Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ .3 I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các vùng lúa nhiễm mặn Việt Nam .5 1.2 Chỉ thị phân tử SSR ứng dụng nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn 1.2.1 Chỉ thị phân tử SSR 1.2.2 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn 1.2.2.1 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn giới .7 1.2.2.2 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu .9 2.2 Phương pháp nghiên cứu .11 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số đo độ tinh 11 2.2.2 Sử dụng thị SSR liên kết chặt với QTL chịu mặn Saltol để xác định có mặt gen chịu mặn giống lúa nghiên cứu .12 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số .15 3.2 Hệ số PIC, số allele tổng số băng ADN thể cặp mồi 15 3.3 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) tỷ lệ dị hợp tử (H) giống lúa chịu mặn nghiên cứu 17 3.4 Xác định allele xuất tập đoàn lúa chịu mặn nghiên cứu 19 3.5 Kết phân tích mối quan hệ di truyền giống lúa Chịu mặn nghiên cứu 20 IV KẾT LUẬN .24 TÀI LIỆU THAM KHẢO .25 ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa gạo lương thực quan trọng người Trên giới lúa xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mì diện tích sản lượng Ở Châu Á, lúa gạo coi lương thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu tổng số 148,4 triệu trồng lúa toàn giới Trong tương lai, xu sử dụng lúa gạo tăng loại lương thực dễ bảo quản, dễ chế biến cho lượng cao Theo tính tốn Peng cộng (1999), đến năm 2030 sản lượng lúa giới phải đạt 800 triệu đáp ứng nhu cầu lương thực người [14] Trong tình trạng nguồn lương thực khan giá lương thực tăng nay, giới phải đối mặt với nguy thiếu lương thực Theo nghiên cứu trường Đại học Stanford, đến năm 2030 sản lượng lương thực châu Á giảm 10% hơn, đặc biệt sản phẩm lúa gạo Năng suất sản lượng lúa bị đe doạ thiên tai, sâu bệnh yếu tố mơi trường Trong đó, yếu tố đáng ý tượng đất nhiễm mặn Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 diện tích đất trồng tồn giới Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng nhiều xâm thực biển Theo thống kê, năm 2000 606.792 [5] Theo báo cáo Cục trồng trọt, Đồng sông Cửu Long, xâm ngập mặn ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 lúa đông xuân năm 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích tồn vùng, tỉnh ven biển Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang Bến Tre Trong đó, diện tích có nguy bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa tỉnh [4] Đặc biệt, điều kiện khí hậu tồn cầu thay đổi, tượng băng tan hai cực, nước biển dâng lên đe dọa vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn yếu tố gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, ảnh hưởng xa mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực giới khó hồn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại nhiễm mặn đến suất lúa gạo vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Để đáp ứng yêu cầu này, việc chọn tạo ta giống trồng chịu mặn cần thiết Vì vậy, chúng tơi tiến hành chuyên đề “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đồn lúa có khả chịu mặn Việt Nam thị SSR” Kết nghiên cứu cung cấp sở liệu vật liệu cho nghiên cứu khoa học trồng chống chịu mặn, đồng thời, góp phần vào cơng tác chọn tạo giống lúa có khả chịu mặn, phẩm chất gạo tốt, suất cao, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm mặn cấu sản xuất lúa vùng nhiễm mặn Việt Nam, giúp người nông dân trồng lúa vùng nhiễm mặn tăng thêm thu nhập, giảm đói nghèo I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các vùng lúa nhiễm mặn Việt Nam Ở Việt Nam, tác động biển, vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu hai vùng châu thổ lớn Đồng Sông Hồng Đồng sông Cửu Long Ảnh hưởng nước biển vùng cửa sông đất liền Đồng Sông Hồng khoảng 15 km, vùng Đồng sông Cửu Long lại xâm nhập tới 40 - 50 km Nhóm đất mặn có diện tích khoảng triệu ha, vào nồng độ muối hoà tan với tỷ lệ Clo (Cl) đó, Hội Khoa học Đất Việt Nam chia đất mặn theo bảng sau Bảng 1.1 Phân loại đất mặn Độ mặn Rất mặn Mặn nhiều Mặn trung bình Mặn Tỷ lệ muối hòa tan (%)  1,0 0,5 - 1,0 0,25  0,25 Nồng độ Cl (%)  0,25 0,15 - 0,25 0,05 - 0,15  0,05 1.2 Chỉ thị phân tử SSR ứng dụng nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn 1.2.1 Chỉ thị phân tử SSR Simple sequence repeat (SSR) thị phân tử quan trọng SSR marker sử dụng rộng rãi dấu chuẩn phân tử ADN, lập đồ, MAS, nghiên cứu đá dạng di truyền di truyền quần thể SSR hay microsatelites (các vi vệ tinh) có tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphisms), STRs (short tADNom repeats) trình tự ADN lặp tồn hệ gen sinh vật, có chiều dài khác nhau, phân bố cách ngẫu nhiên Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng khơng vượt nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có từ 1-6 nucleotit) [16] Ví dụ trình tự lặp (AT)n, (CT)n, (ATT)n (n số lần lặp lại có biến thiên alen) Số lần lặp lại đơn vị từ 10 đến 100 lần lúa người ta phát kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu đặc trưng Bởi trình tự đặc trưng hai đầu đoạn nhắc lại sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR Do có khác chiều dài đoạn nhắc lại mà kỹ thuật phù hợp nghiên cứu đa hình, lập đồ phân lập gen Cũng giống kỹ thuật RADP, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn Mặt khác, SSR thị đồng trội nên sử dụng để phát cá thể dị hợp tử, lập đồ gen sử dụng quần thể F2 [3] 1.2.2 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa kiểu hình khó có tương tác gen Nhờ thị phân tử mà công việc xác định gen chống chịu mặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động xác Xác định gen kháng thị phân tử nghĩa sử dụng thị phân tử liên kết chặt với gen kháng QTLs để chọn cá thể mang gen kháng quần thể phân li Độ xác phương pháp lớn 99,75% gen kháng kẹp hai thị liên kết với gen kháng khoảng cách di truyền từ thị phân tử đến gen kháng nhỏ 5cM Bằng cách chọn lọc này, tổ hợp gen kháng khác chọn lọc dựa kiểu gen thay dựa kiểu hình [18] Về loại thị ứng dụng để lập đồ di truyền nghiên cứu đa dạng di truyền phân lập gen, xác định gen,… Tuy nhiên, loại thị có ưu nhược điểm riêng tuỳ vào mục đích, yêu cầu điều kiện cụ thể nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng thị cho thích hợp Trong số thị phân tử SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, xác, độ đa hình cao kinh tế Sự phát triển marker phân tử đồ gen lúa năm gần ứng dụng vào mục đích xác định QTL điều khiển tính chống chịu mặn cây, diện nhiễm sắc thể khác Các nghiên cứu Gregorio (1997) Niones (2004) lập đồ gen chi tiết cho QTL “Saltol” diện nhiễm sắc thể số 1, định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn lúa [6, 11] Hình 1.1 Đoạn gen Saltol nhiễm sắc thể số lúa, vị trí xác định SSR marker [11] 1.2.2.1 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn giới Mohammadi - Nejad ctv (2008) thí nghiệm 33 SSR marker đa hình đoạn Saltol nhiễm sắc thể số nhằm xác định mức độ liên kết hữu dụng marker chọn giống chống chịu mặn Các SSR marker dùng để thử nghiệm 36 giống lúa phân loại thành nhóm: chống chịu, chống chịu, chịu mặn trung bình, nhiễm mặn nhiễm mặn qua lọc mặn nhân tạo Trong số 33 marker có marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 RM140 liên kết chặt với đoạn Saltol vị trí 10,8 - 12,28 Mb Đoạn Saltol nằm vị trí có chứa marker RM8094, RM3412, RM493 Các giống lúa IR70023, IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo IR66946-3R-178-1-1 (FL478) có sản phẩm PCR giống sản phẩm PCR Pokkali nhân marker RM8094 cho tính chống chịu tốt tốt mặn Do đó, marker RM8094 thể liên kết thuận chặt chẽ với tính kháng mặn giai đoạn mạ Mohammadi - Nejad ctv (2008) khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 RM10745 xác định kiểu gen lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL Saltol chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn [10] 1.2.2.2 Ứng dụng thị SSR xác định gen chống chịu mặn Việt Nam Lang ctv (2001) sử dụng 74 thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR quần thể RIL F8 tổ hợp lai Tenasai 2/CB lập đồ QTL số tính trạng mục tiêu liên quan đến tượng chống chịu mặn lúa (Hình 1.2) [1] Bùi Chí Bửu ctv (2000) sử dụng 30 SSR marker để lập đồ gen cho tính chống chịu mặn quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng Các tác giả xác định 10 SSR marker cho thể đa hình sản phẩm PCR cá thể phân ly bố mẹ Tuy nhiên có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách 6,3 cM nhiễm sắc thể số RM223 nhân đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [1] Nguyễn Thị Lang ctv (2001) báo cáo marker OSR1 RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn lúa, định vị nhiễm sắc thể số [1] Hình 1.2: Bản đồ QTL tính trạng mục tiêu liên quan đến tượng chống chịu mặn quần thể F8 (RIL) tổ hợp lai Tenasai 2/CB II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Vật liệu nghiên cứu 38 giống lúa Chịu mặn thu thập nhiều địa phương khác nhau, lưu giữ bảo tồn Ngân hàng gen hạt Trung tâm Tài nguyên Thực vật (bảng 2.1) Bảng 2.1: Danh sách 38 giống lúa thu thập dùng nghiên cứu TT Kí hiệu Tên giống Vùng trồng TT Kí hiệu Tên giống Vùng trồng M1 Chiêm đá 20 M20 OM 9921 Vĩnh Long 21 M21 Nàng quất điểm Tiền Giang 22 M22 Nàng neo Long An 23 M23 Ngoi tía Nam Định 24 M24 Nếp cúc Ninh Bình Lúa đỏ Quảng Ninh Quảng Nam Đà Nẵng Quảng Nam Đà Nẵng Quảng Nam Đà Nẵng Thừa Thiên Huế Quảng Bình M2 Lúa mặn M3 Nếp mặn M4 Nước mặn M5 Háu trắng M6 25 M25 OM 5981 Vĩnh Long M7 Lúa ven Quảng Bình 26 M26 Tép Hành Vĩnh Long M8 Tẻ chăm Quảng Bình 27 M27 Lúa sỏi Trà Vinh M9 Quảng trắng Quảng Trị 28 M28 Nàng Co Đỏ Bạc Liêu 10 M10 Nếp trứng Quảng Trị 29 M29 Ba túc Trà Vinh 11 M11 Chiêm đỏ Quảng Trị 30 M30 Một Bụi Đỏ Bạc Liêu 12 M12 Chiêm mặn Quảng Trị 31 M31 Thần Nông Đuôi Bạc Liêu 13 M13 Lúa nước mặn Quảng Ngãi 32 M32 Một bụi vàng Bạc Liêu 14 M14 Nếp Quảng Ngãi Bình Định 33 M33 Móng chim rơi Bạc Liêu 15 M15 Lúa ngoi Quảng Ninh 34 M34 Ba bụi sớm Bạc Liêu 16 M16 Lúa dừa Trà Vinh 35 M35 Đốc phụng Bạc Liêu 17 M17 Lùm cần 36 M36 OM 5464 Vĩnh Long 18 M18 Trắng chùm 37 M37 OM5166 Vĩnh Long 19 M19 OM 9915 Trà Vinh TP Hồ Chí Minh Vĩnh Long 38 M38 OM 4059 Vĩnh Long Sử dụng 30 cặp mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền giống lúa chịu mặn thuộc locus RM chọn lọc từ 2240 cặp mồi, hãng Invitrogen cung cấp dựa vào thơng tin trình tự, kích thước, số allele chuẩn locus, vị trí phân bố locus 12 NST khác Bảng 2.2: Thông tin cặp mồi nghiên cứu TT Tên mồi RM302 RM323 RM341 RM318 RM138 RM174 RM156 RM143 RM135 10 RM142 11 RM13 12 RM153 13 RM161 14 RM30 15 RM345 16 RM340 17 RM172 Trình tự mồi 3’-TCATGTCATCTACCATCACAC-5’ 5’-ATGGAGAAGATGGAATACTTGC-3’ 3’-CAACGAGCAAATCAGGTCAG-5’ 5’-GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG-3’ 3’-CAAGAAACCTCAATCCGAGC-5’ 5’-CTCCTCCCGATCCCAATC-3’ 3’-GTACGGAAAACATGGTAGGAAG-5’ 5’-TCGAGGGAAGGATCTGGTC-3’ 3’-AGCGCAACAACCAATCCATCCG-5’ 5’-AAGAAGCTGCCTTTGACGCTATGG 3’-AGCGACGCCAAGACAAGTCGGG-5’ 5’-TCCACGTCGATCGACACGACGG-3’ 3’-GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC-5’ 5’-TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG-3’ 3’-GTCCCGAACCCTAGCCCGAGGG-5’ 5’-AGAGGCCCTCCACATGGCGACC-3’ 3’-CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG-5’ 5’-TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCTC-3’ 3’-CTCGCTATCGCCATCGCCATCG-5’ 5’-TCGAGCCATCGCTGGATGGAGG-3’ 3’-TCCAACATGGCAAGAGAGAG-5’ 5’-GGTGGCATTCGATTCCAG-3’ 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ 5’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-3’ 3’-TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC-5’ 5’-TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG-3’ 3’-GGTTAGGCATCGTCACGG-5’ 5’-TCACCTCACCACACGACACG-3’ 3’-ATTGGTAGCTCAATGCAAGC-5’ 5’-GTGCAACAACCCCACATG-3’ 3’-GGTAAATGGACAATCCTATGGC-5’ 5’-GACAAATATAAGGGCAGTGTGC-3’ 3’-TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG-5’ 5’-CAACCACGACACCGCCGTGTTG-3’ NST Kích thước (bp) 120-191 241-244 126-186 134-154 104-155 207-222 150-160 195-207 119-131 235-238 124-154 196-234 165-189 171-183 152-167 118-191 159-165 18 RM264 19 RM284 20 RM337 21 RM245 22 RM257 23 RM171 24 RM239 25 RM224 26 RM286 27 RM17 28 RM270 29 RM277 30 RM309 3’-GTTGCGTCCTACTGCTACTTC-5’ 5’-GATCCGTGTCGATGATTAGC-3’ 3’-ATCTCTGATACTCCATCCATCC-5’ 5’-CCTGTACGTTGATCCGAAGC-3’ 3’-GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG-5’ 5’-CGATAGATAGCTAGATGTGGCC-3’ 3’-ATGCCGCCAGTGAATAGC-5’ 5’-CTGAGAATCCAATTATCTGGGG-3’ 3’-CAGTTCCGAGCAAGAGTACTC-5’ 5’-GGATCGGACGTGGCATATG-3’ 3’-AACGCGAGGACACGTACTTAC-5’ 5’-ACGAGATACGTACGCCTTTG-3’ 3’-TACAAAATGCTGGGTACCCC-5’ 5’-ACATATGGGACCCACCTGTC-3’ 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ 5’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3’ 3’-GGCTTCATCTTTGGCGAC-5’ 5’-CCGGATTCACGAGATAAACTC-3’ 3’-TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC-5’ 5’-GGTGATCCTTTCCCATTTCA-3’ 3’-GGCCGTTGGTTCTAAAATC-5’ 5’-TGCGCAGTATCATCGGCGAG-3’ 3’-CGGTCAAATCATCACCTGAC-5’ 5’-CAAGGCTTGCAAGGGAAG-3’ 3’-GTAGATCACGCACCTTTCTGG-5’ 5’-AGAAGGCCTCCGGTGAAG-3’ 148-178 141-149 154-194 136-146 120-170 10 310-356 10 100-150 11 120-152 11 99-128 12 160-171 12 104-117 12 117-126 12 158-180 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số đo độ tinh 2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số Mẫu giống thu thập riêng rẽ tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB Obara Kako (1998) có cải tiến [12] Quy trình tách chiết sau: Nghiền 1,5 - g tươi nitơ lỏng thành dạng bột mịn chày cối sứ Chuyển bột sang ống falcon 15ml, sau bổ sung ml đệm chiết CTAB (đã làm nóng đến 650C) Đảo ủ mẫu 650C thời gian 60 phút, 10 phút đảo lần 10 Mỗi phản ứng PCR bao gồm thành phần trình bày bảng 2.3 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Nước cất hai lần khử ion Đệm PCR 10X MgCl2 25mM dNTPs 10mM Taq DNA polymerase 5U/µl Mồi xi 10µM Mồi ngược 10µM DNA Tổng thể tích phản ứng Thể tích (µl) 6.2 1.5 1.2 0.3 0.3 1.5 1.5 2.5 15.0 Sau ống eppendof có đủ thành phần, hàm lượng chất cần thiết, tiến hành xếp ống vào máy đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt máy PCR đặt sau: Bảng 2.4: Các bước phản ứng máy PCR Các bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ I 94 5’ II 94 1’ 35 56 45’ 72 1’ IV 72 7’ V 30’ Bảo quản mẫu 40C 2.2.2.2 Kiểm tra kết gel Polyacrylamide Sản phẩm thu từ phản ứng PCR kiểm tra gel polyacrylamide 12%, môi trường đệm TAE 1X, sử dụng ladder 50 bp làm chuẩn Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR tiến hành cụ thể sau: - Chuẩn bị gel polyacrylamide: Bảng 2.5: Thành phần gel polyacrylamide 12 Acrylamide 6% 14ml APS 10% 800 μl TEMED 52μl Nước đề icon 70ml Chuẩn bị khay gel lược (tất phải vệ sinh trước tiến hành ghép hay đổ gel) - Điện di sản phẩm: Khi gel đông lại (sau khoảng 30 - 60 phút), rút lược ra, vệ sinh gel TAE1X, cho khay chứa gel vào máy điện di có sẵn dung dịch đệm TAE 1X Lấy 3µl mẫu (chứa sản phẩm trình PCR), trộn với 3µl dung dịch loading 1,5X tra vào giếng Để đo kích thước băng chúng tơi sử dụng ladder 50bp làm chuẩn Sau đó, đặt máy điện di chế độ 250V thời gian phút, tiếp theo, đặt nguồn điện 70V thời gian 20 phút - Nhuộm gel ghi nhận kết quả: Sau điện di, tiến hành nhuộm gel dung dịch ethidium bromide (0,5 ng/ml) 30 phút Soi chụp ảnh băng sản phẩm điện di máy soi UV hãng UVP, dựa vào xác định sản phẩm PCR thu 13 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số Trong nghiên cứu này, chọn phương pháp CTAB Obara Kako (1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ giống lúa nghiên cứu Nguyên lý phương pháp sử dụng chất tẩy cetyl-trimethyl-amonium-bromid (CTAB), chất có khả hòa tan chất giải phóng từ màng tế bào sau màng chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan nhiều so với chất khác Vì vậy, CTAB đóng vai trò chất tách chiết axit nucleic [12] Sau tách chiết thu ADN, tiến hành kiểm tra chất lượng ADN (dùng 3µl µl nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ ADN) phương pháp điện di gel agarose 1%, thời gian 30 phút, sau nhuộm ethidium bromide Sử dụng máy chuyên dụng (Molercular imager FX) để xác định nồng độ Ảnh điện di (hình 3.1) cho thấy băng gọn sắc nét, ADN khơng bị đứt gẫy, có độ tinh cao, đủ tiêu chuẩn dùng cho phản ứng PCR Hình 3.1: AND tổng số 38 giống lúa nghiên cứu 3.2 Hệ số PIC, số allele tổng số băng ADN thể cặp mồi Phân tích 30 cặp mồi SSR tập đồn 38 giống lúa chịu mặn thu tổng số 1128 băng ADN thuộc 156 loại allele khác Cả 30 cặp mồi cho locus đa hình, có cặp mồi thu allele, cặp mồi thu allele, cặp mồi 14 thu allele, cặp mồi thu allele, cặp mồi thu allele, cặp mồi thu allele, cặp mồi thu allele cặp mồi thu allele (bảng 3.1) Bảng 3.1: Số allele thể hệ số PIC 30 cặp mồi SSR TT Tên cặp mồi 10 11 12 13 14 15 16 RM302 RM 323 RM 341 RM 318 RM138 RM174 RM156 RM143 RM135 RM142 RM13 RM153 RM161 RM30 RM345 RM 340 Vị trí gắn mồi 1 2 2 3 5 6 Số allele thể PIC 7 5 4 0.744 0.604 0.805 0.697 0.704 0.669 0.606 0.478 0.737 0.353 0.784 0.471 0.827 0.751 0.145 0.767 Vị trí Số allele gắn thể mồi RM172 RM264 8 RM284 RM 337 8 RM245 RM257 RM171 10 RM239 10 RM224 11 RM286 11 RM17 12 RM270 12 RM277 12 RM309 12 Tổng 156 Trung bình 5.2 Tên TT cặp mồi 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 PIC 0.793 0.786 0.411 0.842 0.711 0.839 0.765 0.636 0.467 0.787 0.822 0.440 0.675 0.719 19.835 0.661 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) coi thước đo tính đa hình allele locus SSR Số liệu bảng 3.1 cho thấy: Tập đoàn lúa chịu mặn địa Việt Nam đa dạng thành phần allele locus gen nghiên cứu Hệ số PIC 30 cặp mồi thay đổi từ 0,145 (ở cặp mồi xuất loại allele - RM345) đến 0,842 (ở cặp mồi xuất loại allele - RM337) Hệ số PIC trung bình 30 cặp mồi nghiên cứu cao 0,661 Kết tương tự với số kết nghiên cứu tập đoàn lúa địa phương Việt Nam giới Kết sử dụng 12 cặp mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền giống lúa Ấn Độ, Raj (2006) hệ số PIC dao động từ đến 0,830 [15] Tác giả Jayamani (2007) đánh giá đa dạng di truyền 179 giống lúa 19 địa phương Bồ Đào Nha thị SSR hệ số PIC dao động từ 0,179 đến 0,894 [7] McCouch (2005), nghiên cứu đa dạng di truyền 52 giống lúa thơm Basmati 17 giống lúa khác Ấn Độ 30 15 thị SSR cho thấy số allele phát dao động từ đến 22 hệ số PIC dao động từ 0,2 đến 0,9 [9] Khuất Hữu Trung Nguyễn Thị Phương Đoài (2010), đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa Tám lúa Nương địa Việt Nam, hệ số PIC giống lúa Tám dao động từ đến 0,65 tập đoàn lúa Nương hệ số PIC dao động từ đến 0,808 [2] Hình 3.2: Ảnh điện di sản phẩm PCR giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM341 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low) 3.3 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) tỷ lệ dị hợp tử (H) giống lúa chịu mặn nghiên cứu Tỷ lệ dị hợp tử (H) tỷ lệ số liệu khuyết (M) giống lúa Chịu mặn nghiên cứu dựa kết phân tích với 30 cặp mồi SSR trình bày bảng 3.2 16 Bảng 3.2: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) tỷ lệ dị hợp tử (H) giống lúa Chịu mặn nghiên cứu T T 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ký hiệu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 Tên giống Chiêm đá Lúa mặn Nếp mặn Nước mặn Háu trắng Lúa đỏ Lúa ven Tẻ chăm Quảng trắng Nếp trứng Chiêm đỏ Chiêm mặn Lúa nước mặn Nếp Quảng Ngãi Lúa ngoi Lúa dừa Lùm cần Trắng chùm OM 9915 OM 9921 M H (%) (%) 3.33 3.45 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 3.33 0.00 0.00 3.33 0.00 3.33 0.00 0.00 0.00 0.00 6.67 0.00 0.00 3.33 3.33 6.90 0.00 6.67 0.00 3.33 0.00 0.00 3.33 3.45 0.00 3.33 0.00 10.0 0.00 0.00 3.33 0.00 TT 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Ký hiệu M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 M33 M34 M35 M36 M37 M38 Tên giống M H (%) (%) Nàng quất điểm 0.00 0.00 Nàng neo 0.00 3.33 Ngoi tía 0.00 0.00 Nếp cúc 0.00 0.00 OM 5981 0.00 3.33 Tép hành 0.00 0.00 Lúa sỏi 3.33 0.00 Nàng co đỏ 0.00 0.00 Ba túc 3.33 0.00 Một bụi đỏ 0.00 0.00 Thần nông đuôi 3.33 0.00 Một bụi vàng 0.00 0.00 Móng chim rơi 0.00 0.00 Ba bụi sớm 0.00 0.00 Đốc phụng 0.00 0.00 OM 5464 0.00 3.33 OM5166 3.33 0.00 OM 4059 3.33 0.00 Tổng 39.97 57.11 Trung bình 1.05 1.50 Số liệu bảng 3.2 cho thấy: Tỷ lệ khuyết số liệu (M) giống Nếp trứng cao (khuyết số liệu tổng số 30 cặp mồi nghiên cứu  6,67%) Có 10 giống lúa khuyết số liệu cặp mồi ương ứng với tỷ lệ 3,33% (Chiêm đá, Háu trắng, Chiêm mặn, Lúa dừa, OM 9921, Lúa sỏi, Ba túc, Thần nơng đi, OM5166, OM 4059) Còn lại 27 giống lúa không bị khuyết số liệu Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình 38 giống 1,05; khơng có giống có tỉ lệ khuyết số liệu lớn 15% Như vậy, 38 giống nghiên cứu có ý nghĩa phân tích thống kê Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao giống lúa Trắng chùm 10%, tiếp đến giống Chiêm mặn (6,90%), Lúa nước mặn (6,67%) Hai giống Chiêm đá Lúa bơng dừa có tỷ lệ dị hợp 3,45% Tám giống có tỷ lệ dị hợp 3,33% Còn lại 26 giống có tỉ lệ dị hợp tử 0% (đồng hợp 30 locus nghiên cứu) Tỉ lệ dị hợp tử trung bình tập đồn 1,50 Kết thu nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu 17 Olufowote (1997) Tác giả sử dụng thị phân tử SSR RFLP để nghiên cứu đa dạng di truyền giống lúa địa phương giống lúa cải tiến kết luận giống lúa địa phương thường có mức độ dị hợp tử cao giống lúa cải tiến [13] 3.4 Xác định allele xuất tập đoàn lúa chịu mặn nghiên cứu Thông thường, allele (rare allele) định nghĩa dựa tần số xuất chúng: Tác giả Kimura định nghĩa allele allele có tần số xuất nhỏ q với giá trị nhỏ xác định q (như q = 0,01) Đối với số lượng mẫu lên đến 100 allele xem xuất không hai lần số lần xuất allele không 200 lần lượng mẫu đạt tới 10.000 (Kimura, 1983) [8] Còn theo tác giả Zahida, allele allele xuất với tần số ≤ 0,05 tổng số mẫu nghiên cứu [17] Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM340 (M: GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low) Kết thu từ tiêu điện di sản phẩm PCR 30 cặp mồi SSR với tập đoàn 38 giống lúa chịu mặn thu tổng số 156 loại allele, xuất 13 allele 10 cặp mồi (allele xuất ở mẫu giống có tần số