Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l ) ( Luận án tiên sĩ)Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l ) ( Luận án tiên sĩ)Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l ) ( Luận án tiên sĩ)Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l ) ( Luận án tiên sĩ)Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l ) ( Luận án tiên sĩ)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:GS.TS LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Một tượng thay đổi môi trường ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển thực vật tình trạng hạn.Hạn hán có ảnh hưởng xấu mức độ khác suốt trình hay giai đoạn sống thể thực vật dẫn đến làm giảm suất trồng, chậm phát triển gây chết Hiện giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán Tại Việt Nam, 7,3 – 7,4 triệu đất trồng có tới 1,5 – 1,8 triệu bị thiếu nước Nghiên cứu chất tính chống chịu trồng cho thấy tính trạng đa gen Vai trò cụ thể gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu thực vật(ví dụ P5CS, RD22…) nhiều nghiên cứu tìm hiểu phân tích Tuy nhiên, tác động yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không gen riêng rẽ biểu mà hệ thống gen liên quan kích hoạt biểu nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải Một số yếu tố kích hoạt hoạt động gen liên quan đến khả chống chịu nhân tố phiên mã (transcription factor – TF) Họnhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) họ TF đặc trưnglớn hệ genthực vật [106].Nhân tố phiên mãNAC có liên quan đếnnhiều trình sinh lý quan trọng thể thực vật [99] Nhiều gen NAC tham gia vào phản ứng với áp lực khác từ môi trường,trong có hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC thành cơng vào số lồi trồng như: lúa, lúa mỳ, thuốc lá, [54], [55],[60], [77], [87], [103], [127], [133].Trên đối tượng lạc,các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn tách dòng thành công [71], AhNAC2 sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc gen chịu hạn chuyển thành công vào Arabidopsis [72] Lạc nông nghiệp ngắn ngày trồng phổ biến giới Ở nước ta, lạc trồng khắp miền phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh yếu tố hạn chế sinh trưởng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ suất trồng có lạc Cây lạc họ đậu, thuộc nhóm chịu hạn [13].Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả chịu hạn lai giống ứng dụng công nghệ tế bào thực vật áp dụng [11], [13], [14], [15].Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo giống lạc có khả chịu khơ hạn chưa nghiên cứu nhiều.Từ lí trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.)”nhằm thử nghiệm khả chuyển gen thị tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo dòng chuyển gen phục vụ chọn giống chịu hạn lạc Ứng dụng thực tiễn nghiên cứu nhằm cải tạo lạc cải thiện khả chống chịu đối tượng trồng Mục tiêu nghiên cứu (1) Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt (2) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Tạo chuyển gen biểu protein NAC2 thuốc (3) Tạo dòng lạc chuyển gen Phân tích dòng lạc chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Phân nhóm giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả chịu hạn giai đoạn mô sẹo non (2) Phân lập, tách dòng giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên quan đến tính chịu hạn lạc (3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC2, tạo vi khuẩn A.tumefaciensmang vectortái tổ hợp chuyển vào thuốc mơ hình (4) Xác định có mặt gen chuyển NAC2 thuốc lá, đánh giá khả chịu hạn dòng thuốc chuyển gen thông qua thay đổi hàm lượng proline Phân tích biểu protein tái tổ hợp NAC2 thuốc chuyển gen (5) Phát triển hệ thống tái sinh lạc chuyển gen thị (GUS) qua mô sẹo phôi soma (6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2vào lạc, phân tích dòng lạc chuyển gen Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Những đóng góp luận án i) Tách dòng thành cơng gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt L12 ii) Thiết kế thành công vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 chuyển vào thuốc lá, kết biểu protein chuyển gen chứng minh cấu trúc thiết kế hoạt động tốt thuốc iii) Thông qua hệ thống tái sinh xây dựng, luận án tối ưu hoàn thiện quy trình chuyển gen hồn chỉnh thơng qua mô sẹo phôi soma lạc nhằm phục vụ tạo lạc chuyển gen theo mục đích cải thiện khả chống chịu với tình trạng thiếu nước từ môi trường Giống lạc LVT thử nghiệm chuyển gen GUS chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học i) Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn lạc ii) Cung cấp thông tin nhân tố phiên mã NAC gen NAC2 lạc Khả chịu hạn giống lạc nghiên cứu vai trò gen NAC2 đáp ứng với thiếu nước từ môi trường 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đánh giá khả chịu hạn lạc mức độ mô sẹo non sử dụng làm sở để đánh giá ứng dụng biện pháp cải thiện khả chịu hạn lạc Kết thu ban đầu lạc chuyển gen làm để đánh giá mức độ nhằm phục vụ nghiên cứu cải thiện tính chịu hạn lạc Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT 1.1.1 Tác động hạn đến thực vật lạc 1.1.1.1 Cây lạc Cây lạc có nguồn gốc vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ Người Bồ Đào Nha đưa lạc từ Brazin sang Tây Phi sau đến Tây Nam Ấn Độ từ kỉ XVI Sau đem trồng nhiều nước giới Ở Việt Nam, lạc du nhập từ Trung Quốc sang trồng vào khoảng kỉ XVII- XVIII [8], [13] Về mặt phân loại, lạc có tên khoa học Arachis hypogaea (L.) với 2n=40 NST Theo Krapo Vikas số tác giả khác, lạc thuộc họ cánh bướm Fabaceae, thuộc chi Arachis Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ: Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia Bersuta kohter Lồi phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia Vulgaris harz loại hình Spanish Về hình thái, lạc gồm phận rễ, thân, lá, hoa lạc Rễ lạc có rễ cọc rễ Trên rễ lạc có nhiều nốt sần tạo thành vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, lạc có khả cố định nitơ phân tử khơng khí thành đạm cung cấp cho đất trồng Những nốt sần tăng nhanh số lượng kích thước từ lạc có - đến lúc nở hoa.Thân lạc thường cao khoảng 25cm - 50cm Lá lạc loại kép hình lơng chim có chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có kèm hình dải nhọn bao quanh thân Trên thân thường có khoảng 20 Khi lạc có - thân lạc bắt đầu phân hoá mầm hoa Hoa lạc mọc từ mắt cành Mỗi vị trí có từ - hoa, lạc có - hoa nở Lạc loại tự thụ phấn nghiêm ngặt, thấy hoa nở thụ phấn xong Hoa lạc sau thụ phấn đâm tia xuống đất hình thành (thường gọi củ) Quả Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ lạc có hình trụ thuôn thắt lại hạt, vỏ cứng có gân mạng Mỗi có - hạt Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen trắng [13] Theo thời gian sinh trưởng lạc, người ta chia làm giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày) Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển lạc từ 240C - 330C Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp phải 120C, từ 150C hạt lạc bắt đầu nảy mầm tốt, 170C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%, độ ẩm thấp 60% kéo dài thời gian nảy mầm hạt không nảy mầm độ ẩm đất 40% - 50% Đất trồng lạc lí tưởng phải đất nước nhanh, chân đất nhẹ, thống, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi lượng chất hữu vừa phải tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất sinh trưởng, hình thành tốt, độ pH đất từ 6-7 thích hợp [13] Cây lạc coi trồng có hiệu kinh tế cao có giá trị đa dạng mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt công nghiệp Diện tích trồng lạctập trung nhiều vùng Thanh Hố, Nghệ An, Hà Tĩnh tới đồng trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình) Trên thực tế, diện tích trồng lạc nước ta nhỏ phân tán, trừ vài vùng lạc tập trung Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá) Gần lạc khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt nơi đất bạc màu, thoái hoá vùng trung du đồng Bắc Bộ, dải đất ven biển từ Thanh Hố chạy dài tới giáp Đơng Nam Bộ,… trồng lạc Nhiều vùng đất, miền Nam trồng vụ lạc năm [13] 1.1.1.2 Tác động hạn đến thực vật Hạn yếu tố cực đoan phi sinh học quan tâm đến nhiều Hiện tượng khô hạn xảy môi trường đất khơng khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu không cạnh tranh để lấy nước vào tế bào Trong trường hợp này, tác động mơi trường bên ngồi lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên phát triển thực vật, dẫn đến hủy hoại cối mùa[7], [23], [27], [36] Các yếu tố bất lợi môi trường là: nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết khí hậu.Khái niệm hạn dùng để tình trạng Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nước Khả thực vật giảm thiểu mức tổn thương thiếu hụt nước gây gọi tính chịu hạn [7] Xu thayđổi khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy nhiềunơi, nguyên nhân làm giảm suất trồng [94] Theo FAO, ước tính có 70% tiềm suất bị điều kiện bất lợi môi trường sâu bệnh hại, quốc gia có nềnnơng nghiệp phát triển Hiện giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45] Tại Việt Nam, 7,3-7,5 triệu đất trồng có tới 1,5-1,8 triệu thiếu nước Khi gặp hạn, trạng thái chất nguyên sinh tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hố lý chất ngun sinh tính thấm, mức độ thuỷ hố keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối ảnh hưởng đến trình trao đổi chất bình thường thể Hạn ảnh hưởng xấu đến trình hình thành diệp lục, phá hoại lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khống rễ, dẫn đến tình trạng thiếu nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trình trao đổi tổng hợp chất hữu khác thể thực vật [28], [36], [45] Để chống khơ hạn, giữ khơng bị nước, giảm diện tích lá, rút ngắn chu kì sống.Bất kỳ nước dẫn đến tượng thiếu hụt nước tế bào Nước vừa nguyên liệu, vừa môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy Vì vậy, vi phạm chế độ nước ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng phát triển Về tác động hạn đến thực vật, nhà khoa học tập trung nghiên cứu theo hướng: khảo sát tính chịu hạn đối tượng thực vật điều kiện tự nhiên đồng ruộng điều kiện nhân tạo phòng thí nghiệm Nhiều trồng ngơ, lúa, đậu tương, lạc…đã nhà nghiên cứu đánh giá, khảo sát đặc tính chịu hạn thơng qua điều kiện tự nhiên đồng ruộng Một phương pháp sử dụng chủ động gây thiếu nước tiến hành nghiên cứu phản ứng thể thực vật điều kiện [5].Khi gặp hạn, lạc chịu ảnh hưởng nặng nề đến trình sinh trưởng phát triển Khi tiến hành nghiên cứu tự nhiên phương pháp gây hạn nhân Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tạo, nhận thấy thiếu hụt nước thời kì nụ hoa làm giảm diện tích lá, làm giảm sút cường độ quang hợp lá, giảm khả đậu khối lượng chắc, giảm hàm lượng lipid hạt lạc [8].Những quan sát cho thấy, điều kiện thí nghiệm gây thiếu nước thời kì hoa làm giảm nghiêm trọng số hoa, đợt hoa hoa nở rộ khơng hình thành được, thời gian hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm q trình thụ phấn bị cản trở [13] Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động hạn số giai đoạn phát triển đối tượng thực vật khác mô sẹo, hạt nảy mầm, non lá…Trên giới Việt Nam có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá tác động hạn nâng cao tính chịu hạn trồng mức độ in vitro ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],… Nhiều nghiên cứu sử dụng PEG, sorbitol, manitol… tác nhân gây khô hạn môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động hạn lên thực vật PEG hợp chất có lực lớn với nước, đưa vào mơi trường ni cấy, khơng ngăn cản rễ hút nước mà chiếm nước từ rễ cây, khiến nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67] Như thấy, mức độ ảnh hướng yếu tố cực đoan, có hạn đến khả phản ứng trồng rõ rệt Hiện tượng nước cục gây thiệt hại cho nhóm nhỏ, hạn hán kéo dài gây thiệt hại cho nhiều loại trồng, ảnh hưởng đến suất chất lượng Các lồi thực vật khác có khả chống chịu khác với yếu tố cực đoan phụ thuộc vào chất di truyền từ bao hệ chúng Vì vậy, có chống chịu tồn tại, có bị chết Ngay loài, cá thể khác phản ứng mức độ không hoàn toàn [7] 1.1.1.3 Tác động hạn đến lạc Cây lạc đượctrồng trên35,5triệu ở82 quốc giatrên giới Hơn nửa sốkhu vực sản xuất, chiếm70% diện tích trồnglạcthuộcvùng khơ hạnvà bán khơ hạn;ở nơinày, lạc thường xuyên chịuáp lựchạn hánvới thời gianvà cường độkhácnhau[50], [79], [92], [104] Dự kiến giá trị tổn thấthàng nămtrong sảnxuấtlạc tương đương vớihơn 520triệu USD gây rabởi hạn[39], [40] Tại Hoa Kỳ,cây lạc Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 10 đóng góphơn 4tỷUSD cho kinh tếcủa đất nướcmỗi năm Tại đây, phần lớncây lạc trồng dướiđiều kiệnnước trờivàchỉcómột diện tíchhạn chếđược tưới tiêu[39] Ở châu Ávà châu Phi, lạcđược trồngtrong điều kiệnnước trờitrongmùa mưa bịhạn hánliên tụcdolượng mưa xảy ratạibất kỳ thời điểm nàotrong chu kỳsống trồng [40].Ở Việt Nam, sản xuất lạc phân bố tất vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích cơng nghiệp ngắn ngày [13] Ảnh hưởng hạn vớicây lạc thể theo nhiều cách, ảnh hưởng đến cảsố lượng chất lượng trồng Thâm hụt nước, tùy thuộc vào thời gian xảy ra, nguyên nhân gây tượng giảm đáng kể suất lạc cách tác động lên trình sinhlýnhư cố định đạm, quang hợp, hấp thu canxi cho phát triển vỏ quả[50], [79].Khi lạc gặp hạn làm độ ẩm từ dẫn đến làm giảm hoạt độngsinh lý hạt, bên cạnh đóảnh hưởng hạn hán làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng protein hạt lạc[39].Hạn làm ảnh hưởng đến lipid màng tế bào, phản ứng quang hợp [92],quá trình trao đổi chất, tăng trưởng suất lạc[39].Thiếu hụt độ ẩmlàm cản trở trình hình thành nốt sần họ đậu Có nhiều chứng cho thấy,quá trình hấp thụ N, P K lạc bị giảm hạn hán[39] Hạnđãảnh hưởngxấu đến cácmối quanhệ vềnước, quang hợp, dinh dưỡng khoáng, trao đổi chấtvà tăng trưởng lạc.Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm giảm hàm lượng chất diệp lục a, b diệp lục tổng số Sự sụt giảm chất diệp lục ức chế tổng hợp chất diệp lục.Tích lũy hàm lượng chất khơ bị giảm tình trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92] Căng thẳng nướcthườngxuyêndẫn đếnthay đổivề giải phẫu họcnhưgiảmkích thướccủa tế bàovà khoảng gianbào, vách tế bào dày vàphát triển hơncủamơbiểu bì, giảm kích thước thay đổi hệ rễ[40], [92] Sự thoát củacác chất hòa tanlàkết củahiện tượng tổn thươngmàng tế bào Đây phản ứngthông thườngcủamôcây lạcdưới ảnh hưởng số điều kiện bất lợi từ môi trường nhiệt độthấphoặc cao, độ ẩm đấtthấp hoặcđộ mặn đấtcao Nhiều nghiên cứu đãchỉ rằng,canxilà yếu tố cần thiếtđể Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... thuật chuyển gen nhằm tạo giống l c có khả chịu khơ hạn chưa nghiên cứu nhiều.Từ l trên, tiến hành đề tài: Nghiên cứu phân l p chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn l c (Arachis hypogaea L. ) nhằm... gen biểu protein NAC2 thuốc ( 3) Tạo dòng l c chuyển gen Phân tích dòng l c chuyển gen Nội dung nghiên cứu ( 1) Phân nhóm giống l c nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh giá khả chịu hạn. ..2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– NGUYỄN THỊ THU NGÀ NGHIÊN CỨU PHÂN L P VÀ CHUYỂN GEN NAC2 LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY L C (Arachis hypogaea L. ) Chuyên ngành: