phương pháp chìm) Nêu ứng dụng nguyên tắc hóa học tạo thành destran Một điều phức tạp chủ yếu gặp hóa tổng hợp cortisone Đây bước định để tạo nên Trong vi sinh vật học công nghiệp, dùng vi sinh vật sau để thực bước phản ứng này: 7.Destran sản xuất công nghiệp nhờ .Trong môi trường chứa saccharose, vi khuẩn tiết enzyme .có chức ... NADH2 để chuyển rượu thành etylic theo phản ứng (2) : C6H12O6 CH3CHO + NADH2 CH3CH2OH + NAD + Phương trình tổng quát lên men rượu bình thường sau: C6H12O6 + 2H3PO4+2ADP = 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP... tới tay người tiêu dùng * Vi sinh vật tạp nhiễm: Sự xuất vi sinh vật sinh acid vi khuẩn lactic (đa số trường hợp vi khuẩn lactic dị hình), vi khuẩn acetic đặt biệt vi khuẩn butiric thường có... - Cấy vi sinh vật mong muốn - Tách sinh khối tế bào vi sinh vật khỏi môi trường tiêu dùng - Hậu xử lý sinh khối tinh khiết không Trong đó, trước hết cần lưu ý vấn đề sau: * Tuyển chọn vi sinh