BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG MẪU DỊ TAQMAN ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI RÚT GÂY RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2008 – 2012 Sinh viên thực hiện: PHAN CHÂU HUY Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG MẪU DÒ TAQMAN ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI RÚT GÂY RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS TRẦN THỊ DÂN PHAN CHÂU HUY KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ em, người yêu thương, quan tâm, động viên tạo điều kiện cho học tập Gia đình ln bên chỗ dựa vững Em xin cảm ơn Thầy Cô trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ sinh học tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu năm học trường tạo cho em nguồn động lực nghiên cứu khoa học Lòng biết ơn chân thành sâu sắc xin gửi đến PGS.TS Trần Thị Dân KS Võ Khánh Hưng, người dành hết nhiệt tâm trách nhiệm để hướng dẫn, dạy em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể cán quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học môi trường, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập Xin gửi lời cảm ơn đến: Anh Nguyễn Phan Thành, anh Huỳnh Đăng Sang tận tình giúp đỡ dẫn em suốt thời gian em thực đề tài Anh Hải, anh Hùng, chị Dung, chị Oanh; phòng xét nghiệm chuẩn đốn Chi Cục Thú Y tỉnh Bình Dương; chị Toan; Khoa Chăn Nuôi Thú Y, đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh; giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực đề tài Các bạn em nhóm nghiên cứu động viên, chia sẻ vượt qua khó khăn làm việc chung Các bạn lớp DH08SH, Đại học quy khóa 2008-2012 quan tâm động viên thời gian học tập thực đề tài Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Phan Châu Huy i TÓM TẮT Trong năm gần đây, bùng phát bệnh rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) hầu hết vùng Việt Nam, gây thiệt hại lớn kinh tế, chứng minh liên quan đến dòng PRRSV Bắc Mỹ gây sốt cao chủng Trung Quốc, gọi tắt H-PRRSV (highly fever PRRSV) Do vậy, việc xây dựng quy trình định tính định lượng PRRSV dòng Trung Quốc cần thiết cho cơng tác phòng chống bệnh vi rút PRRS gây Real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao định tính định lượng tác nhân gây bệnh vi rút Vì yêu cầu trên, đề tài “Xây dựng quy trình real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman để phát định lượng vi rút gây rối loạn sinh sản hô hấp chủng Trung Quốc heo” thực Phản ứng real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman dựa đường chuẩn DNA plasmid pGEM T-Easy gắn vùng gen NSP2 xây dựng Kết đường chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR sử dụng plasmid DNA gắn vùng gen NSP2 PRRSV chuyển vào tế bào chủ E coli DH5α Cặp mồi TQ1s, TQ1as mẫu dò Taqman sử dụng quy trình real time RTPCR cho phép định chủng định lượng H-PRRSV Độ nhạy quy trình real time RT-PCR 102 sao/µl Tính đặc hiệu phản ứng khẳng định với PRRSV chủng Châu Âu, PRRSV chủng Bắc Mỹ, PCV2 (porcine circovirus 2), lở mồm long móng (FMD - foot and mouth disease) Phân tích đường chuẩn H-PRRSV với nồng độ từ 108 đến 100 sao/µl chứng minh độ lặp lại cao với hệ số tương quan R2 = 0,998, hiệu phản ứng real time RT-PCR (E%) đạt 102,6%, độ nghiêng -3,261 hệ số biến động (CV) khoảng 0,10667 - 2,79905% ii SUMMARY Outbreaks of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) in most of regions of Vietnam, causing huge economic losses, in recent years, was demonstrated in relation to the highly fever Chinese-type of North American PRRSV (called HPRRSV) Therefore, establishing the procedure for detecting and quantifying HPRRSV is necessary Real time RT-PCR using Taqman probe is the sensitive and specific method to detect and quantify the viral pathogen For all these reasons, the thesis: “Establishment of real time RT-PCR protocol using Taqman Probe to detect and quantify reproductive and respiratory syndrome virus of Chinese type” was performed The real time RT-PCR using Taqman Probe assay was performed based on the standard curve of DNA pGEM T-Easy vector harboring NSP2gene region The standard curve for the Taqman Probe real time RT-PCR assay was linked the NSP2 gene fragment of H-PRRSV and cloned in E coli DH5α A pair of primers TQ1s, TQ1as and Taqman probe used in the real time RT-PCR assay could quantify and distinguish the genotypes of H-PRRSV The sensibility of the assay was 102 copies/µl The speciality of the assay was confirmed by using PRRSV EU type, PRRSV NA type, PCV2 (porcine circovirus 2) and FMD virus (foot and mouth disease) Analysis with 108–100 copy/µl of H-PRRSV standard demonstrated high reproducibility with correlation coefficient R2 = 0,998, high efficiency of real time RTPCR – E (102,6%), slope value -3,261 and coefficient of variation (CV) of 0,10667 2,79905% iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2 Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2.1 Cơ chế sinh bệnh 2.2.2 Cấu trúc vi rút PRRS 2.2.2.1 Tổ chức gen vi rút PRRS 2.2.2.2 Protein không cấu trúc NSP2 2.2.3 Các chủng PRRSV phân bố chúng 2.2.3 Sự khác biệt trình tự dòng PRRSV Châu Âu Bắc Mỹ 10 2.2.4 Biến chủng PRRSV Trung Quốc gây sốt cao 11 2.3 Kỹ thuật real time RT-PCR chẩn đoán PRRSV 13 2.3.1 Kỹ thuật real time PCR 13 2.3.2 Các chất phát huỳnh quang sử dụng real time PCR 14 2.3.2.1 SYBR Green 14 2.3.2.2 Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) 14 2.3.3 Nguyên lý hoạt động real time sử dụng mẫu dò Taqman 15 2.3.3.1 Cơ chế khuếch đại real time PCR sử dụng mẫu dò Taqman 15 2.3.3.2 Phân tích liệu real time PCR 15 2.4 Một số nghiên cứu nước PRRSV 18 2.4.1 Các nghiên cứu giới 18 2.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 19 iv Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 3.1 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu hóa chất 20 3.2.1 Vật liệu 20 3.2.2 Hóa chất 20 3.3 Phương pháp tiến hành 21 3.3.1 Thu nhận mẫu 21 3.3.2 Ly trích RNA 21 3.3.2.1 Ly trích RNA từ vacxin 21 3.3.2.2 Ly trích RNA từ phổi 22 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR Taqman 22 3.3.3.1 Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen NSP2 23 3.3.3.2 Kiểm tra plasmid điện di, PCR giải trình tự 25 3.3.4 Phản ứng real time RT-PCR Taqman định chủng định lượng H-PRRSV 26 3.3.4.1 Khả khuếch đại đoạn mồi TQ1s TQ1as mẫu dò Taqman 26 3.3.4.2 Phản ứng real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman 27 3.3.5 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu độ lặp lại phản ứng real time 27 3.3.5.1 Độ nhạy phản ứng real time RT-PCR Taqman 27 3.3.5.3 Độ đặc hiệu phản ứng real time RT-PCR Taqman 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real time RT-PCR Taqman 29 4.1.1 Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen NSP2 29 4.1.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn gen NSP2 điện di 31 4.1.3 Kiểm tra plasmid phản ứng PCR 31 4.1.4 Kiểm tra đoạn gen đích chèn vào plasmid giải trình tự 32 4.2.2 Phản ứng real time RT-PCR mẫu dò Taqman 34 4.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn phương pháp real time PCR 34 4.2.2.2 Giới hạn phát độ lặp lại phương pháp real time PCR 35 4.2.3 Tính đặc hiệu phản ứng real time RT-PCR 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT aa Amino acid bp Base pair cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EAV Equine arteritis virus EU European FMD Foot and mouth disease GP Glycoprotein H-PRRSV Highly fever PRRSV LMLM Lở mồm long móng NA North American NSP Nonstructural protein nt Nucleotide OD Optical density ORF Open reading frame PCV2 Porcine circovirus virus type PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction SD Standard deviation sgmRNAs Subgenomic mRNAs SHFV Simian hemorrhagic fever virus TBE Tris borate EDTA UTR Untranlated region vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sản phẩm dịch mã ORFs Bảng 2.2 Tỉ lệ tương đồng trình tự gen chủng PRRSV Bảng 2.3 Các cặp reporter quencher thường sử dụng 15 Bảng 3.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn NSP2 23 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn NSP2 24 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 25 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 3.6 Cặp mồi probe cho phản ứng real time PCR 26 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng kit OneStep RT-PCR (QIAGEN) 27 Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng kit OneStep RT-PCR (QIAGEN) 27 Bảng 4.1 Giá trị chu kỳ ngưỡng mức pha loãng từ 100 đến 108 35 Bảng 4.2 Hệ số biến động giá trị Ct 37 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Đại thực bào trước sau nhiễm PRRSV Hình 2.2 Cấu trúc gen vi rút PRRS Hình 2.3 Biểu đồ giả định protein NSP2 PRRSV Hình 2.4 Xây dựng chủng VR-2332 có NSP2 đột biến Hình 2.5 Cây phân bố di truyền số chủng PRRSV dòng Châu Âu Bắc Mỹ 10 Hình 2.6 Trình tự gene vùng NSP2 PRRSV Việt Nam 13 Hình 2.7 Cấu tạo mẫu dò Taqman 14 Hình 2.8 Cơ chế phát quang Taqman phản ứng real time PCR 16 Hình 2.9 Biểu đồ khuếch đại dựa hiệu số tín hiệu huỳnh quang 17 Hình 2.10 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng 17 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tạo DNA tái tổ hợp dùng xây dựng đường chuẩn 23 Hình 3.2 Trình tự gen NSP2 24 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm RT-PCR vùng NSP2 với mồi F-NSP2 R-NSP2 29 Hình 4.2 Kết blast vùng giải trình tự NCBI 30 Hình 4.3 Kết kiểm tra plasmid DNA PCR 31 Hình 4.4 Kết kiểm tra plasmid DNA PCR 32 Hình 4.5 Kết giải trình tự xi (A) ngược (B) DNA plasmid 32 Hình 4.6 Kết blast vùng giải trình tự NCBI 33 Hình 4.7 Phản ứng RT-PCR với cặp mồi TQ1s TQ1as nồng độ khác đường chuẩn mẫu dương tính H-PRRSV 34 Hình 4.8 Biểu đồ khuếch đại mức pha loãng từ 100 đến 108 35 Hình 4.9 Biểu đồ đường chuẩn mẫu pha loãng từ 100 đến 108 36 Hình 4.10 Biểu đồ độ lặp lại mẫu chuẩn 36 Hình 4.11 Biểu đồ kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng real time RT-PCR sử dụng cặp mồi TQ1s TQ1as mẫu dò Taqman 38 viii Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Cặp mồi (TQ1s, TQ1as) mẫu dò Taqman thiết kế cho phản ứng real time RTPCR đặc hiệu với chủng PRRSV Trung Quốc, vùng NSP2 Trình tự đầu dò xác định vùng cho thấy khác biệt PRRSV chủng Trung Quốc với dòng Bắc Mỹ dòng Châu Âu Vì vậy, với cặp mồi đầu dò Taqman này, phản ứng real time RT-PCR xây dựng đặc hiệu với PRRSV chủng Trung Quốc Tính đặc hiệu quy trình khẳng định với mẫu âm tính PRRSV, mẫu dương tính với PRRSV dòng NA, PRRSV dòng EU, PCV2 vi rút FMD Độ nhạy phản ứng xác định 102 sao/µl Giá trị hệ số góc hệ số tương quan tuyến tính đường chuẩn định lượng cho thấy hiệu cao phản ứng Phương pháp real time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman xây dựng cho thấy khả ứng dụng thực tế việc định chủng định lượng PRRSV chủng Trung Quốc mẫu bệnh phẩm 5.2 Đề nghị Phát triển chứng nội nhằm đảm bảo điều kiện tối ưu phản ứng Kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng với bệnh khác heo như: dịch tả heo… So sánh độ nhạy quy trình xây dựng với quy trình chuẩn khác RT-PCR, RT-LAMP phương pháp real time khác Nghiên cứu xây dựng phản ứng multiplex real time RT-PCR với mẫu dò Taqman để phân biệt chủng PRRSV 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cục Chăn Nuôi 2008 Báo cáo sản xuất chăn nuôi vùng Đông Nam Bộ Cục Thú Y 2011 Thông tin tình hình dịch bệnh gia súc gia cầm Feng Y, Zhao T, Nguyễn Tùng, Inui K., Ma Y, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Văn Cảm, Liu D, Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, Wang C, Tian K, Gao GF 2009 Các biến chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Việt Nam Trung Quốc năm 2007 Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú Y 16: 5-9 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái niệm - Phương pháp Ứng dụng) Tái lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh Đặng Thùy Dương 2009 Chẩn đốn phân biệt virus chủng vacxin nhược độc hoang dại gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh hoc, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Lê Thị Thu Hà 2010 Định lượng giải trình tự virus PRRSV đàn heo giống tỉnh Đồng Nai Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân, Nguyễn Ngọc Tuân 2007 Chẩn đoán vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT-PCR Tạp chí KHKT tập XIV, Số 5: 5-12 Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú Y Nhà xuất Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Kim Văn Phúc, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Trần Thanh Quân, Bùi Anh Thy Morrissy Chris 2007 Điều tra lưu hành virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) heo số tỉnh Nam Bộ Báo cáo kết NCKH 2007, Bộ Nông Nghiệp PTNT 10 Nguyễn Văn Thanh 2007 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) Hội thảo PRRS Khoa Thú Y, ĐH Nơng Nghiệp I, trang 35-43 11 Phòng Dịch Tễ-Cục Thú Y 2007 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 12 Trung tâm chuẩn đoán Thú Y Trung Ương 2008 Kết nghiên cứu vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp 13 Phạm Hùng Vân 2009 PCR real time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học 14 Trần Thị Bích Liên 2008 Bệnh tai xanh heo NXB Nông nghiệp, Tp.HCM 15 Trần Thị Bích Liên Trần Thị Dân 2007 Xác định tỷ lệ nhiễm chủng vi-rút PRRS số sở chăn nuôi heo miền Đông Nam Bộ Tạp chí KHKT Thú y tập XIV - số 6: 5-9 16 Võ Khánh Hưng 2009 Phân tích trình tự gen ORF5 ORF7 virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 17 Phan Thị Anh Văn 2010 Phân tích trình tự vùng mã hóa protein NSP2 vi rút PRRS genotype Bắc Mỹ xác định Tp Hồ Chí Minh Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 18 Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng (2010a) Phân tích di truyền số chủng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV) Tp.Hồ Chí Minh Đồng Nai Kỷ yếu hội nghị khoa học trẻ lần 7/2010, 75 – 80 40 19 Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng (2010b) Phân tích di truyền số chủng virut gây hội chứng PRRS heo số tỉnh miền Nam dựa ORF7 Tạp chí KHKT Thú y tập 17 – số 1, 25 – 33 20 Nguyễn Văn Chí 2011 Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen nhằm định lượng định chủng vi rút gây bệnh rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 21 Lê Thị Thơm 2011 Xây dựng quy trình định tính định lượng vi rút gây bệnh rối loạn sinh sản hô hấp chủng Bắc Mỹ heo (PRRSV) kỹ thuật realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 22 Võ Tấn Lực 2011 Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR sử dụng EvaGreen định tính định lượng porcine circovirus type (PCV2) Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 23 Allende R., Lewis T.L., Lu Z., Rock D.L., Kutish G.F., Ali A., Doster A.R., Osorio F.A., 1999 North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions J Gene.Virol 80: 307-315 24 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B and Rogan D (2000) Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659–688 25 Suarez P., Zardoya R., Martin M.J., Prieto C., Dopazo J., Solana A and Castro J.M (1996) Phylogenetic relationships of european strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes Virus Research 42: 159–165 26 Amonsin A., Kedkovid R., Puranaveja S., Wongyanin P., Suradhat S., and Thanawongnuwech R 2009 Comparative analysis of complete nucleotidee sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates in Thailand (US and EU geneotypes) Virology Journal 6: 143 27 An T., Zhou Y., Liu G., Tian Z., Li L., Qiu H., Tong G 2007 Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006: Coexistence of two NA-subgeneotypes with great diversity Vet Microbiology 123: 43–52 28 Balka G.y., Hornyákb Á., Bálintc Á., Benyeda Z., Rusvai M 2009 Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 158 : 41–45 29 Benfield D.A, Zimmerman J., Murtaugh M.P., Osorio F., Stevenson G.W., Torremorell M 2006 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Porcine Arterivirus) In Diseases of swine, 9th edition (B.E Straw., J.J Zimmerman., S D’Allaire , D.J Taylor.,) Blackwell Publishing: 387 - 417 30 Bustin SA 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 25: 169-193 41 31 Casal JI, Rodriguez MJ, Sarraseca J, Garcia J, Plana-Duran J, Sanz A 1998 Identification of a common antigenic site in the nucleocapsid protein of European and North American isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Adv Exp Med Biol 440: 469-77 32 Chen J., Liu T., Zhu C.G., Jin Y.F., Zhang Y.Z 2006 Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based on ORF5 Sequence Biochem Genet 44: 421–431 33 Christoph Egli, Barbara Thu, Luzia Liu, Martin A Hofmann 2001 Quantitative TaqMan® RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 98: 63–75 34 Chung W.B., Chan W.H., Chaung H.C., Lien Y, Wu C.C and Huang Y.L 2005 real-time PCR for quantitation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type in naturally-infected and challenged pigs J.Virol Methods 124: 11-19 35 Conzelmann KK, Visser N, Van Woensel P, Thiel HJ 1993 Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group Virology 193: 329-39 36 Egli, C., Thur, B., Liu, L., Hofmann, M.A 2001 Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Journal of Virological Methods 98: 63–75 37 Feng Y., Zhao T., Tung Nguyen, Innui K., Ma Y., Hoa Nguyen, Cam Nguyen, Liu D., Anh Bui, Thanh To, Wang C., Tian K, Gao G F 2008 porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007 Emer Infect Diseases 14 (11): 1774-1776 38 Gao Z.Q., Guo X., Yang H.C 2004 Geneomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Arch Virol 149: 1341–1351 39 Gyula Balka, Ákos Hornyák, Ádám Bálint, Zsófia Benyeda, Miklós Rusvai 2009 Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Journal of Virological Methods 158 (2009): 41–45 40 Hughes, G.J., Smith, J.S., Hanlon, C.A., Rupprecht, C.E 2004 Evaluation of a TaqMan PCR assay to detect rabies virus RNA: influence of sequence variation and application to quantification of viral loads Journal of Clinical Microbiology 42: 299–306 41 Kathleen A McIntosh, Anju Tumber, John C.S Harding, Steven Krakowka, John A Ellis, Janed E Hill 2008 Development and validation of a SYBR Green real time PCR for the quantification of porcine circovirus type in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues Veterinary Microbiology 133: 23-33 42 Kleiboeker S.B., Schommer S.K., Lee S.M., Watkins S., Chittick W., and Polson D 2005 Simultaneous detection of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus using real-time quantitative reverse transcriptase-PCR J Vet Diagn Invest 17: 165–170 43 Lee C, Yoo D 2005 Cysteine residues of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus small envelope protein are non-essential for virus infectivity Journal of General Virology 86: 3091-6 42 44 Lurchachaiwong W., Payungporn S., Srisatidnaraku U., Mungkundar C., Theamboonlers A., Poovorawan Y 2008 Rapid detection and strain identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RTPCR Journal compilation The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 46: 55- 60 45 Madsen, K G., Hansen, C M., Madsen, E S., Strandbygaard, B., Botner, A and Sorensen, K J 1998 Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds Archives of Virology 143: 1683–1700 46 Mardassi H, Gonin P, Gagnon CA, Massie B, Dea S 1998 A subset of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP3 glycoprotein is released into the culture medium of cells as a non-virion-associated and membrane-free (soluble) form J Virol 72: 6298-306 47 Martínez E., Riera P., Sitja M., Fang Y., Oliveira S., Maldonado J 2008 Simultaneous detection and geneotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green Research in Veterinary Science 85: 184–193 48 Meng XJ, Paul PS, Morozov I, and Halbur PG (1996b) A nested set of six or seven subgenomic mRNAs is formed in cells infected with different isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus J Gen Virol 77: 1265– 1270 49 Meulenberg JJ, de Meijer EJ, Moormann RJ 1993 Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence J Gen Virol 74 (Pt 8): 1697-701 50 Murtaugh MP, Elam MR, Kakach LT 1995 Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus Arch Virol 140: 1451-1460 51 Nelson EA, Christopher-Hennings J, Benfield DA 1995 Structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Adv Exp Med Biol 380: 321–323 52 Nelson EA, Christopher-Hennings J, Drew T, Wensvoort G, Collins JE, et al 1993 Differentiation of U.S and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal Clinical Microbiol 31: 3184–3189 53 Nieuwstadt, A P., Meulenberg, J J M., van Essen-Zanbergen, A., Petersen-den Besten, A., Bende, R J., Moormann, R J M & Wensvoort, G 1996 Proteins encoded by open reading frames and of the genome of Lelystad virus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion Journal of Virology 70: 4767– 4772 54 Papin, J.F., Vahrson, W., Dittmer, D.P 2004 SYBR Green-based real time quantitative PCR assay for detection of West Nile Virus circumvents falsenegative results due to strain variability Journal of Clinical Microbiology 42: 1511–1518 55 Rowland RRR, Schneider P, Fang Y, Wootton S, Yoo D, Benfield DA 2003 Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus Virology 316: 135-145 43 56 Snijder EJ, Meulenberg JJ (1998) The molecular biology of arteriviruses J Gen Virol 79: 961-979 57 Xiaofang Hao, Zengjun Lu, Wendong Kuang, Pu Sun, Yu Fu, Lei Wu, Qing Zhao, Huifang Bao, Yuanfang Fu, Yimei Cao, Pinghua Li, Xingwen Bai, Dong Li and Zaixin Liu 2011 Polymorphic genetic characterization of the ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in China Virology Journal, 8:73 58 Snijder EJ, van Tol H, Pedersen KW, Raamsman MJ, de Vries AA 1999 Identification of a novel structural protein of arteriviruses J Virol 73: 6335-6345 59 Spagnuolo-Weaver M., Walker I.W., McNeilly F., Calvert V., Graham D, Burns K., Adair B.M, Allan G.M 1998 The reverse transcription polymerase chain reaction fot the diagnostics of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome: comparision with virus isolation and serology Vet Microbiol 62: 207- 215 60 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., et al 2007 Emergenece of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS ONE (6): 526 61 van Rijn, P.A., Wellenberg, G.J., Hakze-van der Honing, R., Jacobs, L., Moonen, P.L., Feitsma, H 2004 Detection of economically important viruses in boar semen by quantitative real-time PCR technology Journal of Virological Methods 120: 151–160 62 van Vugt, J.J., Storgaard, T., Oleksiewicz, M.B., Botner, A 2001 High frequency RNA recombination in porcine reproductive and respiratory syndrome virus occurs preferentially between parental sequences with high similarity Journal of General Virology 82: 2615–2620 63 Lurchachaiwong W., S Payungporn, U Srisatidnarakul, C.Mungkundar, A Theamboonlers and Y Poovorawan 2007 Rapid detection and strain identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254 64 Wasilk A., Callahan J.D., Christopher-Hennings J.J, Gay T A., Fang Y., Dammen M., Reos M E., Torremorell M., Polson., Mellencamp M., Nelson E.A 2004 Detection of U.S Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR J Clin Microbiol 42: 4453-4461 65 Wissink E H., Kroese M V., Maneschijn-Bonsing J G., Meulenberg J J., Rijn P A van , Rijsewijk F A., and Rottier P J 2004 Significance of theoligosaccharides of the porcine reproductive and respiratory syndrome virusglycoproteins GP2a and GP5 for infectious virus production J Gen Virol 85:3715–3723 66 Wootton S.K., Nelson E.A., Yoo D 1998 Antigenic structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Clin Diagn Lab Immunol 5: 773–779 67 Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R., ChristopherHennings J., Nelson E 2001 A 10 kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b Virology 287: 183-191 68 Andreyev, V G., Wesley, R D., Mengeling, W L., Vorwald and Lager 1997 Genetic variation ang phylogenetic relationships of 22 porcine reproductive and 44 respiratory syndrome virus (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame Arch Virol 142:993-1001 69 Xing-Long Xiao, Hui Wu, Yi-Gang Yu, Bang-Zhao Cheng, Xiao-Quan Yang, Gu Chen, Dong-Mei Liu, Xiao-Feng Li 2008 Rapid detection of a highly virulent Chinese-type isolate of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus by real-time reverse transcriptase PCR Journal of Virological Methods 149: 49–55 70 Bosch, B J., C A M de Haan, and P J M Rottier 2004 Coconavirus spike glycoprotein, extended at the carboxy terminus with green flourecent protein, is assembly competent J Virol 78:7369-7378 71 Chen J., Liu T., Zhu C G., Jin Y F., Zhang Y Z 2006 Genetic variation of Chinese PRRSV strains based on ORF5 sequence Biochem Genet 44:421-431 72 Chengmin Wang, Bin Wu, Siad Amer, Jing Luo, Hongmei Zhang, Yunhai Guo, Guoying Dong, Baohua Zhao and Hongxuan He 2010 Phylogenetic analysis and molecular characteristics of seven variant Chinese field isolates of PRRSV BMC Microbiology 2010 10-146 73 Snijder, E J., A L M Wassenaar and W J M Spaan 1994 Proteolytic arterivirus NSP2 protease An unusual cysteine protease with primary structure similarities to both papain-like and chymotrypsin-like proteases J Bol Chem 270:16671-16676 74 Snijder, E J., H van Tol, N Roos and K W Pedersen 2001 Non-structure protein and interact to modify host cell membranes during the formation of the artervirus replication complex J Gen Virol 82:985-994 75 Van der Meer, Y., H van Tol, J krijnse Locker and E J Snijder 1998 ORF1aencoded replicase subunits are involved in the membrane association of the artervirus replication complex J Virol 72:6689-6698 76 Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, KenInui et at 2007 Procine respiratory and reproductive syndorme virus variants, Viet Nam and China, 2007 Veterinary Services 77 Oleksiewicz, M B., A Botner, P Toft, P Normann and T Storgaard 2001 Epitope mapping porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display: the nsp2 fagment of replicase polyprotein contains a cluster of B-cell epitopes J Virol 75:3277-3290 78 Pedersen, K W., Y van der Meer, N Roos and E J Snijder 1999 Open reading frame la-encodeed subunits of the arterivirus replicase induce endoplasmic reticulum-derived double-membrane vesicles which carry the viral replication complex J Virol 73:2016-2026 Các tài liệu từ Internet http://www.animal-health-online.de) http://www.porcilis-prrs.com/images/genome.jpg) http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-strains.asp) http://cgr.otago.ac.nz/SLIDES/TAQMAN/SLD008.HTM) http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.sinhocvietnam.com http://www.chicucthuyhcm.org.vn 45 PHỤ LỤC Phụ lục Các bước xây dựng đường chuẩn plasmid DNA 1.1 Phản ứng RT-PCR tạo sản phẩm gắn kết vào plasmid Phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen chứa khung đọc mở NSP2 thực với kit QIAGEN OneStep RT-PCR Bảng Trình tự mồi khuếch đại đoạn NSP2 (Youjun ctv, 2007) Tên mồi Trình tự mồi F-NSP2 5′-AAA GAC CAG ATG GAG GAG GA-3′ R-NSP2 5′-GAG CTG AGT ATT TTG GGC GTG-3′ Phản ứng RT-PCR tạo sản phẩm cho sản phẩm 662 bp Các bước tiến hành:  Làm tan RNA khuôn, đoạn mồi, dNTP mix, 5X QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer, nước khơng có RNase, đặt chúng đá  Chuẩn bị hỗn hợp hoá chất cho phản ứng RT-PCR  Trộn hỗn hợp hoá chất kỹ, phân bố lượng phù hợp vào PCR eppendorf  Thêm RNA khuôn: Tùy theo lượng RNA tổng số thu nhận mà thể tích RNA cho vào phản ứng khác nhau, thơng thường µl (khoảng pg đến µg RNA) Đọc kết điện di: Sản phẩm điện di thể rõ băng kích thước 662 bp vùng vùng gen NSP2 1.2 Thực phản ứng gắn DNA đích với plasmid pGEM T Easy Sau phản ứng RT-PCR, ta dùng sản phẩm DNA nối vào plasmid pGEM T Easy (Promega) phương pháp TA-Cloning khuẩn lạc dương tính chọn phân loại khuẩn lạc xanh/trắng Tag polymerase thêm 3’-A overhang vào đầu sản phẩm PCR, tạo điều kiện nhân sản phẩm PCR trực tiếp vào cloning plasmid thẳng với 3’-T overhang Sản phẩm PCR với dA overhang trộn với plasmid Plasmid sản phẩm PCR nối với tác động T4 DNA ligase Hệ thống plasmid pGEM T Easy hệ thống thuận lợi cho việc tạo dòng sản phẩm PCR Plasmid phân cắt EcoRV thêm vào đầu 3’ Thymidine đầu cải thiện lớn hiệu kêt nối sản phẩm PCR vào plasmid cách ngăn cản tự đóng vòng plasmid tạo tương thích với đầu overhang sản phẩm PCR Hình Plasmid pGEM T Easy Quy trình tiến hành theo quy trình nhà sản xuất; tóm lại: Ly tâm nhẹ ống pGEM T Easy Plasmid thu phần đáy ống Chuẩn bị hóa chất gắn vòng Vortex ống 2X Rapid Ligation Buffer kỹ trước sử dụng Mix thành phần cách pipetting Ủ khoảng điều kiện nhiệt độ phòng Bảng Thành phần phản ứng lagation Thành phần Thể tích (µl) 2X Rapid ligation Buffer, T4 DNA Ligase pGEM T Easy Plasmid (50ng) Sản phẩm PCR T4 DNA Ligase Nước khử Ion 1.3 Chuyển plasmid vào tế bào chủ E coli DH5α 1.3.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp phương pháp calcium chloride (theo quy trình Sambrook ctv, 1989 có sửa đổi) Bước 1: Hút 20 µl dịch vi khuẩn vào eppendorf chứa ml môi trường LB lỏng Bước 2: Ni cấy lắc vòng - Bước 3: Chuyển eppendorf chứa vi khuẩn vào thùng nước đá giữ lạnh 10 phút Bước 4: Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút 4oC Bước 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên Lập lại bước đến hết dịch nuôi cấy Bước 6: Cho ml CaCl2 100 mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa Bước 7: Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút oC Bước 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf phút để làm khơ kết tủa Bước 9: Cho 150 µl CaCl2 100 mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa Thêm 20 µl glycerol vào trữ -70 oC Khả nạp chuẩn bị theo phương pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau bảo quản -70 oC Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc rã đông giúp việc bảo quản khả nạp lâu Cần ý phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho lần sử dụng 1.3.2 Biến nạp plasmid pGEM T Easy vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình Sambrook ctv, 1989 có sửa đổi) - Dịch huyền phù tế bào khả nạp chuẩn bị, trữ tủ -70oC Chúng ta hút µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh đá 30 phút - Chuyển nhanh eppendorf vào bồn nhiệt 42 oC, giữ 90 giây - Chuyển nhanh eppendorf vào bình nước đá, giữ phút - Hút 20 µl dịch huyền phù cho vào ml môi trường LB lỏng chứa eppendorf 1,5 ml ủ 370C từ 1–2 - Hút 1,5 µl ampicillin 50 µg/ml cho vào eppendorf tiếp tục ủ 37 oC 24 1.3.3 Chọn lọc tế bào biến nạp Nhằm chọn thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mục tiêu nhiều thể biến nạp thu Chúng ta chọn lọc thể biến nạp mang gen mục tiêu dựa khả kháng kháng sinh (ampicillin) sàng lọc xanh – trắng dựa biểu β-galactosidase Chúng ta thực bước sau: - Pha loãng 100 lần dung dịch tế bào biến nạp - Chuẩn bị môi trường LB + Amp + IPTG + X-gal - Dùng que trang cấy phần dịch pha lỗng lên đĩa mơi trường LB + Amp + IPTG + X-gal, ủ 37oC 24 1.4 Ly trích plasmid DNA Nhằm đảm bảo plasmid ly trích đạt độ tinh cần thiết dùng để xây dựng đường chuẩn, chúng tơi đề nghị ly trích plasmid DNA AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Quy trình li trích plasmid sử dụng AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Vi khuẩn sau tăng sinh môi trường LB lỏng vòng 16 Bước 1: Chuyển dịch vi khuẩn nuôi cấy vào ống eppendorf (1,5 - 2,0 ml) Ly tâm phút 13000 vòng/phút 4oC Loại bỏ dịch việc gạn hay hút Bước 2: Thêm 250 µl dung dịch resuspension rung lắc hút lên hút xuống đến cặn tế bào tan hồn tồn Bước 3: Thêm 250 µl dung dịch lysis trộn cách đảo ngược eppendorf nhanh, mạnh - lần Không vortex lắc mạnh Dung dịch trở nên nhớt mỏng Bước 4: Thêm tiếp 350 µl dung dịch neutralization trộn cách đảo ngược eppendorf - lần Không vortex lắc mạnh Kết tủa hình thành Bước 5: Ly tâm vòng phút 13000 vòng/phút oC hỗn hợp Kết tủa đặc trắng hình thành dọc theo cạnh đáy ống eppendorf Dịch chứa DNA plasmid Bước 6: Trong ly tâm, chèn cột plasmid mini column vào ống capless wash ml Bước 7: Bằng việc hút hay gạn, chuyển dịch từ bước vào cột plasmid mini column Ly tâm phút 13000 vòng/phút 4oC Bước 8: Dung dịch wash solution cung cấp nồng độ 5X Thêm vào thể tích (100 ml) ethanol 95 - 100% trước sử dụng Bước 9: Lấy cột plasmid mini column khỏi eppendorf rửa Bỏ phần nước lọc từ eppendorf, chuyển plasmid mini column vào ống eppendorf rửa khác Thêm vào 750 µl dung dịch wash solution ly tâm phút 13000 vòng/phút oC Bước 10: Bỏ dung dịch wash solution từ eppendorf, chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf rửa khác Ly tâm thêm phút để loại bỏ dung dịch wash solution lại Bước 11: Chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf Thêm 50 µl dung dịch elution vào màng đế cột cho phép phút để dung dịch bão hòa màng Ly tâm phút 13000 vòng/phút oC để tách rửa plasmid Bước 12: Bỏ cột mini column trữ plasmid 4oC Plasmid sau ly trích xác định nồng độ máy photometer 1.5 Kiểm tra plasmid DNA PCR Plasmid sau ly trích thực phản ứng PCR đoạn mồi, hóa chất, thành phần chu trình nhiệt tương tự phản ứng real time RT-PCR Phụ lục 2.Tính tốn số pha loãng (Applied Biosystems, 2003) Với dung dịch chứng dương plasmid DNA chứa đoạn DNA đích, tính số plasmid DNA có dung dịch từ lượng Cstock (ng/µl) plasmid DNA Cách tính sau: - Khối lượng trung bình phân tử DNA mạch đôi: 660 g, plasmid dài L base (kể đoạn DNA chèn vào) có khối lượng (660 x L) g hay (660 x 109 x L) ng - Theo định luật Avogadro, mole có 6,023 x 1023 phân tử (hay số plasmid) - Khối lượng : M = L x 1.096x10-21 Với: L = 3677bp (L = L plasmid + L DNA NSP2 = 3015 + 662) Khối lượng : M = L * 1,096.10 -21 = 3677 * 1,096.10-21 = 4.02925*10 -18 (g) Pha loãng nồng độ theo hệ số hệ số 10 thu nồng độ từ 108 đến 100 để xây dựng đường chuẩn tuyến tính để kiểm tra tính nhạy đồng thời dựa vào nồng độ tính số vi rút có mẫu Bảng Khối lượng plasmid chứa số quan tâm Số 108 107 106 105 104 103 102 101 100 Khối lượng (g) 4.02925.10-10 4.02925.10-11 4.02925.10-12 4.02925.10-13 4.02925.10-14 4.02925.10-15 4.02925.10-16 4.02925.10-17 4.02925.10-18 Bảng Nồng độ DNA plasmid đạt µl phản ứng Khối lượng plasmid cần Nồng độ cuối phản Số thêm vào (g) ứng (g/µl) -10 10 4.02925.10 8.05851*10-11 107 4.02925.10-11 8.05851*10-12 -12 10 4.02925.10 8.05851*10-13 105 4.02925.10-13 8.05851*10-14 -14 10 4.02925.10 8.05851*10-15 103 4.02925.10-15 8.05851*10-16 -16 10 4.02925.10 8.05851*10-17 101 4.02925.10-17 8.05851*10-18 -18 10 4.02925.10 8.05851*10-19 Chuẩn bị dãy pha loãng: Với OD chuẩn stock sau ly trích 280 ng/ul hay 280*10-9 g/ul Suy số 5ul dung dịch stock: m = C*V=1.40*10 -6 g Số ul dung dịch stock ( bao gồm mạch) 3.47459*1011 pha lỗng 100ul dung dịch plas có 108bản từ dd có số 3.47459*108 dd có số 3.47459*108 có nồng độ C1= 280*10 -12 g/ul C1V1 = C2V2 280*10-12 * V1 = 8.05851*10 -11* 100 V1 = 28.78037 µl Thể tích nước pha lỗng: 100 µl – 28.78039 µl = 71,21963 µl Pha loãng nồng độ theo hệ số hệ số 10 thu nồng độ từ 108 đến 100 để xây dựng đường chuẩn tuyến tính để kiểm tra tính nhạy đồng thời dựa vào nồng độ tính số vi rút có mẫu Bảng Tính tốn kết pha loãng từ 10 đến 100 Thể Độ pha Nguồn Nồng độ ban đầu (g/µl) lỗng Thể tích plasmid DNA (µl) Thể tích tích pha lỗng cuối (µl) Nồng độ cuối (g/µl) Số cuối µl (µl) Stock 280.10-9 280.10 -9 Pha loãng 280.10-9 45 50 280.10-10 3.47459.10 11 3.47459.10 10 Pha loãng 280.10-10 45 50 280.10-11 3.47459.109 Pha loãng 280.10-11 45 50 280.10-12 3.47459.108 Pha loãng 280.10-12 28.78039 71,21961 100 108 Pha loãng5 10 90 100 Pha loãng 8.05851.10-11 8.05851.10-12 8.05851.10-11 8.05851.10-12 10 90 100 8.05851.10-13 106 Pha loãng 8.05851.10-13 10 90 100 8.05851.10-14 105 Pha loãng 8.05851.10-14 10 90 100 8.05851.10-15 104 Pha loãng 8.05851.10-15 10 90 100 8.05851.10-16 103 10 Pha loãng10 8.05851.10-16 10 90 100 8.05851.10-17 102 11 Pha loãng11 8.05851.10-17 10 90 100 8.05851.10-18 101 12 Pha loãng12 8.05851.10-18 10 90 100 8.05851.10-19 100 Phụ lục Kết xử lý giá trị Ct trung bình SD Bảng Hệ số biến động giá trị Ct Nồng độ (bản Lần sao/µl) Lần2 Lần 108 12,39 11,76 12,29 107 15,10 14,99 14,92 106 18,77 18,73 18,75 105 21,97 21,93 22,42 104 25,63 24,96 24,97 103 29,11 28,25 28,15 102 31,18 31,76 31,37 107 Kết sau xử lý ANOVA sử dụng phần mềm MSTATC ... (10/51 có huy t dương tính) Các nghiên cứu bệnh trại heo giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ heo có huy t dương tính với bệnh khác nhau, từ 1,3% 68,29% Ở nước khác, tỷ lệ đàn vùng bệnh có huy t dương... 2008-2012 quan tâm động viên thời gian học tập thực đề tài Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Phan Châu Huy i TÓM TẮT Trong năm gần đây, bùng phát bệnh rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) hầu hết vùng... VÀ HÔ HẤP CHỦNG TRUNG QUỐC TRÊN HEO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS TRẦN THỊ DÂN PHAN CHÂU HUY KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ