MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), trồng quan trọng khơng Việt Nam xuất gần 200 quôc gia giới Đậu tương trồng cạn ngắn ngày , có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế cao Đối với nông nghiệp, đậu tương trồng thân thiện với môi trường thúc đẩy phát triển kinh tế nơng nghiệp Đậu tương ví nhà máy sản xuất đạm tự nhiên nhờ nốt sần rễ giúp cải thiện chất lượng đất thông qua khả hấp thụ nitơ tự nhiên Các sản phẩm từ đậu tương sử dụng rộng rãi toàn giới Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe người nhờ có chứa thành phần isofavone Isoflavone dươc chất có nguồn gốc thảo mộc , làm giảm xuất số loại ung thư, giảm triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa bệnh tm mạch, béo phì, lỗng xương, ngăn chặn gia tăng cholesterol máu Bên cạnh isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng da, giảm nếp nhăn, giảm độ sâu nếp nhăn mắt, làm cho da săn nhờ tăng cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc giữ ẩm cho da Con đường sinh tổng hợp isoflavone đâu tương biết nhánh đường phenylpropanoid với hai enzyme chìa khóa chalcone synthase (CHI) isoflavone synthase (IFS) để tổng hợp isoflavone genistein daidzein có khả chống oxi hóa mạnh Chúng tm thấy chủ yếu đậu tương loại họ đậu khác Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone đậu tương rât thâp, khoảng từ 50 – 3000 µg/g tồn hai dạng glycoside aglucone Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới 90% isoflavone tổng số cho hấp thụ hạn chế hệ têu hóa người, Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đó, dạng aglucone hấp thụ nhanh , ham lương lai thấp , chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số Chính nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào việc cải thiện theo hương nâng cao hàm lượng isoflavone hạt đậu tương cần thiết Kỹ thuật biêu hiên gen thưc vât cho phép tạo cac dong có khả tổng hợp isoflavone với hàm lượng cao , tạo nguyên liêu phuc vụ sản xuất cac chê phâm sinh hoc đáp ứng nhu cầu ngày tăng cua công tac chăm soc va bao vêsưc khoe nước ta Xuất phát từ lý , đề tài luận văn thạc si lựa chọn thực là: “Nghiên cứu đặc điêm gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ đậu tương” Mục têu nghiên cứu Phân tch đặc điểm gen mã hóa chalcone synthase đương sinh tông hơp isoflavone phân lâp tư hai giống đâu tương khác hàm lượng isoflavone Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân tch hàm lượng isoflavone hạt nảy mầm ba giống đậu tương Viêt Nam la ĐT51, DT90 DT84 3.2 Nghiên cứu thông tn gen ma hoa chalcone isomerase (CHI), thiêt kê căp môi PCR nhân gen CHI, tách dòng xác định trình tự gen CHI 3.3 Phân tch sư đa dang vê trinh t ự nucleotde trình tự amino acid suy diễn gen CHI Ý nghĩa khoa học thực tễn đậu tƣơng Kêt qua phân tch đăc điêm cua gen CHI xác định điểm sai khác vê trinh tư nucleotde cua gen CHI trình tự amino acid suy diê n giưa c ác giông đâu tương khac vê ham lương daidzein va genistein sở để giải thích mối liên quan gen CHI vơi hoat đông tông hơp isoflavone đâu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn tương Đồng thời cũng sở sử dụng đoạn mã hó a cua gen CHI viêc thiêt kê vector chuyên gen muc đich nâng cao ham lương isoflavone đâu tương băng ky thuât chuyên gen Kêt qua xac đinh ham lương daidzein va genistein cua cac giông đâu tương nghiên cưu cung c ấp liệu cho chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao ham lương isoflavone cua đâu tương Kết nghiên cứu luận văn tư liệu khoa học phục vụ cho mục đích nghiên cứu giảng dạy cơng nghê sinh hoc Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại đặc điểm thực vật học đậu tƣơng Cây đậu tương hay gọi đậu nành có tên khoa học Glycine max (L.) Merrill, loại ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), đậu tương mang nhiễm sắc thể 2n=40 Cây đâu tương đươc xêp thông sau: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fabales Họ: Fabaceae Phân họ: Faboideae Giống: Glycine Loài: Max Cây đậu tương xuất đầu tên từ 1100 năm trước Công nguyên vùng Đông Bắc Trung Quốc Theo nhiều tài liệu nghiên cứu đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu phía Bắc Trung Quốc từ thời triều đại Phong kiến, sau có nhiều tài liệu cho đậu tương hoá triều đại Shang, hay gọi triều đại nhà Thương, vào khoảng kỉ XVII đến kỉ XI trước Công Nguyên, sau lại lan truyền sang Nhật Bản, Triều Tiên vào khoảng kỷ thứ VIII, tếp tục lan truyền sang nước châu Á khác Thái Lan, Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam [1] Đến kỷ XVII, đậu tương giới thiệu vào Châu Âu nhà thực vật học đặt tên Glycine max Sau đến kỷ XVIII đậu tương du nhập vào Mỹ, có nhiều kết cho thấy có phù Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hợp điều kiện khí hậu đất đai nên việc trồng trọt đậu tương Mỹ phát triển mạnh mẽ cho sản lượng đậu tương tăng lên nhanh chóng, đến đậu tương coi trồng đem lại giá trị kinh tế cao Mỹ nhiều quốc gia khác giới: Trung Quốc, Brazil [3], [5] Hiện nay, đậu tương trồng phổ biến nhiều quốc gia giới đậu tương công nghiêp, thưc phâm đem lại giá trị kinh tế cao nhờ sư vượt trội hẳn so với trồng khác hàm lượng chất dinh dưỡng protein, lipid cao, chứa nhiều vitamin, khống chất nhiều hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ người Tại Việt Nam đậu tương ví “vàng mọc từ đất” đậu tương cho sản lượng cao, cải tạo đất trồng xen canh gối vụ với nhiều loại trồng, chứa nhiều hàm lượng protein đem lại nhiều giá trị kinh tế Cây đậu tương loại thân thảo, bụi nhỏ năm Thân mảnh, cao khoảng từ 0,8m đến 0,9 m, có lơng, cành hướng lên phía Một đậu tương hồn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, hạt Rê đâu tương Rễ đậu tương rễ cọc, rễ bao gồm rễ (rễ chính) nhiều rễ bên hay gọi rễ phụ, rễ mọc nhiều rễ phụ rễ phụ cấp rễ phụ cấp Trong điều kiện bình thường rễ ăn sâu vào đất khoảng 20-30 cm có ăn sâu đến 15oCm; thơng thường rễ tập trung nhiều độ sâu 6-2oCm Bộ rễ phát triển chia thành thời kỳ chính: (i) Thời kỳ thứ nhất: rễ rễ phụ đầu tên phát triển mạnh sinh nhiều rễ con, thời kỳ kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc (ii) Thời kỳ thứ hai: lớp rễ đầu tên phát triển chậm dần, rễ không phát triển có rễ phụ nhỏ kéo dài phát triển gần thu hoạch Trên rễ rễ phụ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum sinh sống, loại vi khuẩn có dạng hình gậy hình cầu quan sát Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn kính hiển vi điện tử, vi khuẩn Rhizobium japonicum sống lòng đất, có khả cố định đạm từ khí trời, họ đậu có vài trăm nốt sần phân bố đồng rễ, ban đầu hình thành nốt sần có màu sữa sau phát triển có màu hồng Quá trình hình thành nốt sần kéo dài 16-21 ngày, phát triển nhiều mạnh vào lúc đậu tương hoa làm Giữa vi sinh vật nốt sần với đậu tương chúng có mối quan hệ cộng sinh, cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động ngược lại vi khuẩn lại tch hợp nitơ tự khơng khí chuyển sang đạm hữu để sử dụng Cây đậu tương nhiều chất dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động vi sinh vật phát triển tích lũy đạm nhiều cho sinh trưởng phát triển tốt Thân, cành đâu tương Thân đậu tương thuộc thân thảo có hình tròn, chia đốt, phân cành, thân có nhiều lơng nhỏ Thân đậu tương thường đứng có thân bò hay nửa bò, non thân có màu xanh tm, già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc thân non có liên quan chặt chẽ với màu sắc hoa sau Nếu thân lúc non có màu xanh hoa màu trắng non thân có màu tm hoa màu tm đỏ Thân cao trung bình 0,5- 1,2 m cũng có cao đến 1,5m, thân mang 14-15 lóng, lóng phía thường ngắn, lóng phía thường dài Tùy theo giống thời vụ gieo mà chiều dài lóng có khác thường biến động từ 3-10 cm Cây đậu tương vụ hè có lóng dài vụ xn vụ đơng Chiều dài lóng góp phần định chiều cao thân Thân đậu tương thường cao từ 0,31,0m Giống đậu tương dại cao từ 2-3m Thực tế cũng có giống khơng có lơng tơ Những giống có mật độ lơng tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn chịu rét khỏe giống khơng có lơng tơ thường sinh trưởng khơng bình thường, sức chống chịu Thân có lơng tơ nhiều hay ít, dài hay ngắn, dày hay Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn thưa đặc điểm phân biệt giống với Đốt đầu tên thân mang hai mầm, đốt thứ hai lại mang hai đơn mọc đối diện nhau, sau kể từ đốt thứ ba trở đốt mang kép có chét, kép mọc đối diện Dựa vào sinh trưởng đặc điểm mà thân có loại sau: Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân cao trung bình, đốt ngắn, nhiều Loại bò: thân phân cành nhỏ, mềm, phủ bề mặt đất thành đám dây, thân dài, đốt dài, nhỏ Loại nửa bò: loại trung gian hai loại mọc thẳng mọc bò Loại mọc leo: thân nhỏ dài, mọc bò đất hay leo lên giá thể khác Thân đậu tương có khả phân cành từ nách đơn kép Dựa vào đặc tnh sinh trưởng thân cành đặc điểm hoa nên chia giống đậu tương làm hai loại: Sinh trưởng hữu hạn: Khi thân cành hoa không tếp tục sinh trưởng hay cành không cao lên nữa, loại chủ yếu trồng lấy để lấy hạt Sinh trưởng vô hạn: Khi đậu tương hoa kết chín thân cành tiếp tục sinh trưởng, thường loại mọc bò Từ lúc mọc đến có thật (3 kép) khoảng 25 – 30 ngày sau gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường Khi có 6-7 thật thân bắt đầu phát triển mạnh Điểm khác biệt đậu tương với trồng khác hoa rộ lại lúc thân cành phát triển mạnh Đây giai đoạn hai trình sinh trưởng, sinh dưỡng cần cung cấp đầy đủ dinh dưỡng tạo điều kiện cho rễ phát triển thuận lợi Cành mọc từ đốt thân, hướng lên trên, số cành thân nhiều hay phụ thuộc vào loại giống đậu tương, đất đai, kỹ thuật canh tác, điều kiện gieo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn trồng, có giống đậu tương có 1-2 cành có giống khơng có cành, cành thân kết hợp với tạo thành tán đậu tương [7], [15] Lá đâu tương Cây đậu tương có mọc cách có loại chính: mầm, đơn kép có nhiều hình dạng khác hình trái xoan, trứng, tròn, dài, van, mũi gần nhọn, không gốc Mặt thường có nhiều lơng trắng Lá mầm (lá tứ diệp): mầm mọc có màu vàng hay xanh lục tếp xúc với ánh sáng chuyển sang màu xanh Hạt giống to mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi mầm, hết chất dinh dưỡng mầm khô héo Lá nguyên (lá đơn): xuất sau mọc từ 2-3 ngày mọc phía mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau, đơn to xanh bóng biểu sinh trưởng tốt, đơn to xanh đậm biểu giống có khả chịu rét, đơn nhọn gợn sóng biểu sinh trưởng khơng bình thường Lá kép: Mỗi kép có chét, cũng có 4-5 chét Lá kép mọc so le, có màu xanh tươi, già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống chín giữ màu xanh Phần lớn có nhiều lơng tơ Lá có nhiều hình dạng khác tùy theo giống Những giống nhỏ dài chịu hạn khỏe thường cho suất thấp, giống to chịu hạn thường cho suất cao Nếu hai kép đầu to dày thường biểu giống có khả chống chịu rét Số lượng kép nhiều hay ít, diện tch to hay nhỏ chi phối nhiều đến suất phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các nằm cạnh chùm hoa giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa Nếu điều kiện làm cho bị úa vàng vị trí thường bị rụng lép Số nhiều to khoẻ vào thời kỳ hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi biểu sinh trưởng khoẻ có khả cho suất cao Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hoa đâu tương Đậu tương tự thụ phấn, có hoa mọc từ nách lá, hoa nhỏ, khơng có mùi thơm, hoa màu trắng, tm tm nhạt xếp thành chùm hoa, chùm hoa có từ 1-10 hoa cũng có từ 7-8 hoa, hoa dạng cánh bướm, ống đài năm cánh không Tràng hoa gồm cánh hoa cờ phía sau, hai cánh bên hai cánh thìa phía trước tếp xúc khơng dính vào Đài hoa có màu xanh, nhiều lơng Bộ nhị gồm 10 nhị chia làm hai nhóm: nhóm gồm nhị cuống dính với thành khối; nhóm có nhụy hoa, nhụy hoa có nỗn Vòi nhụy cong phía nhị Đậu tương có hoa lưỡng tnh, hồn tồn tự thụ phấn Cây hoa sớm hay muộn, thời gian hoa tuỳ thuộc vào giống thời vụ gieo chịu ảnh hưởng phối hợp ánh sáng nhiệt độ Giống chín sớm sau mọc 30 ngày hoa giống chín muộn 45- 50 ngày hoa Thời gian hoa dài hay ngắn theo giống theo thời vụ Có giống thời gian hoa kéo dài 10-15 ngày Thời kỳ hoa nở rộ thường từ ngày thứ đến ngày thứ 10 sau hoa bắt đầu nở Hoa đợt rộ tạo nhiều, trước sau đợt hoa rộ tỷ lệ đậu thấp Điều kiện thích hợp cho oC nở hoa nhiệt độ 25-28 , ẩm độ khơng khí 75- 80%, ẩm độ đất 70- 80% Cây đậu nành cho nhiều hoa tỷ lệ hoa không thành chiếm 20- 80% Quả hạt đâu tương Hình dáng đậu tương loại thẳng cong, bề ngồi vỏ ráp có nhiều lơng, chín đa số màu vàng xám Hạt có hình tròn, dẹt, bầu dục bề mặt ngồi có lớp vỏ mỏng bao quanh phôi lớn Vỏ hạt nhẵn [2] Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, có nhiều lơng mềm màu vàng, thắt lại hạt Quả đậu tương thuộc loại giáp Mỗi có từ 1- hạt Vỏ đậu tương có lớp: biểu bì, hạ bì lớp nhu mô bên Do vỏ lớp tế bào mô dậu có lớp cutn che phủ nên trao đổi khí khơng xảy ra, trao đổi khí phơi môi trường qua rốn hạt Những mảnh nội nhu bị ép chặt vào Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vỏ hạt Lớp nội nhu gọi lớp aleuron gồm tế bào hình lập phương nhỏ chứa đầy đạm Quả đậu tương gồm nửa noãn, nối với phần bụng lưng Trên đường nối biểu bì cong vào phía tạo nên lớp nhu mô thẳng đứng, lớp nhu mô tách mô dẫn thành vùng giúp tách chín Hạt đậu tương cũng hạt nhiều loại họ đậu khác khơng có nội nhu mà có lớp vỏ bao quanh phơi lớn Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, tử diệp chiếm 90% vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt có nhiều hình dạng khác hình cầu, dẹt, dài oval Ở hạt trưởng thành, đầu rốn lỗ noãn, lỗ bao phủ lớp màng Ở đầu rốn rãnh nhỏ Màu sắc, kích thước, khối lượng, rốn hạt khác đặc trưng cho giống, khối lượng hạt trung bình khoảng 200-400mg/hạt [3], [4], [7] Vê sinh thái học , nhiệt độ thích hợp giai đoạn nẩy mầm giai đoạn từ 24 - 30 oC , độ ẩm giai đoạn nẩy mầm 80% đến giai đoạn non độ ẩm lại giảm xuống 50 - 60% Nhiệt độ 24 - 34 oC nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn hoa kết trái, giai đoạn nhu cầu độ ẩm tăng gần giai đoạn nẩy mầm từ 70 - 80%, sang đến giai đoạn chín nhiệt độ thích hợp giảm 20 oC 25 độ ẩm cũng giảm mạnh xuống mức 35 - 45% Ở đậu tương lượng mưa cần phải đạt từ 700 mm tốt Đa số giống đậu tương trồng nhiều loại đất khác như: đất phù sa, đất xám, đất giồng cát, loại đất thường có thành phần giới nhẹ, độ PH từ 5-8 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam Hiện giới đậu tương trồng đứng thứ tư sau lúa mỳ, lúa nước ngô Thống kê diện tch, suất, sản lượng đậu tương từ 2011-2014 theo FAO thể bảng 1.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2,7 kb  Hình 3.6 Kết kiêm tra san phâm cắt vector pBT-GmCHI căp enzyme NcoI NotI; M: thang DNA kb; giếng 1: pBT-GmCHI cắt; giếng 2: pBT-GmCHI chưa cắt Theo ly thuyêt vector pBT co kich thươc 2705 bp, gen GmCHI có kích thươc 677 bp va tông sô nucleotde cua vector tai tô hơp pBT-GmCHI 3382 bp Kêt qua hinh 3.6 cho thây, giếng vector pBT-GmCHI chưa căt thu đươc băng điên di DNA co kich thươc khoang 3,0 kb, giếng có băng điên di DNA co kich thươc khoang 2,7 kb va 0,6 kb Băng DNA co kich thươc khoa ng 2,7 kb la kich thươc cua vector tach dong pBT , băng DNA có kích thước khoảng 0,6 kb la kich thươc cua gen GmCHI Như vây, kêt qua điên di kiêm tra sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pBT -GmCHI căp enzyme giơi han NcoI NotI đung tnh toan ly thuyêt Do đo co thê kêt luân , gen GmCHI đa đươc nhân dong công vector pBT E.coli plasmid tái tổ hợp pBT-GmCHI đươc sư dung giai trinh tư nucleotde cua gen GmCHI 3.2.3 Trình tƣ gen GmCHI phân lâp tƣ hai giơng đâu tƣơng ĐT51 DT84 Đoan ma hoa cua gen GmCHI đươc xac đinh trình tự nucleotde tư plasmid tai tô hơp pBT-GmCHI thiêt bi giai trinh tư nucleotde tư đông , kết đươc thê hiên hinh 3.7 Kêt qua hinh 3.7 cho thây đoan ma hoa cua gen GmCHI có 657 nucleotide Băng chương trinh phân tch BLAST NCBI cho kêt qua vê đô tương đông 98,9% so vơi trinh tư gen CHI mang ma sô NM _001248290 Ngân hang Gen Như vây kêt qua phân tch đa khăng đinh đoạn gen phân lâp từ mRNA cua hai giống đậu tương ĐT 51, DT84 gen GmCHI Gen GmCHI có kích thước 657 nucleotide, mã hóa cho 218 amino acid Tuy nhiên, giưa cac trinh tư nucleotde cua gen GmCHI giống đậu tương khac môt sô vi tri nucleotde nucleotde co (Bảng 3.2) Bảng 3.2 cho thây giưa cac trinh tư 14 vị trí nulceotde sai khác So vơi trinh tư gen CHI mang ma sơ NM_001248290, trình tự gen GmCHI giơng ĐT51 sai khac vị trí nucleotde , đo la cac vi tri 23, 24, 33, 37, 60, 74, 115; giống DT84 sai khac vị trí nucleotde 12, 91, 140, 244, 598, 635, 639 Trình tự gen GmCHI hai giống ĐT51 DT84 có sai khác 14 vị trí, đo la: 12, 23, 24, 33, 37, 60, 74, 91, 115, 140, 244, 598, 635, 639 Nhưng sai khác có liên quan đên hoat đông cua enzyme CHI hay không cân phai co sư nghiên cưu va phân tch sâu Hình 3.7 Trình tự nucleotide cua gen GmCHI phân lâp tư hai giông đâu tương ĐT51 DT84 so vơi trinh tư gen CHI giống đậu tương mang mã số NM_001248290 Ngân hang Gen Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trình tự nucleotde ba trình tự gen CHI TT Vị trí nucleotide NM_001248290 ĐT51 DT84 12 C C G 23 A G A 24 G T G 33 C G C 37 G C G 60 A G A 74 A T A 91 G G A 115 A T A 10 140 C C G 11 244 G G C 12 598 T T A 13 635 T T G 14 639 C C G Tiêp tuc so sanh trình tự amino acid suy diên tư gen GmCHI hai giống đậu tương nghiên cứu với với trình tư amino acid cua protein CHI suy diễn tư gen mang ma sô NM _001248290, kêt qua thể hình 3.8 Kêt so sánh cho thấy trình tự amino acid s uy diên tư gen GmCHI cac giống đậu tương có tương đồng từ 96,8% đến 97,7% Tuy nhiên, giưa cac trinh tư amino acid suy diên co 12 vị trí sai khac vê amino acid So vơi trinh tư amino acid suy diên tư gen CHI mang ma sô NM _001248290, trình tự amino acid suy diên giống đâu tương ĐT 51 có vị trí amino acid sai khác , đo la cac vi tri 8, 11, 13, 25, 39; giống DT84 có vị trí sai khác, cụ thể vị trí số 4, 31, 47, 82, 200, 212, 213 (Bảng 3.3) Hình 3.8 Trình tự amino acid suy diễn từ geGn mCHI phân lâp tư hai giông đâu tương ĐT51, DT84 từ genCHI mang ma sô NM_001248290trên Ngân hang Gen Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn từ gen GmCHI giưa cac giông đâu tương TT Vị trí amino acid NM_001248290 ĐT51 DT84 I I M Q R Q 11 F L F 13 E Q E 25 K M K 31 G G S 39 I F I 47 T T R 82 D D H 10 200 L L I 11 212 L L W 12 213 S S R Đậu tương có 2n = 40, n = 20 họ gen GmCHI đậu tương gồm gen GmCHI, GmCHI1B1 GmCHI 2-A thuôc nhiêm săc thê sô GLYMA_20G241500, xêp trươc gen trinh tư gen 20 Trong đo gen GmCHI có vị trí GmCHI1B1, têp đên GmCHI2-A (Hình 3.9A) Hai GmCHI mRNA cua hai giông đâu tương ĐT51 DT84 mà phân lập thuộc nhiễm sắc thể số 20, có vị trí khoảng từ 46120K đên 46130K (Hình 3.9B) A B Hình 3.9 Vị trí gen GmCHI, GmCHI1B1, GmCHI2-A đâu tương [htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=nuccore_gene&from_uid=35172 3088] 3.3 SƢ ĐA DANG VÊ TRINH TƢ NUCLEOTIDE VA TRINH TƢ AMINO ACID SUY DIÊN CUA GEN GmCHI 3.3.1 Sƣ đa dang vê trinh tƣ nucleotide cua gen GmCHI Tiến hành phân tch so sánh trình tự nucle otde va trinh tư amino acid suy diên cua gen GmCHI phân lâp tư môt sô giông đâu tương Viêt Nam vơi cac trinh tư công bố Ngân hàng Gen (Bảng 3.4) để xác định hệ số tương đồng hệ số phân ly (Bảng 3.5), thiết lập sơ đồ hình vê m ối quan hệ di truyền giơng đâu tương (Hình 3.10) Bảng 3.4 cho thây trình tự gen GmCHI sư dung phân tch co trình gen phân lập từ hai giống đậu tương Việt Nam ĐT 51 DT84, môt trinh tư Hoa Kỳ, môt trinh tư Korea va trình tự Taiwan Kêt qua phân tch sô tương đông va sô phân ly dưa trinh tư nucleotde cua gen GmCHI bảng 3.5 cho thây sô tương đông dao đông tư 71,3% đến 100%, hệ số phân ly tư 0,0% đến 37,5% Bảng 3.4 Các trình tự genGmCHI phân lâp tư cac giơng đâu tương Viêt Nam va trình tự gen mang mã số Ngân hàng Gen sử dụng phân tch TT Giông / Mã số Năm công GenBank bô Quôc gia Tác giả CHI –ĐT51 2015 Viêt Nam Chu MH et al CHI-DT84 2015 Viêt Nam Chu MH et al NM_001248290 2015 Hoa Ky Ralston et al AF276302 2001 Taiwan Chiu,M.-h.J et al DQ191401 2007 Taiwan Liao,R.-M Et al DQ835284 2007 Korea Chung,E and Nam,M.-H Bảng 3.5 Hê sô tương đông va sô phân ly cua cac giông đâu tương dưa trình tự nucleotde gen GmCHI Môi quan di truyên giưa cac giông đâu tương dưa trinh tư nucleotde cua gen GmCHI đươc thê hiên sơ đô hinh 3.10 Sơ đô hinh 3.10 cho thây giông đâu tương phân bô hai nhanh chinh Nhánh thứ có giơng co trinh tư gen CHI mang ma sô DQ191401, trình tự lại phân bố nhánh thứ hai Khoảng cách di truyền giưa hai nhanh la 18,5% % Hình 3.10 Sơ đồ hình mơ tả mối quan hệ cua môt sô giống đậu tương dưa trình tự nucleotde cua gen GmCHI 3.3.2 Sƣ đa dang vê trinh tƣ amino acid suy diên cua gen GmCHI Tiêp tuc phân tch tnh đa dạng di truyền dựa trình tự amino acid suy diên cua gen GmCHI kêt qua đươc thê hiên bang 3.6 hình 3.11 Bảng 3.6 Hê sô tương đông va sô phân ly cua cac giông đâu tương dưa trình tự amino acid suy diễn gen GmCHI Bảng 3.6 cho thây sô tương đông giưa cac giông đâu tương tư 94,5% đến 100%; sô phân ly tư 0% đến 5,7% Môi quan di truyên giưa cac giông đâu tương dưa trinh tư amino acid suy diên cua gen GmCHI đươc thê hiên sơ hinh 3.11 % Hình 3.11 Sơ đồ hình mô tả mối quan hệ cua môt sô giống đậu tương dưa trình tự amino acid suy diên cua gen GmCHI Trên hinh 3.11, sáu giống đậu tương phân bố hai nhánh Nhánh thứ nhât chi co giông DT 84 giông lai thuôc nhanh chinh thư hai vơi khoang cach di truyên la 2,4% Kêt qua phân tch dưa trinh tư amino acid suy diên cua gen GmCHI sơ đồ hình 3.11 thây giơng ĐT 51 DT84 phân bơ hai nhanh khac Điêu co liên quan gi đên sư khac biêt vê ham lương isoflavone giưa hai giông ĐT 51 DT 84 vấn đề cần tếp tục nghiên cưu KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI Kêt luân 1.1 Hàm lượng daidzein, genistein hat mâm ngày tuổi ba giống ĐT51, DT90 DT 84 dao đông tư 29,43 mg/100g đến 41,28 mg/100g Giơng đâu tương ĐT 51 có hàm lượng daidzein genistein hat mâm ngày tuôi cao nhât va thâp nhât la giông DT84 1.2 Gen ma hoa chalcone isomerase (GmCHI) đươc phân lâp tư mRNA giông đâu tương ĐT 51 DT 84 có kích thước 657 nucleotide, mã hóa cho 218 amino acid Hê sô tương đông vê trinh tư nucleotde cua gen GmCHI hai giông đâu tươ ng ĐT 51, DT84 97,9% tương đồng với giống đậu tương mang ma sô NM _001249093 GenBank la 98,9% Hai giơng ĐT51 DT84 có sai khác 14 vị trí nucleotde trình tự gen GmCHI 12 vị trí trình tự amino acid suy diên 1.3 Khoảng cách di truyền giống ĐT 51 DT 84 dưa trinh tư amino acid suy diên cua gen GmCHI 2,4% Đê nghi Tiêp tuc phân tch làm sáng tỏ mối liên quan khác biệt trình tự nucleotde va trinh t ự amino acid gen GmCHI vơi ham lương isoflavone cua hai giơng ĐT51 DT84 CƠNG TRINH ĐÃ CÔNG BÔ LIÊN QUAN ĐÊN LUÂN VĂN Lê Thị Hồng Trang, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2016), “Đăc đ iêm cua gen GmCHI phân lâp tư môt sô giông đâu tương khac n hau vê ham lương isoflavone” , Tạp chí sinh học 38(2), pp 236-242 DOI: 10.15625/0866-7160/v38n2.7959 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đường Hồng Dật (2008), Cây đậu tương – Thâm canh tăng suất đẩy mạnh phát triển, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương – Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Chu Hoang Mâu (2008), Phương phap phân tch di truyền đại chọn giông trông, Nxb Đai hoc Thai Nguyên Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Vu Thanh Thanh (2011), Gen đặc tnh chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội Tiếng Anh Dastmalchi M., Dhaubhadel S 2015), “Soybean chalcone isomerase: evoluton of the fold, and the diferental expression and localizaton of the gene family”, Planta 241(2), pp 507-23 Dong X., Braun E L., and Grotewold E (2001), “Functonal conservaton of plant secondary metabolic enzymes revealed by complementation of Arabidopsis flavonoid mutants with maize genes”, Plant Physiol 127, pp 46-57 10 Druka A., Kudrna D., Rostoks N., Brueggeman R., Von Wettstein D and Kleinhofs A (2003), “Chalcone isomerase gene from rice (Oryza satva) and barley (Hordeum vulgare), Physical, genetic and mutaton mapping”, Gene 302 (1-2), pp 171-178 11 Grotewold E., Peterson T (1994), “Isolaton and characterizaton of a maize gene encoding chalcone flavanone isomerase”, Mol Gen Genet 24(2), pp 1-8 12 Gutha L R., Casassa L F., Harbertson J F., Naidu R A (2010), “Modulaton of flavonoid biosynthetc pathway genes and anthocyanins due to virus infecton in grapevine (Vits vinifera L.) leaves”, BMC Plant Biol, 23(10), pp 187-196 13 Heather I McKhann and Ann M Hirsch (1994), “Isolaton of chalcone synthase and chalcone isomerase cDNAs from alfalfa (Medicago satva L.): highest transcript levels occur in young roots and root tps”, Plant Molecular Biology 24(1), pp 767-777 14 HK Kim, Jang YH , Baek IS , Lee JH , Park MJ, Kim JK (2005), “Polymorphism and Expression of Isoflavone Synthase Genes from Soybean Cultivars”, Mol Cells 19(1), pp 6773 15 JA Kim, Hong SB, Jung WS , Yu CY, Ma KH, Gwag JG, Chung IM (2007) “Comparison of isoflavones compositon in seed, embryo, cotyledon and seed coat of cooked-with-rice and vegetable soybean (Glycine max (L.)) varietes”, Food Chemistry 102 (3), pp 738– 744 16 Kimura Y., Aoki T., Ayabe S (2001), “Chalcone isomerase isozymes with diferent substrate specificities towards 6'-hydroxy- and 6'-deoxychalcones in cultured cells of Glycyrrhiza echinata, a leguminous plant producing 5- deoxyflavonoids”, Plant Cell Physiol 42(10), pp 1169-1173 17 Lyle Ralston, Senthil Subramanian, Michiyo Matsuno, and Oliver Yu (2005) Partal Reconstructon of Flavonoid and Isoflavonoid Biosynthesis in Yeast U sing Soybean Type I and Type II Chalcone Isomerases Plant Physiol 137, pp 1375 –1388 18 M Picmanov, Honys D, Koblovsk R , Lapcík O (2012), “Isoflavone synthase genes in legumes and nonleguminous plants”, Internatonal Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology, IEEE pp 344 – 347 DOI 10.1109/iCBEB.2012.257 19 Maria G Campos, Miguel P Matos, Maria T Câmara, Margarida M Cunha (2007), “The variability of isoflavones in soy seeds and the possibility of obtaining extracts for over the counter tablet preparatons that can be standardized”, Industrial Crops and Products 26(1), pp 85–92 20 N Shimada, T Aoki, S Sato, Y Nakamura, S Tabata, and S Ayabe (2003), “A Cluster of Genes Encodes the Two Types of Chalcone Isomerase Involved in the Biosynthesis of General Flavonoids and Legume-Specific 5- Deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus”, Plant Physiol 131(3), pp 941-951 21 O Yu, J Shi, AO Hession, CA Maxwell, B McGonigle, JT Odell (2005) Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed, Phytochemistry 63, pp 753–763 22 Ralston L., Subramanian S., Matsuno M., Yu O (2005), “Partal reconstruction of flavonoid and isoflavonoid biosynthesis in yeast using soybean type I and type II chalcone isomerases”, Plant Physiol 137(4), pp 1375-1388 23 Ralston L, Subramanian S, Matsuno M and Yu O (2015), “Glycine max chalcone isomerase (CHI), mRNA” GenBank ACCESSION NM_001248290 htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001248290 24 Ribeiro MLL, Mandarino JMG, Carrão-Panizzi MC, Oliveira MCN, Campo CBH, Nepomuceno AL, Ida EI (2006),“Beta-Glucosidase actvity and isoflavone content in germinated soybean radicles and cotyledon” Journal of Food Biochemistry 30, pp 453– 465 25 Sambrook J and Russell DW (2001), Molecular Cloning: A laboratory Manual, st ed Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 26 Shirley, B W., Kubasek, W L., Storz, G., Bruggemann, E., Koornneef, M., Ausubel, F M., and Goodman, H M (1995) Analysis of Arabidopsis mutants deficient in flavonoid biosynthesis, Plant J 8, pp 659-671 27 Soderlund C., Descour A., Kudrna D., Bomhoff M., Boyd L., Currie J., Angelova A., Collura K., Wissotski M., Ashley E., Morrow D., Fernandes J., Walbot V., Yu Y (2009), “Sequencing, mapping, and analysis of 27,455 maize full-length cDNAs”, PLoS Gene 5(11), pp 740-747 28 Terai Y, Fujii I, Byun S H., Nakajima O., Hakamatsuka T., Ebizuka Y., Sankawa U (1996), “Cloning of chalcone-flavanone isomerase cDNA from Pueraria lobata and its overexpression in Escherichia coli”, Prot Expr Purif 8(1), pp 183–190 29 Verhoeyen, M E., Bovy, A., Collins, G., Muir, S., Robinson, S., deVos, C H R., and Colliver, S (2002), “Increasing antoxidant levels in tomatoes through modificaton of the flavonoid biosynthetic pathway” J Exp Bot 53, pp 20992106 30 Y Hasanah, TC Nisa, H Armidin, H Hanum (2015), Isoflavone content of soybean [Glycine max (L) Merr.] cultvars with diferent nitrogen sources and growing season under dry land conditions Journal of Agriculture and Environment for International Development - JAEID 109 (1), pp – 17 31 Zhu D, Hetarachchy NS, Horax R, Chen P (2005), “Isoflavone contents in germinated soybean seeds” Plant Foods Hum Nutr 60(3), pp 147-51 32 htp://www.gos.gov.vn 33 htp://faostat.fao.org ... Xuất phát từ lý , đề tài luận văn thạc si lựa chọn thực là: Nghiên cứu đặc điêm gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ đậu tương Mục têu nghiên cứu Phân tch đặc điểm gen mã hóa chalcone synthase... Soderlund cun ̃ g phân lập gen CHI1 từ mRNA ngô với chiều dài 1080 bp [27] Terai cs nghiên cứu phân lập gen CHI từ cDNA sắn dây Pueraria lobata với kích thước gen 675 bp mã hóa polypeptde 225... kDa) CHI3 với mã số AB073787, chiều dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid (24,2 kDa) [20] Năm 2005, Ralston phân lập gen CHI1A từ mRNA đậu tương thấy gen có chiều dài 1157 bp, mã hóa cho 128 amino