ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ MỸ DUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA HAI LỒI ĐỊA Y LOBARIA ORIENTALIS VÀ DENDRISCOSTICTA PLATYPHYLLOIDES (LOBARIACEAE) Ngành: Hóa hữu Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỌC Tp Hồ Chí Minh năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG - HCM Người hướng dẫn khoa học: HDC: GS TS Nguyễn Kim Phi Phụng HDP: GS TS Jacques Mortier Phản biện 1: PGS TS Trần Hùng Phản biện 2: PGS TS Lê Tiến Dũng Phản biện 3: PGS TS Hà Diệu Ly Phản biện độc lập 1: PGS TS Nguyễn Thị Hoàng Anh Phản biện độc lập 2: TS Võ Thị Ngà Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp tại: trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM, vào hồi 30 ngày 11 tháng 06 năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU BỐ CỤC LUẬN ÁN NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Trích ly lập hợp chất 2.1.1 Điều chế loại cao 2.1.2 Trích ly, lập hợp chất từ loài địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides 2.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế bốn dòng tế bào ung thư CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết khảo sát cấu trúc hóa học 3.1.1 Khảo sát cấu trúc hóa học lobarientalone A (LOBA 8) 3.1.2 Khảo sát cấu trúc hóa học lobarientalone B (LOBA 28) 12 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hóa học lobariether A (LOBA 2) 13 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hóa học lobariether B (LOBA 12) 14 3.1.5 Khảo sát cấu trúc hóa học lobariether C (LOBA 6) 15 3.1.6 Khảo sát cấu trúc hóa học lobariether D (LOBA 23) 16 3.1.7 Khảo sát cấu trúc hóa học lobariether E (LOBA 26) 17 3.2 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 18 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 18 Kết khảo sát thành phần hoá học 18 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học 21 Các hướng nghiên cứu 22 Cấu trúc hoá học hợp chất cô lập 22 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 24 MỞ ĐẦU Ðịa y dạng cộng sinh hai loài: nấm tảo Trong địa y, thành phần nấm thường nấm túi (ascomycetes), có nấm đảm (basidiomycetes); thành phần tảo thường tảo lục, vi khuẩn lam Trong đó, thành phần nấm đóng vai trò cung cấp nước muối khống cho tảo Còn tế bào tảo phân tán khuẩn ty nấm có vai trò cung cấp hợp chất hữu cho nấm thông qua quang hợp Sự tương tác gọi cộng sinh Nhờ khả mà địa y thích nghi nhiều nơi phân bố rộng rãi giới Ðịa y mọc thân cây, đất đá Các acid hữu tiết thay đổi theo loài địa y thường dùng để định danh địa y Ðịa y tăng trưởng với tốc độ chậm Địa y dạng vảy tăng trưởng từ 0.1 mm đến 10 mm /1 năm, địa y dạng tăng trưởng từ đến cm hàng năm Ðịa y dễ bị tổn hại chất ô nhiễm khơng khí xem sinh vật thị chất lượng khơng khí Địa y phát triển với nhiều dạng, dựa vào hình dạng phát triển địa y mà chúng phân thành loại khác Thường có loại chính: crustose, foliose fructicose Từ xa xưa, địa y sử dụng nhiều sống người như: làm thức ăn cho người động vật, làm thuốc nhuộm vải, làm mỹ phẩm, hay làm thuốc chữa số bệnh ho, chàm, bệnh phổi …Bên cạnh đó, hợp chất sản sinh từ địa y biết đến có khả kháng oxy hố, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư … Lobariaceae họ bao gồm lồi địa y có tán rộng, đường kính lên đến 50 cm Lobariaceae có gần khoảng 800 lồi chia thành chi - Chi Sticta - Chi Pseudocyphellaria - Chi Lobaria Theo Robert Lucking, chi Dendriscosticta chi phân chia Theo đó, chi Dendriscosticta phân nhóm thuộc nhóm địa y Sticta wrightii, thuộc chi Sticta Hiện nay, giới có nghiên cứu hố học lồi địa y thuộc chi Lobaria, chưa có nghiên cứu chi Dendriscosticta Còn Việt Nam chưa có nghiên cứu hố học chi Vì mục tiêu luận án khảo sát thành phần hoá học hai loài địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides Kết đạt luận án góp phần làm sáng tỏ thêm hóa – thực vật chi Lobaria Dendriscosticta Bên cạnh đó, thử nghiệm hoạt tính sinh học thực hợp chất tinh khiết lập được, góp phần nâng cao giá trị ứng dụng địa y khảo sát Chúng chọn thử nghiệm hoạt tính gây độc bốn dòng tế bào ung thư là: ung thư vú (MCF–7), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI-H 460) ung thư gan (Hep-G2) thử nghiệm thực Việt Nam BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 161 trang, với phần nội dung 87 trang phân thành phần sau: Chương 1: Tổng quan (18 trang), Chương 2: Thực nghiệm (8 trang), Chương 3: Kết bàn luận (44 trang), Kết luận kiến nghị (4 trang), Tài liệu tham khảo (8 trang, với 73 tài liệu tham khảo) Riêng phần Phụ lục có 60 trang gồm 119 phổ 1D 2DNMR, phổ MS Toàn luận án có 15 bảng, 26 hình ảnh sơ đồ Danh mục cơng trình với riêng, gồm 01 báo đăng tạp chí quốc tế (Journal of Natural Products), 01 báo đăng tạp chí chuyên ngành nước (Tạp chí Khoa Học Công Nghệ) NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Chương trình bày nghiên cứu trước tác giả nước, nội dung: mô tả thực vật, nghiên cứu dược học nghiên cứu hóa học Cho đến có khoảng 20 tài liệu tham khảo báo cáo thành phần hoá học hoạt tính sinh học số hợp chất lập từ chi Lobaria, số tập trung loài địa y Lobaria pulmonaria (dân gian thường gọi cỏ phổi) Các tài liệu báo cáo dịch chiết methanol loài địa y Lobaria pulmonaria có khả kháng viêm, giảm sưng kháng oxy hố Các lồi địa y khác L isidiosa, L kurokawae, L retigera,… sử dụng thuốc dân gian điều trị bệnh chàm, viêm khớp, bệnh phổi Trong có tài liệu nói thành phần hố học chi Sticta, chưa có tài liệu báo cáo chi Dendriscosticta CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM Chương liệt kê hóa chất thiết bị thí nghiệm, với quan đo loại phổ thực thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.1 TRÍCH LY VÀ CƠ LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.1.1 Điều chế loại cao Hai loài địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides thu hái vào khoảng tháng – năm 2012 già phát triển rừng quốc gia Bidoup thuộc tỉnh Lâm Đồng nhận danh Tiến sĩ Robert Lucking (Bộ môn Thực vật Bảo tàng Field, quận Illinois, Mỹ) Mẫu tiêu lưu trữ Bộ mơn Hố hữu cơ, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ký hiệu mẫu US-B034 (Lobaria orientalis (Asahina) Yoshim), US-B035 (Dendriscosticta platyphyloides (Nyl.)) Mẫu cắt nhỏ, sấy khô, xay nhuyễn trích ly methanol theo phương pháp ngâm dầm nhiệt độ phòng, dung dịch lọc qua giấy lọc thu hồi dung môi áp suất thấp, có cao thơ methanol Phần cao thơ methanol tiến hành sắc kí cột silica gel giải ly với hệ dung mơi khác có độ phân cực tăng dần, thu cao tương ứng Hình 1: Lobaria orientalis (Asahina) Yoshim (trái) Dendriscosticta platyphyloides (Nyl.) Moncada & Lücking (phải) 2.1.2 Trích ly, lập hợp chất từ hai loài địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphyloides Việc trích ly lập thực sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường pha đảo RP-18 kết hợp với sắc ký lớp mỏng 2.2 Thử nghiệm hoạt tính ức chế in vitro bốn dòng tế bào ung thư người hợp chất lập từ hai lồi địa y khảo sát Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại bốn dòng tế bào ung thư (Hela, MCF-7, Hep-G2 NCI-H460) hợp chất tinh thực nồng độ 100 g/mL, sử dụng chất nhuộm sulforhodamine B (SRB) chất chứng dương camptothecin Mẫu gửi thử nghiệm Bộ môn Di truyền Khoa Sinh Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên 227 đường Nguyễn Văn Cừ Quận 5, TP Hồ Chí Minh CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CẤU TRÚC HĨA HỌC Từ lồi địa y nghiên cứu, 31 hợp chất cô lập, có hợp chất Cấu trúc hóa học hợp chất cô lập xác định cách phân tích liệu phổ nghiệm IR, MS, 1D 2D–NMR, phổ CD, lực triền quang, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, trình bày chi tiết luận án Các hợp chất phân loại theo nhóm, sau: Nhóm 1: Các hợp chất thơm đơn vòng (10 hợp chất biết) Nhóm 2: Depside (2 hợp chất biết) Nhóm 3: Depsidone (3 hợp chất: biết) Nhóm 4: Diphenyl ether (5 hợp chất mới) Nhóm 5: Triterpenoid (6 hợp chất biết) Nhóm 6: Steroid (3 hợp chất biết) Nhóm 7: Hợp chất chứa nitrogen (2 hợp chất biết) Quyển tóm tắt luận án trình bày khảo sát cấu trúc hóa học vài hợp chất depside diphenyl ether 3.1.1 Khảo sát cấu trúc hoá học lobarientalone A (LOBA 8) LOBA cô lập từ phân đoạn EA2-1 loài điạ y Lobaria orientalis  [𝛼]25 𝐷 = + 267 (c = 0.002, MeOH)  Khối phổ: HR ESI MS (ghi nhận ion dương): m/z 425.0842 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho C20H18O9 + Na, 425.0849)  ECD () (0.02 mg/mL, MeOH) 320 (1.2), 300 (2.1), 283 (2.5), 250 (1.2) nm  Phổ 1H,13C-NMR: Trình bày bảng 3.1 Hợp chất lobarientalone A (LOBA 8) lập dạng bột vơ định hình màu trắng Khối phổ phân giải cao HR ESI MS cho mũi ion phân tử giả m/z 425.0842 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR cho thấy có diện nhóm methyl [H 2.30, 2.53 ], nhóm methoxy [H 3.75, 3.94], nhóm methylene có gắn nguyên tử oxygen [H 4.80 4.99], hai proton methine [H 6.67 6.82] Kết hợp với phổ 13C-NMR HSQC cho thấy LOBA có chứa 20 carbon bao gồm nhóm methyl (C 9.3, 21.8), sáu carbon bậc bốn (C 108.1, 113.9, 118.1, 121.0, 139.1, 145.7), năm carbon sp2 có gắn oxygen (C 131.9, 150.0, 152.4, 159.2, 161.6), and hai carbon carbonyl (C 161.8, 169.8) Các liệu phổ tương tự liệu phổ hợp chất LOBA (một depsidone biết, phần biện luận cấu trúc hợp chất trình bày luận án), ngoại trừ có thay nhóm formyl (H 10.50; C 187.0) LOBA nhóm hydroxymethylene (H 4.80, 4.99; C 54.0) LOBA Phổ HMBC (Hình 2) cho thấy tương quan proton nhóm methylene với ba tín hiệu carbon C 118.1 (C-11), 159.2 (C-11a), 161.6 (C-10) Kết hợp với khối phổ phân giải cao HR ESI MS giúp xác nhận cấu trúc hoá học hợp chất LOBA CH3 O H3C 11a 11 3a 12a O 1a H 10 H3CO OH 5a 7a H O 13 CH2 HO O HMBC O OCH3 Hình 2: Vài tương quan HMBC LOBA Các hợp chất depsidone diphenyl ether với vòng B có gắn vòng γ-butyrolactone lập nhiều loài địa y khác Tuy nhiên, cấu hình tuyệt đối carbon thủ tính vòng γbutyrolactone lại chưa xác định Vì thế, hợp chất depsidone diphenyl ether lập từ lồi địa y khảo sát, tiến hành đo phổ ECD, đồng thời kết hợp với so sánh liệu phổ ECD hợp chất có cấu trúc tương tự mang vòng γ-butyrolactone, để xác định cấu hình tuyệt đối hợp chất depside diphenyl ether Phổ ECD hợp chất LOBA (Hình 2) cho hiệu ứng Cotton âm giá trị bước sóng () 320 (1.2), 300 (2.1), 283 (2.5), and 250 (1.2) nm Trong đó, giá trị phổ ECD hợp chất vermistatin, (ECD (Δε) 327 (+1.72), 315 (+1.28), 302 (+0.80) nm), rubralide C (ECD (Δε) 292 (+1.59), 276 (+1.85) nm), talaromycolide A (ECD (Δε) 266 (+0.65), 285 (+0.45) nm) có cấu trúc tương tự vòng B mang thêm vòng γ-butyrolactone hợp chất depsidone diphenyl ether, cho hiệu ứng Cotton dương có cấu hình (R) carbon acetal Vì thế, cấu hình tuyệt đối carbon acetal (C-1) hợp chất LOBA đề nghị (S) Các hợp chất có cấu trúc tương tự LOBA 2, 6, 12, 23, 26 28 có phổ ECD cho hiệu ứng Cotton âm (Hình 3), đề nghị hợp chất có cấu hình (S) LOBA LOBA LOBA LOBA 12 -1 -3 -5 20 LOBA 28 LOBA 23 LOBA 26 10 -10 -20 200 250 300 350 400 450 200 250 300 350 400 450 Hình Phổ ECD hợp chất depsidone LOBA 8, 28 diphenyl ether 2, 6, 12, 23, 26 10 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H 13C NMR depsidone biết (LOBA 7) depsidone LOBA 28 Position LOBA (CDCl3) δH, J (Hz) 6.81, s LOBA 28 (DMSO–d6) δC δH, J (Hz) 103.0 6.95, s δC LOBA (CDCl3) δH 95.4 6.40, s δC 103.1 1a 139.1 138.0 138.8 169.8 166.6 169.7 3a 108.1 109.0 107.9 152.4 151.6 152.6 121.0 120.4 121.3 5a 150.0 148.3 149.6 161.8 161.7 160.9 7a 113.9 112.7 114.5 145.7 144.3 151.5 6.67, s 111.1 6.95, s 111.6 6.74, s 112.1 10 161.6 161.6 163.7 11 118.1 118.5 115.1 11a 159.2 159.0 163.0 12a 131.9 135.9 132.2 4.80, d (12.0) 13 4.61, d (9.0) 54.0 4.99, d (12.0) 51.4 10.50, s 187.0 - 3.70, s 56.8 4.80, d (9.0) 1-OCH3 3.75, s 56.4 - 10-OCH3 3.94, s 57.0 3.87, s 56.3 3.97, s 58.0 5-CH3 2.30, s 9.3 2.18, s 9.6 2.30, s 9.3 8-CH3 2.53, s 21.8 2.45, s 20.9 2.56, s 22.4 4-OH 7.86, s - - 7.90, s - 10.04, s 11 3.1.2 Khảo sát cấu trúc hoá học lobarientalone B (LOBA 28) Hợp chất LOBA 28 lập từ phân đoạn EA3-3 lồi địa y Lobaria orientalis  [𝛼]25 𝐷 = + 248 (c = 0.002, MeOH)  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương) m/z 371.0772 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho [C19H15O8 + H]+, 371.0767)  ECD () (0.1 mg/mL, MeOH) 310 (13.0), 295 (17.0), 270 (7.0), 240 (7.0) nm  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày bảng 3.1 So sánh liệu phổ 1H 13C NMR hợp chất LOBA 28 nhận thấy có tương đồng, hai hợp chất mang vòng A B, với vòng B mang thêm vòng γ-butyrolactone, ngoại trừ biến tín hiệu nhóm methoxy Trong phổ HMBC (Hình 4) cho thấy tín hiệu H-1 (δH 6.95) cho tương quan với carbon methylene mang oxygen (δC 51.4) Điều chứng tỏ có hình thành liên kết carbon acetal (C-1) với carbon methylene (C-13) LOBA nối với nhau, thông qua cầu nối oxygen để tạo nên cấu trúc hợp chất LOBA 28 Khối phổ phân giải cao HR ESI MS cho mũi ion phân tử giả m/z 371.0772 [M+H]+ giúp xác nhận lại cấu trúc hợp chất LOBA 28 Hợp chất LOBA 28 -orcinol depsidone đặt tên lobarientalone B O H3C H H3CO O 11 H2C 3a 1a 13 O OH 12a 11a 10 5a 7a CH3 O O HMBC O H Hình 4: Vài tương quan HMBC LOBA 28 12 3.1.3 Khảo sát cấu trúc hoá học lobariether A (LOBA 2) Hợp chất LOBA cô lập từ phân đoạn EA2-1 loài địa y Lobaria orientalis  [𝛼]25 𝐷 = + 211 (c = 0.002, MeOH)  Khối phổ: HR ESI MS (ghi nhận ion dương) m/z 425.0815 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho C20H18O9 + Na, 425.0849)  ECD ()(0.02 mg/mL, MeOH) 320 (2.2), 300 (3.1), 278 (3.9), 250 (2.9) nm  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày bảng 3.2 3.3 Dữ liệu phổ LOBA 28 cho tín hiệu tương tự nhau, ngoại trừ có xuất thêm nhóm methoxycarbonyl (δH 3.76 δC 52.4) Phổ HMBC (Hình 5) cho thấy có tương quan tín hiệu proton methoxy với carbon carbonyl (C-7) giúp xác nhận vị trí nhóm methoxy gắn C-7 Điều chứng tỏ liên kết ester C-7 bị phá vỡ để mang nhóm methoxy hình thành nên hợp chất diphenyl ether LOBA Ngồi ra, có tương quan proton nhóm methylene (δH 4.58, 1H, d, 12 Hz 5.04 , 1H, d, 12 Hz ) với carbon acetal (δC 96.5) Đồng thời khối phổ phân giải cao cho tín hiệu mũi ion phân tử giả m/z 425.0815 giúp xác nhận có hình thành cầu nối oxygen nhóm methylene (C-13) carbon acetal (C-9') Các tương quan lại phổ HMBC giúp xác nhận vị trí nhóm lại LOBA CH3 H H3CO H 2C O O C O 9' OCH3 OH 5' 4' 3' 6' 1' 2' CH3 HMBC OH O 7' 8' O Hình 5: Vài tương quan HMBC LOBA 13 3.1.4 Khảo sát cấu trúc hoá học lobariether B (LOBA 12) Hợp chất LOBA 12 cô lập từ phân đoạn EA2-2 loài địa y Lobaria orientalis  [𝛼]25 𝐷 = + 282 (c = 0.002, MeOH)  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion âm) m/z 433.1129 [M-H]- (tính tốn lý thuyết cho [C21H22O10 – H], 433.1135)  ECD ()(0.02 mg/mL, MeOH) 320 (1.3), 300 (1.8), 285 (2.1), 250 (1.5) nm  Phổ 1H,13C-NMR: Trình bày bảng 3.2 3.3 H CH3 OCH3 HO O A H3CO HO CH2 CH3 OH 4' O H3CO B 2' 6' 9' 7' O O HMBC H Hình 6: Vài tương quan HMBC LOBA 12 LOBA 12 lập có dạng dầu màu vàng Khối phổ phân giải cao HR ESI MS cho mũi ion phân tử giả m/z 433.1129 [M-H]- ứng với công thức phân tử C21H22O10 Phổ 1H-NMR LOBA 12 cho thấy có tương đồng với LOBA ngoại trừ có xuất thêm tín hiệu nhóm –OCH3 (δH 3.11, 3H, s) LOBA 12 proton acetal methine (δH 5.30, 1H, s, H-9') bị dịch chuyển đến vùng từ trường cao so với LOBA (Bảng 3.2) Phổ 13C NMR LOBA 12 cho thấy xuất thêm tín hiệu nhóm –OCH3, đồng thời tín hiệu carbon acetal methine C-9' bị thay đổi so với LOBA Sự thay đổi giúp đưa giả thuyết: cầu nối oxygen LOBA bị bẻ gãy, mang thêm nhóm –OCH3 để hình thành nên hợp chất LOBA 12 Tương quan HMBC LOBA 12 (Hình 6) cho thấy tương quan proton nhóm methoxy với carbon acetal methine (C-9'), giúp xác nhận 14 vị trí nhóm methoxy C-9' Bên cạnh tương quan proton nhóm methylene với carbon δC 152.5 (C-2), 119.6 (C-3), vả 159.8 (C-4) giúp xác nhận cấu trúc LOBA 12 Hợp chất diphenyl ether mới, đặt tên lobariether B 3.1.5 Khảo sát cấu trúc hoá học lobariether C (LOBA 6) Hợp chất LOBA cô lập từ phân đoạn EA2-2 loài địa y Lobaria orientalis  []25D +286 (c=0.002, MeOH)  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương) m/z 495.1286 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho C24H24O10+Na, 495.1267)  ECD ()(0.02 mg/mL, MeOH) 320 (1.2), 300 (1.7), 285 (1.9), 230 (1.9) nm  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày bảng 3.2 3.3 LOBA cô lập có dạng dầu màu vàng nhạt Khối phổ phân giải cao cho tín hiệu mũi ion phân tử giả với m/z 495.1286 [M + Na]+, ứng với công thức phân tử C24H24O10 So sánh liệu phổ 1H NMR LOBA 12 nhận thấy có tương đồng, ngoại trừ tín hiệu nhóm methylene LOBA 12 không thấy xuất LOBA lại có xuất tín hiệu proton nhóm methoxy H 2.31 (3H, s) tín hiệu hai proton olefin H 7.09 (1H, d, 16.5 Hz) 7.74 (1H, d, 16.5 Hz) So sánh phổ 13C NMR LOBA với LOBA 12 cho thấy biến tín carbon nhóm methylene xuất thêm tín hiệu carbon nhóm methyl (C 27.3, C-11), carbon methine C 132.1 (C9), 133.1 (C-8), carbon carbonyl C 199.8 (C-10) Phổ HMBC (Hình 7) cho thấy proton methyl H 2.31 có tương quan với carbon carbonyl C 199.8 (C-10) carbon olefin tạiC 132.1 (C-9); đồng thời hai proton olefin H 7.09 7.74 có tương quan với tương quan với carbon vòng thơm C 152.9 (C-2), 115.3 (C-3), 15 160.6 (C-4) Các tương quan giúp xác nhận vị trí nhóm vòng A LOBA Kết hợp với liệu phổ khối lượng, LOBA đề nghị diphenyl ether đặt tên lobariether C H H3CO CH3 CH3 O HO O 4' 5' 3' 6' O CH3 H H3CO OH 2' 1' 9' 7' O HMBC O 8' H3C 10 O 11 Hình 7: Vài tương quan HMBC LOBA 3.1.6 Khảo sát cấu trúc hoá học lobariether D (LOBA 23) LOBA 23 cô lập từ phân đoạn EA2-2 loài địa y Lobaria orientalis  []25D +238 (c=0.002, MeOH)  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương) m/z 497.1033 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho [C23H22O11+Na]+ 497.1059)  ECD ()(0.1 mg/mL, MeOH) 305 (6.0), 270 (6.0), 240 (6.0) nm  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày bảng 3.2 3.3 LOBA 23 cô lập có dạng dầu màu vàng nhạt So sánh liệu phổ LOBA 23 nhận thấy có tương đồng ngoại trừ biến tín hiệu nhóm methyl có thêm tín hiệu carbon carboxyl C 168.3 Phổ HMBC (Hình 8) LOBA 23 cho thấy tương quan hai proton olefin H 7.82 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8), 6.74 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-9) với carbon vòng thơm C-3 (C 113.5) carbon carboxyl C-10 (C 168.3) Bên cạnh đó, tương quan HMBC khác LOBA 23 tương tự Điều chứng tỏ nhóm methyl (C-11) LOBA biến để hình thành nên nhóm axit carboxylic (C-10) LOBA 23 Kết hợp với khối phổ phân giải cao cho tín hiệu mũi ion phân tử giả 16 với m/z 497.1033 [M + Na]+, ứng với công thức phân tử C23H22O11, LOBA 23 đề nghị diphenyl ether mới, đặt tên lobabariether D O HO O H H3CO CH3 CH3 CH3 6' O OH HMBC 2' 1' 9' H 3' 4' 5' O 7' O H3CO HO 10 O Hình 8: Vài tương quan HMBC LOBA 23 3.1.7 Khảo sát cấu trúc hoá học lobariether E (LOBA 26) LOBA 26 cô lập từ phân đoạn EA2-1 loài địa y Lobaria orientalis  []25D +208 (c=0.002, MeOH)  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương) m/z 511.1228 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho [C24H24O11+Na]+ 511.1216)  ECD ()(0.1 mg/mL, MeOH) 310 (2.5), 270 (2.5), 240 (3.0) nm  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày bảng 3.2 3.3 H H3CO CH3 CH3 O HO O 4' 5' 3' 6' O CH3 H OH 2' 1' 9' 7' O HMBC O H3CO 11 10 H3CO O Hình 9: Vài tương quan HMBC LOBA 26 LOBA 26 lập có dạng dầu màu vàng nhạt khối phổ phân giải cao cho tín hiệu mũi ion phân tử giả với m/z 511.1228 [M + Na]+, ứng với công thức phân tử C24H24O11 So sánh liệu phổ LOBA 23 17 26 nhận thấy có tương đồng, ngoại trừ việc xuất thêm tín hiệu nhóm methoxyl (H 3.76, 3H, s; C 51.7) LOBA 26 Phổ HMBC (Hình 9) LOBA 26 cho thấy có tương quan hai proton olefin H 7.93 (1H, d, J =16.5 Hz, H-8), 6.84 (1H, d, J = 16.5 Hz, H9) với carbon carbonyl C-10 (C 168.1) tương quan lại LOBA 26 tương tự LOBA 23 giúp đề nghị cấu trúc LOBA 26 diphenyl ether mới, đặt tên lobariether E 3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC Kết thử hoạt tính sinh học số hợp chất tinh trình bày bảng 3.4 Các hợp chất cho giá trị phần trăm ức chế (I%) 50% tiếp tục đem thử nghiệm để xác định giá trị IC50 Kết cho thấy hợp chất cho hoạt tính ức chế từ trung bình đến yếu bốn dòng tế bào ung thư CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Kết khảo sát thành phần hóa học Từ hai lồi địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides, cô lập 31 hợp chất (các hợp chất tìm thấy hai lồi địa y tính hợp chất), có hợp chất  Từ loài địa y Lobaria orientalis lập 24 hợp chất có hợp chất  Từ loài địa y Dendriscosticta platyphylloides, lập 13 hợp chất có hợp chất tìm thấy lồi địa y Lobaria orientalis 18 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H NMR LOBA 2, 6, 12, 23 26 (500 MHz) LOBA DMSO–d6 LOBA 12 CDCl3 LOBA CDCl3 LOBA 23 DMSO–d6 LOBA 26 CDCl3 6.97, s 4.58, d (12.0) 5.04, d (12.0) 6.64, s 4.71, d (12.0) 4.82, d (12.0) 6.68, s 6.96, s 6.68, s 7.74, d (16.5) 7.82, d (16.5) 7.93, d (16.5) 7.09, d (16.5) 6.74, d (16.5) 6.84, d (16.5) 11 2.31, s Vị trí C 9 6.15, s 5.30, s 5.22, s 5.09, s 5.21, s 4-OCH3 3.89, s 3.93, s 3.97, s 3.97, s 3.98, s 7-OCH3 3.76, s 3.41, s 3.43, s 3.28, s 3.42, s 11-OCH3 3.76, s 9-OCH3 3.11, s 3.04, s 2.91, s 7.76, s 7.78, s 9.45, s 3.04, s 2-OH 9.53, s 4-OH 10.27, s 6-CH3 2.37, s 2.34, s 2.35, s 2.27, s 2.35, s 6-CH3 2.06, s 2.20, s 2.22, s 2.08, s 2.22, s 10.51, s 19 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 13C NMR LOBA 2, 6, 12, 23 26 (125 MHz) Vị trí C 10 11 1 2 3 4 5 6 7 9 4-OCH3 7-OCH3 11-OCH3 9-OCH3 6-CH3 6-CH3 LOBA DMSO–d6 118.3 152.5 114.0 159.2 110.8 140.7 166.4 56.4 101.9 151.4 115.9 152.4 134.3 129.2 167.3 96.5 56.7 52.4 20.2 8.9 LOBA 12 CDCl3 117.7 152.5 119.6 159.8 109.4 139.7 166.8 54.4 102.6 151.9 115.3 153.2 127.1 133.7 170.2 102.2 56.3 52.1 56.8 20.7 8.1 20 LOBA CDCl3 118.5 152.9 115.3 160.6 109.8 141.2 166.4 133.1 132.1 199.8 27.3 103.1 153.4 115.2 152.1 133.5 127.7 170.1 102.2 56.4 52.2 56.3 20.9 8.1 LOBA 23 DMSO–d6 117.4 152.7 113.5 159.8 109.3 140.0 166.0 134.0 122.6 168.3 102.2 151.1 115.7 153.6 132.8 129.2 166.5 99.8 56.4 51.5 55.4 19.8 8.7 LOBA 26 CDCl3 118.1 153.1 114.9 160.4 109.5 140.9 166.3 134.0 122.6 168.1 102.9 151.8 115.2 152.6 127.4 133.3 170.1 102.1 56.2 52.1 51.7 56.2 20.7 8.0 Bảng 3.4 : Phần trăm ức chế bốn dòng tế bào ung thư số hợp chất cô lập No Kí hiệu I (%) MCF-7 HeLa NCI-H460 HepG2 STIC 86.80 ± 5.39 91.07 ± 5.39 84.61 ± 0.87 71.25 ± 2.60 LOBA 14 65.52 ± 1.80 72.20 ± 5.52 42.56 ± 3.19 25.54 ± 2.20 LOBA 21 31.62 ± 2.52 12.65 ± 7.53 15.52 ± 0.48 5.95 ± 2.56 LOBA - - 68,11 ± 5,08 - LOBA - - -8,10 ± 9,28 - LOBA 28 14.93 ± 5.91 2.28 ± 6.76 7.60 ± 4.10 - 9.47 ± 3.67 LOBA 72.44 ± 3.46 56.59 ± 3.54 59.67 ± 3.70 66.29 ± 4.25 LOBA 12 26.63 ± 5.63 19.58 ± 4.99 10.84 ± 3.87 15.67 ± 6.69 LOBA 23 - - 1,69 ± 4,49 - 10 LOBA 26 40.08 ± 4.35 32.38 ± 4.94 29.97 ± 3.95 23.17 ± 5.62 11 LOBA 93.76 ± 1.56 92.96 ± 1.86 96.02 ± 0.82 97.34 ± 2.15 12 LOBA 19 31.26 ± 3.05 9.36 ± 6.45 22.15 ± 2.10 -3.40 ± 4.92 13 LOBA 25 60.54 ± 2.73 69.05 ± 2.52 49.97 ± 2.62 37.32 ± 1.06 14 LOBA 15 39.66 ± 5.05 22.09 ± 1.32 29.80 ± 1.75 25.76 ± 4.71 15 STIC 27 2.51 ± 6.78 -21.34 ± 5.77 -11.46 ± 3.86 -21.98 ± 9.40 16 LOBA 20 51.67 ± 4.52 16.32 ± 7.35 31.20 ± 0.97 1.20 ± 1.86 17 LOBA 11 59.43 ± 3.30 53.67 ± 3.31 29.51 ± 5.87 9.12 ± 4.09 45.37 ± 2.78 48.14 ± 0.67 80.75 ± 1.97 56.96 ± 1.61 Camptothecin (Chất chứng dương) Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào nồng độ 100 µg/mL (Bảng 3.4), hợp chất cho giá trị phần trăm ức chế (I%) 50% tiếp tục đem thử nghiệm để xác định giá trị IC50 Kết cho thấy hợp chất cho hoạt tính ức chế từ trung bình đến yếu bốn dòng tế bào ung thư 21 Các hướng nghiên cứu Tiếp tục khảo sát phân đoạn lại cao trích tiếp tục thử hoạt tính gây độc tế bào hợp chất lại Đồng thời tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học khác hợp chất lập như: khả kháng oxy hoá, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT CƠ LẬP ĐƯỢC Nhóm 1: Hợp chất thơm đơn vòng CH3 R2 HO CH3 CH3 OHC OH H3C COOCH3 COOCH3 HO R1 H3CO R1 R2 LOBA H COOCH3 LOBA CH3 COOCH3 LOBA 29 H COOH OCH3 OH CH3 LOBA 31 STIC R1 O HO HO OH R2 LOBA 13 LOBA 33 LOBA 34 O R1 CH3 CH2OH H HO R2 H OCH3 H CH3 O C CH3 HO STIC OH STIC 14 Nhóm 2: Depside OH CH3 O O HO OH CH3 LOBA 14 LOBA 21 R 22 OH R H COOH OH O OH Nhóm 3: Depsidone O H3C O CH3 O H3C CH3 O OH OH O O H3CO R H3CO O H3CO R LOBA CHO LOBA CH2OH (Mới) CH3 O C O H3CO H CH3 OCH3 HO O H3CO OH O O H3CO R LOBA (E)-CH=CH-CO-CH3 (Mới) LOBA 12 CH2OH (Mới) LOBA 23 (E)-CH=CH-COOH (Mới) LOBA 26 (E)-CH=CH-COOCH3 (Mới) CH3 OH O CH3 O R OCH3 OH H2C O O O O LOBA 28 (Mới) Nhóm 4: Diphenyl ether H H2C O O LOBA (Mới) Nhóm 5: Steroid OH O HO O HO LOBA O OH OH HOHO O OH LOBA 11 STIC 21 Nhóm 6: Triterpenoid OH OH HO R R R HO OH R LOBA OCOCH3 LOBA 19 H R LOBA 15 OH STIC 22 OCOCH3 23 COOH R LOBA 22 H LOBA 25 COOH Nhóm 7: Hợp chất có chứa nitrogen O O N N N N CH3 HN HN STIC 15 STIC 29 DANH MỤC CƠNG TRÌNH DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Nguyen Thi My Dung, Pham Nguyen Kim Tuyen, Jacques Mortier, Nguyen Kim Phi Phung (2016), Some triterpenoids and steroids from the lichen Lobaria orientalis, Lobariaceae Tạp chí Khoa học Công nghệ, 54(2C), 313-319 Dung M T Nguyen, Lien M T Do, Vy T Nguyen, Warinthorn Chavasiri, Jacques Mortier, and Phung P K Nguyen (2017), Phenolic Compounds from the Lichen Lobaria orientalis, Journal of Natural Product Journal of Natural Product, 80 (2), pp 261–268 Nguyễn Thị Mỹ Dung, Đỗ Thị Mỹ Liên, Jacques Mortier, Nguyễn Kim Phi Phụng (2017), Phenolic compounds from the lichen Dendriscosticta platyphylloides, Loariaceae Tạp chí Hố học Việt Nam, 55 (5e3,4), 601605 24 ... tiêu luận án khảo sát thành phần hoá học hai loài địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides Kết đạt luận án góp phần làm sáng tỏ thêm hóa – thực vật chi Lobaria Dendriscosticta Bên... trung bình đến y u bốn dòng tế bào ung thư CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Kết khảo sát thành phần hóa học Từ hai lồi địa y Lobaria orientalis Dendriscosticta platyphylloides, cô... chất (các hợp chất tìm th y hai lồi địa y tính hợp chất), có hợp chất  Từ loài địa y Lobaria orientalis lập 24 hợp chất có hợp chất  Từ loài địa y Dendriscosticta platyphylloides, lập 13 hợp chất