BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BIẾN NẠP PLASMID pGII0229 Trgus cp148 luc VÀO VI KHUẨN Agrobacterium VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO MẪU CÂY Jatropha curcas L Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU TRANG Niên khóa: 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BIẾN NẠP PLASMID pGII0229 Trgus cp148 luc VÀO VI KHUẨN Agrobacterium VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO MẪU CÂY Jatropha curcas L Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS BÙI MINH TRÍ NGUYỄN THỊ THU TRANG ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Để trƣởng thành đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm nay, trƣớc tiên xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ba-Mẹ hai em bên cạnh, động viên, cảm ơn đại Gia đình ln quan tâm, lo lắng cho Gia đình ln động lực giúp vƣợt qua khó khăn sống Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí quan tâm, tận tình bảo cho em ý tƣởng, định hƣớng đề tài, tạo điều kiện tốt cho em trình làm đề tài Em xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ trực tiếp hƣớng dẫn tận tình truyền đạt cho em kiến thức quý báu Cảm ơn ngƣời bạn nhóm nghiên cứu: Tuấn, Tài, Quyết, Linh, Hiền hỗ trợ tơi q trình làm đề tài Cảm ơn ngƣời bạn thân thiết bên cạnh, chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt bốn năm đại học Cảm ơn tập thể lớp DH08SH cho kỷ niệm đẹp thời sinh viên quan tâm, động viên lúc làm đề tài Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng đại học Nông Lâm Tp HCM tạo điều kiện cho em bốn năm học tập trƣờng Các Thầy - Cô dạy dỗ Q Thầy Cơ thuộc Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học truyền đạt cho em kiến thức chuyên ngành bổ ích Em trân trọng giúp đỡ ban lãnh đạo Viện Thầy – cô, Anh - Chị làm việc Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học Môi Trƣờng tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài Xin cảm ơn dự án SIDA/SAREC Công nghệ Sinh học hỗ trợ kinh phí thực đề tài Tp Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012 Nguyễn Thị Thu Trang i TÓM TẮT Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu Jatropha curcas L.” đƣợc thực với mục tiêu xác định kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào Jatropha đạt hiệu cao Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang Jacobsen thiết kế mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin gen thị gusA đƣợc ly trích từ vi khuẩn biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580 Vi khuẩn sau biến nạp đƣợc sàng lọc môi trƣờng có chứa kháng sinh kanamycin kiểm tra kỹ thuật PCR khuẩn lạc Kết kiểm tra vi khuẩn cho thấy có diện plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc gen mục tiêu plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực việc chuyển gen Hạt giống Jatropha Úc đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen Mẫu phôi Jatropha đƣợc thu nhận từ hạt đƣợc tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau biến nạp Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen nhƣ nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đƣợc khảo sát với mục đích tìm đƣợc quy trình chuyển gen hiệu Kết nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dƣơng tính thuốc thử X-gluc cao, tất nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75% Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu GUS đạt 70,87% nghiệm thức cao nhƣng lại ảnh hƣởng đến sức sống mẫu Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu GUS (66,67%) cao so với mẫu phôi không tiền ni cấy (54,17%) ảnh hƣởng đến sức sống mẫu Phƣơng pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha nảy mầm với ƣu điểm không trải qua bƣớc nuôi cấy in vivo đƣợc thực ba cách: tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn Kết bƣớc đầu sau nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu GUS từ 40 – 60%, sau sàng lọc với PPT nồng độ 400 mg/l, thu đƣợc 5% giả định đƣợc chuyển gen (15 cây) Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau lây nhiễm với mẫu chƣa hiệu Các loại khángsinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin khơng có khả loại bỏ vi khuẩn cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm ii SUMMARY The thesis: “Transfomation of plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc into Agrobacterium tumefaciens and establishment of gene transformation protocol for Jatropha curcas L.” was performed in order to determining a suitable technique for gene transfer on Jatropha with high efficiency A tumefaciens harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying βglucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was provided by Jacobsen Plasmid was isolated and transformed into A tumefaciens strain GV3580 The presence of binary plasmid and bar gene were screened by clonies selection on LB media supplemented with kanamycin and confirmed by colony’PCR An efficient system for A tumefaciens mediated transformation of Jatropha curcas L was developed in this study Several factors affecting the transformation efficiency were optimized, including preculture periods, usage of acetosyringone and dipping time of explant in Agrobacterium suspension A genetic transformation procedure for J.curcas was established via Agrobacterium tumefaciens infection of embryo explants Transgenic embryo were confirmed by the GUS assay The percent tage of transient GUS expression was higher in 2-day precultured embryo explant (66,67%) as compared to embryo explant (54,17%) and less impact on the vitality of explants Two-day precultured embryo explants were transformed by co-cultivation with Agrobacterium After days of co-cultivation, the transient GUS expression was showed in all treatments Results showed that positive rate for X-gluc reagent was high in all treatments ranged from 41,67 – 75% Concentration of acetosyringone 100 μM, co-incubated in Agrobacterium suspension for 30 resulted transient GUS activity (70,83%), was found to be the best treatment The germinating seeds were injected with A tumefaciens, followed by sonication, co-cultivation with shaking, and injection Compared with transformation of embryo, that of germinating seeds was simple and repeatable, since it required no prior tissue iii culture steps and produced transgenic plants more efficiently The embryo of the germinating seed was demonstrated by the detection of β-glucuronidase activity in the primary transformants T0 seedlings were screened by PPT selection at 400 mg/l About 5% of T0 seedlings examined were found to be transgenic The elimination of the bacteria after cocultivation process was not efficient The antibiotic cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin could not remove bacteria effectively lead to re-infection iv MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục v Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách bảng x Danh sách hình sơ đồ xi Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc đặc điểm Jatropha 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái – đặc tính sinh học 2.1.4 Các ƣu điểm sinh học giá trị Jatropha 2.1.4.1.Ý nghĩa mặt kinh tế, xã hội 2.1.4.2 Ý nghĩa mặt môi trƣờng 2.1.4.3.Sử dụng làm phân bón thức ăn gia súc 2.1.4.4 Công dụng chữa trị bệnh 2.2 Hiện tƣợng biến nạp 2.2 Phƣơng pháp biến nạp vi khuẩn 2.2.1 Giới thiệu phƣơng pháp biến nạp 2.2.2 Cơ chế biến nạp 2.2.3 Vai trò biến nạp 2.3 Giới thiệu chung phƣơng pháp chuyển gen thực vật 2.3.1 Khái niệm 2.3.2 Thành phần gen chuyển nạp 2.3.2.1 Promoter terminator 2.3.2.2 Gen thông báo v 2.3.2.3 Chỉ thị chọn lọc 2.3.3 Một số phƣơng pháp chuyển gen thực vật 2.3.3.1 Chuyển nạp gen phƣơng pháp PGE 2.3.3.2 Chuyển nạp gen phƣơng pháp sử dụng xung điện 2.3.3.3 Chuyển gen phƣơng pháp bắn gen 2.3.3.4 Chuyển gen vi tiêm 10 2.3.3.5 Chuyển gen phƣơng pháp SAAT – chuyển gen gián tiếp sử dụng Agrobacterium với hỗ trợ sóng siêu âm 11 2.3.3.6 Một số phƣơng pháp chuyển gen in vivo 12 2.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phƣơng pháp chuyển Agrobacterium 12 2.4.1 Phân loại 12 2.4.2 Đặc điểm hình thái, di truyền gây bệnh 12 2.4.3 Ti plasmid 13 2.4.3.1 Vùng T-DNA 13 2.4.3.2 Vùng gen vir 14 2.4.4 Cơ chế phân tử trình xâm nhiễm chuyển gen vào thực vật 14 2.4.5 Acetosyringone vai trò q trình xâm nhiễm 16 2.4.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen 16 2.4.6.1 Ảnh hƣởng vật liệu chuyển gen 17 2.4.6.2 Ảnh hƣởng dòng vi khuẩn 17 2.4.6.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 18 2.4.6.4 Chất hoạt động bề mặt 18 2.4.6.5 Ảnh hƣởng kháng sinh 18 2.4.6.6 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy mật số vi khuẩn 19 2.4.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng khác 20 2.5 Các phƣơng pháp kiểm tra chuyển gen 20 2.5.1 Phƣơng pháp thử GUS 20 2.5.2 Phƣơng pháp thử khả kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ PPT 20 2.5.3 Sử dụng PCR đánh giá kết chuyển gen thực vật 21 2.5.4 Phƣơng pháp Southern blot xác định gen ngoại lai gen 21 2.6 Tình hình nghiên cứu chuyển gen Việt Nam 22 vi 2.7 Một số nghiên cứu nƣớc chuyển gen vào Jatropha 24 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 3.1 Thời gian địa điểm 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm 27 3.2.1 Giống 27 3.2.2 Chủng vi khuẩn vector chuyển gen 27 3.2.3 Hóa chất 28 3.2.4 Thiết bị dùng thí nghiệm 28 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 28 3.3.1 Khảo sát khả diệt khuẩn loại kháng sinh cefotaxim, meropenem ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 28 3.3.2 Tạo dòng vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 29 3.3.2.1 Kiểm tra diện plasmid pGII0229 Trgus cp148 30 3.3.2.2 Chuẩn bị tế bào khả nạp 31 3.3.2.3 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 31 3.3.2.4 Kiểm tra diện plasmid gen bar chủng vi khuẩn GV3580 sau biến nạp 31 3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng PPT đến sinh trƣởng Jatropha in vivo 33 3.3.4 Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn A tumefaciens 33 3.3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn 33 3.3.4.2 Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phơi J.curcas 33 3.3.4.3 Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha nảy mầm 35 3.3.5 Xử lý số liệu 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết khảo sát khả diệt khuẩn ba loại kháng sinh 37 4.2 Tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang gen bar 40 4.2.1 Kết kiểm tra diện plasmid vi khuẩn 40 4.2.2 Kết biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn A tumefaciens GV3580 41 4.3 Kết khảo sát ảnh hƣởng PPT lên sinh trƣởng Jatropha in vivo 42 4.4 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào phôi 43 4.4.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng mẫu tiền nuôi cấy không tiền nuôi cấy lên hiệu chuyển gen 44 vii 4.4.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian ngâm mẫu nồng độ acetosyringone đến hiệu chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 45 4.5 Kết chuyển gen vào hạt Jatropha nảy mầm 48 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 53 5.2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Phụ lục viii khác biệt lớn so với nghiệm thức ngâm mẫu 15 phút Số lƣợng mẫu có biểu màu xanh chàm đặc trƣng cao tổng số mẫu quan sát NT9, 75%, NT5 (70,83 %), NT6, NT8 (66,67%) thấp NT1 (41,67%) NT4 (45,83%) Dựa vào kết xử lý thấy có khác biệt NT9 nhóm nghiệm thức lại, cho thấy hai yếu tố thời gian ngâm mẫu nồng độ acetosyringone ảnh hƣởng đến biểu GUS (P < 0,05) Bảng 4.4 Kết nhuộm GUS nghiệm thức chuyển gen Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 Nồng độ acetosyringone (µM) 100 200 Thời gian ngâm mẫu 15 30 45 15 30 45 15 30 45 Tỷ lệ mẫu biểu gen gusA (%) 41,67c 58,33abc 54,17bc 45,83c 70,87ab 66,67ab 54,17bc 66,67ab 75,00a Trong cột số trung bình có ký tự khơng có khác biệt mặt thống kê mức P