BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐÀO THU HỒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI CỦA MÔI TRƢỜNG PHONG PHÚ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐÀO THU HỒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI CỦA MÔI TRƢỜNG PHONG PHÚ TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Chuyên ngành: Sinh lý học Mã số: 62720107 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Trần Hải Anh PGS TS Cấn Văn Mão HÀ NỘI - 2018 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu bệnh tự kỷ 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh tự kỷ 1.3 Nguyên nhân chế bệnh sinh 1.3.1 Yếu tố di truyền 1.3.2 Yếu tố môi trường 1.3.3 Sự tương tác yếu tố di truyền yếu tố môi trường 1.3.4 Thay đổi sinh học thần kinh 1.3.5 Các thuyết khác 12 1.4 Các phƣơng pháp gây mơ hình bệnh tự kỷ 13 1.4.1 Mơ hình gây tổn thương não 14 1.4.2 Mơ hình di truyền bệnh tự kỷ 16 1.4.3 Mơ hình yếu tố mơi trường bệnh tự kỷ 19 1.5 Các tập đánh giá hành vi động vật gây mơ hình bệnh tự kỷ 25 1.5.1 Bài tập đánh giá tương tác xã hội 25 1.5.2 Bài tập đánh giá giao tiếp, thông tin liên lạc 26 1.5.3 Bài tập đánh giá hành vi lặp lại 28 1.5.4 Bài tập đánh giá triệu chứng liên quan 29 1.6 Phƣơng pháp điều trị bệnh tự kỷ 30 1.6.1 Nguyên tắc điều trị 30 1.6.2 Can thiệp hành vi 30 1.6.3 Trị liệu ngôn ngữ 31 1.6.4 Thuốc điều trị tự kỷ 31 1.7 Tác dụng môi trƣờng phong phú lên hành vi động vật gây mơ hình bệnh tự kỷ 31 1.8 Nghiên cứu bệnh tự kỷ Việt Nam 33 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 36 2.2.2 Phương tiện hóa chất 36 2.2.3 Quy trình nghiên cứu 41 2.2.4 Xử lý số liệu 46 2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 47 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49 3.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng chủng Swiss tiêm natri valproat trƣớc sinh 49 3.1.1 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh n phát triển phối hợp vận động, thăng tập mặt phẳng nghiêng 49 3.1.2 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên giao tiếp phát âm siêu âm 50 3.1.3 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hoạt động vận động há phá môi trường mở 58 3.1.4 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hoạt động tương tác xã hội mê lộ ba buồng 60 3.1.5 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hành vi liên quan đến lo lắng tập mê lộ chữ thập 63 3.1.6 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả phối hợp vận động, thăng tập rotarod 64 3.1.7 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả học tập trí nhớ không gian mê lộ nước 66 3.2 Tác dụng môi trƣờng phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mô hình thực nghiệm bệnh tự kỷ 68 3.2.1 Ảnh hưởng natri valproat liều 500 mg/kg cân nặng lên hành vi chuột nhắt trước nuôi môi trường phong phú 68 3.2.2 Tác dụng môi trường phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ phơi nhiễm natri valproat trước sinh liều 500 mg/kg cân nặng 77 Chƣơng BÀN LUẬN 90 4.1 Xây dựng mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng chủng Swiss tiêm natri valproat trƣớc sinh 90 4.1.1 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh n phát triển phối hợp vận động, thăng tập mặt phẳng nghiêng 91 4.1.2 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả giao tiếp phát âm siêu âm 93 4.1.3 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hoạt động vận động há phá môi trường mở 97 4.1.4 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hoạt động tương tác xã hội tập mê lộ ba buồng 100 4.1.5 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên hành vi liên quan đến lo lắng tập mê lộ chữ thập 102 4.1.6 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả phối hợp vận động, thăng tập rotarod 103 4.1.7 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh lên khả học tập, trí nhớ khơng gian mê lộ nước 104 4.2 Tác dụng môi trƣờng phong phú lên hành vi chuột nhắt đƣợc gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ natri valproat liều 500mg/kg cân nặng 111 4.2.1 Ảnh hưởng phơi nhiễm natri valproat trước sinh liều 500 mg/kg cân nặng lên hành vi chuột nhắt trước nuôi môi trường phong phú 112 4.2.2 Tác dụng môi trường phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự kỷ natri valproat liều 500mg/kg cân nặng 114 KẾT LUẬN 123 KIẾN NGHỊ 125 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu đề tài luận án phần số liệu đề tài nghiên cứu có tên: “Hợp tác nghiên cứu thay đổi hành vi, di truyền yếu tố nguy bệnh tự kỷ” Kết đề tài thành nghiên cứu tập thể mà thành viên Tơi chủ nhiệm đề tài tồn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài vào luận án để bảo vệ cho học vị tiến sĩ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực nhóm nghiên cứu cơng bố phần báo, cơng trình liên quan đến luận án Luận án chưa công bố Tác giả Đào Thu Hồng LỜI CẢM ƠN Hoàn thành trình học tập, nghiên cứu thực luận án, xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc, Phòng Sau đại học, Hệ Sau đại học, Bộ môn Sinh lý học - Học viện Quân y tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Bộ môn Sinh lý học - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng tạo điều kiện vật chất, tinh thần cho tham gia học tập, nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Hải Anh, PGS TS Cấn Văn Mão truyền đạt cho định hướng, tư khoa học, kinh nghiệm quý báu, giúp tháo gỡ vướng mắc q trình làm nghiên cứu hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Lê Chiến, người trực sát, giúp đỡ thực nghiên cứu, xử lý số liệu đ ng g p kiến qu áu giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn đ ng g p qu áu thầy Hội đồng chấm luận án giúp tơi hồn thiện luận án tốt Xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh, chị, bạn, em nhóm nghiên cứu đề tài giúp tơi hồn thành luận án Cảm ơn ạn è, đồng nghiệp, gia đình, chồng hai tạo điều kiện vật chất, tinh thần, cổ vũ động viên cho suốt thời gian dài học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Tác giả Đào Thu Hồng DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN STT Phần viết tắt ABA Phần viết đầy đủ Applied Behavioral Analysis Phân tích hành vi ứng dụng ASD Autism Spectrum Disorder Rối loạn phổ tự kỷ AVP Arginine vasopressin AVPR Arginine vasopressin receptor Thụ thể arginin vasopressin BDNF Brain derived neurotrophic factor Yếu tố phát triển thần kinh nguồn gốc từ não CARS Childhood Autism Rating Scale Thang chẩn đoán tự kỷ tuổi ấu thơ CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm kiểm sốt phòng ngừa ệnh tật DNA Deoxyribonucleic acid DSM Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disorders Sổ tay chẩn đoán thống kê rối loạn tâm thần 10 E12.5 Embryo 12.5 Ngày thứ 12,5 thai kỳ 11 FXS Fragile X Syndrome Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy 12 GABA Gamma aminobutyric acid 13 GARS Gilliam Autism Rating Scale Thang đánh giá tự kỷ Gilliam 14 ICD The International Classification of Diseases Bảng phân loại bệnh tật quốc tế 15 IFN Interferon 16 IL Interleukin 17 KI Knockin 18 KO Knockout 19 LPS Lipopolysaccharide 20 LTP Long-term potentiation Điện hưng phấn kéo dài 21 M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers Bảng kiểm sàng lọc tự kỷ trẻ nhỏ có sửa đổi 21 MeCP2 methyl-CpG-binding protein 23 MTC Mơi trường chuẩn 24 MTPP Môi trường phong phú 25 NLGN Neuroligin 26 NMDA N-methyl-D-aspartate 27 NX Neurexin 28 OT Oxytocin 29 OTR Oxytocin receptor 30 PND Postnatal day 31 Poly(I:C) Polyinosine:cytosin 32 PPI Prepulse inhibition Ức chế phản xạ giật 33 TSC Tuberous sclerosis Xơ cứng củ 34 V1ar Vasopressin 1a receptor Thụ thể vasopressin 1a 35 VBA Verbal Behaviour Analysis Phân tích hành vi ngơn ngữ nói 36 VPA Valproic acid/ Valproate 100 Salmond C.H., Ashburner J., Connelly A., (2005) The role of the medial temporal lobe in autistic spectrum disorders European Journal of Neuroscience, 22(3), 764–772 101 Shultz S R., MacFabe D F., Ossenkopp K P., et al (2008) Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric bacterial metabolic end-product, impairs social behavior in the rat: Implications for an animal model of autism Neuropharmacology, 54, 901–911 102 MacFabe D F (2012) Short-chain fatty acid fermentation products of the gut microbiome: implications in autism spectrum disorders Microbial Ecology in Health & Disease, 23, doi: 10.3402/mehd.v23i0.19260 103 Strömland K., Nordin V., Miller M., et al (1994) Autism in thalidomide embryopathy: a population study Developmental Medicine & Child Neurology, 36(4), 351–356 104 Teitelbaum P (2003) A propose primate animal model of autism European Child & Adollescent Psychiatry, 12, doi 10.1007/S00787-B0306-8 105 Byers S L., Wiles M V., Dunn S L., et al (2012) Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images PLoS ONE, 4(7), e35538 106 Semple B D., Blomgren K., Gimlin K., et al (2013) Brain development in rodents and humans: identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species Progress in Neurobiology, doi: 10.1016/j.pneurobio.2013.04.001 107 Crawley J N (2007) Mouse behavioral assays relevant to the symptoms of Autism Brain Pathology, 17, 448–459 108 Crawley J N (2012) Translational animal models of autism and neurodevelopmental disorders Dialogues Clinical Neuroscience, 14, 293–305 109 Wöhr M., Scattoni M L (2013) Behavioural methods used in rodent models of autism spectrum disorders: Current standards and new developments Behavioural Brain Research, 251, 5–17 110 Michetti C., Ricceri L., Scattoni M L (2012) Modeling social communication deficits in mouse models of autism Autism, S1:007 doi:10.4172/2165-7890.S1-007 111 Scattoni M L., Crawley J., Ricceri L (2009) Ultrasonic vocalizations: a tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 33(4), 508–515 112 Bechard A., Lewis M (2012) Modeling restricted repetitive behavior in animals Autism, S1:006 doi:10.4172/2165-7890.S1-006 113 Shoji H., Hagihara H., Takao K., et al (2012) T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice Journal of Visualized Experiments, (60), e3300, doi:10.3791/3300 114 Vorhees C V., Williams M.T (2006) Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory Nature Protocols, 1(2), 848–858 115 Gould T D., Dao D T., Kovacsics C E (2009) The Open Field Test In: Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice, Gould T.D (ed.), Humana Press, New York, 1–20 116 Walf A A., Frye C A (2007) The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents Nature protocols, 2(2), 322–328 117 Deacon R.M (2013) Measuring motor coordination in mice Journal of Visualized Experiments, e2609, doi:10.3791/2609 118 Ospina M B., Seida J K., Clark B., et al (2008) Behavioural and developmental interventions for autism spectrum disorder: a clinical systematic review PloS One, 3(11), e3755, doi:10.1371/journal.pone.0003755 119 Rossignol D A (2009) Novel and emerging treatments for autism spectrum disorders: A systematic review Annals of Clinical Psychiatry, 21(4), 213–236 120 Van de Weerd H A., Aarsen E L., Mulder A., et al (2002) Effects of environmental enrichment for mice: variation in experimental results Journal of Applied Animal Welfare Science, 5(2), 87–109 121 Lonetti G., Angelucci A., Morando L., et al (2010) Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice Biological Psychiatry, 67(7), 657–665 122 Oddi D., Subashi E., Middei S., et al (2015) Early social enrichment rescues adult behavioral and brain abnormalities in a mouse model of fragile X syndrome Neuropsychopharmacology, 40(5), 1113–1122 123 Nishijo M , Pham T.T , Nguyen A.T., et al (2014) 2,3,7,8- Tetrachlorodibenzo-p-dioxin in breast milk increases autistic traits of 3year-old children in Vietnam Molecular Psychiatry, 19, 1220–1226 124 Nguyễn Thị Hương Giang (2012) Nghiên cứu phát sớm tự kỷ M-CHAT 23 đặc điểm dịch tễ, lâm sàng can thiệp sớm phục hồi chức cho trẻ nhỏ tự kỷ, Luận án tiến sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội 125 Đào Thị Thu Thủy (2014) Điều chỉnh hành vi ngôn ngữ cho trẻ tự kỷ từ đến tuổi dựa vào tập chức Luận án tiến sĩ khoa học giáo dục, Viện Khoa học giáo dục Việt Nam 126 Nguyễn Thị Thanh (2014) Biện pháp phát triển kỹ giao tiếp cho trẻ tự kỷ 3-4 tuổi, Luận án tiến sĩ khoa học giáo dục, Viện Khoa học giáo dục Việt Nam 127 Ngô Xuân Điệp (2008) Nhận thức trẻ tự kỷ Tạp chí Tâm lý học, 10(115), 48–55 128 Đậu Tuấn Nam, Vũ Hải Vân (2015) Chính sách trẻ tự kỷ Việt Nam Tạp chí khoa học xã hội, 11(96), 60–67 129 Portfors C.V (2007) Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice Journal of the American Association for Laboratory Animal Science, 46(1), 28–34 130 Alman J., Sudarshan K (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat Animal Behaviour, 23, 896–920 131 Cheaha D., Kumarnsit E (2015) Alteration of spontaneous spectral powers and coherences of local field potential in prenatal valproic acid mouse model of autism Acta Neurobiologiae Experimentalis, 75(4), 351–363 132 Wöhr M., Roullet F.I., Hung A.Y., et al (2011) Communication impairments in mice lacking Shank1: reduced levels of ultrasonic vocalizations and scent marking behavior PLoS One, 6(6), e20631, doi: 10.1371/journal.pone.0020631 133 Haack B., Markl H., Ehret G (1983) Sound communication between parents and offspring In: The Auditory psychobiology of the mouse, Willott J.F and Thomas C.C (Ed.), Springfield, 57–97 134 D'Amato F.R., Scalera E., Sarli C., et al (2005) Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups? Behavioral Genetics, 35(1), 103–112 135 Wöhr M., Dahlhoff M., Wolf E., et al (2008) Effects of genetic background, gender, and early environmental factors on isolationinduced ultrasonic calling in mouse pups: an embryo-transfer study Behavioral Genetics, 38(6), 579–595 136 Kataoka S., Takuma K., Hara Y., et al (2013) Autism-like behaviours with transient histone hyperacetylation in mice treated prenatally with valproic acid International Journal of Neuropsychopharmacology, 16(1), 91–103 137 Mehta M.V., Gandal M.J, Siegel S.J (2011) mGluR5-antagonist mediated reversal of elevated stereotyped, repetitive behaviors in the VPA model of autism PLoS One, 6(10), e26077, doi: 10.1371/journal.pone.0026077 138 Sui L., Chen M (2012) Prenatal exposure to valproic acid enhances synaptic plasticity in the medial prefrontal cortex and fear memories Brain Research Bulletin, 87(6), 556–563 139 Morakotsriwan N., Wattanathorn J., Kirisattayakul W., et al (2016) Autistic-like behaviors, oxidative stress status, and histopathological changes in cerebellum of valproic acid rat model of autism are improved by the combined extract of purple rice and silkworm pupae Oxidative Medicine and Cellular Longevity, doi:10.1155/2016/3206561 140 Piochon C., Kloth A.D., Grasselli G., et al (2014) Cerebellar plasticity and motor learning deficits in a copy-number variation mouse model of autism Nature Communications, 5, 5586, doi: 10.1038/ncomms6586 141 Tran A H., Uwano T., Kimura T., et al (2008) Dopamine D1 receptor modulates hippocampal representation plasticity to spatial novelty The Journal of Neuroscience, 28(50), 13390–13400 142 Rinaldi T., Kulangara K., Antoniello K., et al (2007) Elevated NMDA receptor levels and enhanced postsynaptic long-term potentiation induced by prenatal exposure to valproic acid Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(33), 13501–13506 143 Restivo L., Ferrari F., Passino E., et al (2005) Enriched environment promotes behavioral and morphological recovery in a mouse model for the fragile X syndrome Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(32), 11557–11562 144 Renner M.J., Rosenzweig M.R (1986) Social interactions among rats housed in grouped and enriched conditions Developmental Psychobiology,19(4), 303–313 145 Favre M.R., La Mendola D., Meystre J., et al (2015) Predictable enriched environment prevents development of hyper-emotionality in the VPA rat model of autism Frontiers in Neuroscience, 9(127), doi: 10.3389/fnins.2015.00127 146 Kondo M., Gray L.J., Pelka G.J., et al (2008) Environmental enrichment ameliorates a motor coordination deficit in a mouse model of Rett syndrome - Mecp2 gene dosage effects and BDNF expression European Journal of Neuroscience, 27(12), 3342–3350 147 Yamaguchi H., Hara Y., Ago Y., et al (2017) Environmental enrichment attenuates behavioral abnormalities in valproic acid-exposed autism model mice Behavoural Brain Research, 333, 67–73 PHỤ LỤC ĐƢỜNG ĐI CỦA ĐỘNG VẬT TRONG CÁC MÊ LỘ A Chứng VPA300 VPA400 VPA500 B Chứng-C Chứng-PP VPA-C VPA-PP Hình PL 1.1 Đường động vật môi trường mở (A) Nội dung xây dựng mơ hình ệnh tự kỷ động vật (B) Nội dung đánh giá tác dụng môi trường phong phú mơ hình 1: V ng trung tâm, 2: V ng ngoại vi A Chứng VPA300 VPA400 VPA500 2a 1a B Chứng-C Chứng-PP VPA-C VPA-PP Hình PL 1.2 Đường động vật mê lộ uồng phiên (A) Nội dung xây dựng mơ hình ệnh tự kỷ động vật (B) Nội dung đánh giá tác dụng môi trường phong phú mơ hình 1: Buồng 1; 2: Buồng 2; 3: Buồng trung tâm; 1a: ồng giao tiếp uồng 1; 2a: ồng giao tiếp uồng A Chứng VPA300 VPA400 VPA500 2a 1a B Chứng-C Chứng-PP VPA-C VPA-PP Hình PL 1.3 Đường động vật mê lộ uồng phiên (A) Nội dung xây dựng mơ hình ệnh tự kỷ động vật (B) Nội dung đánh giá tác dụng môi trường phong phú mơ hình 1: Buồng 1; 2: Buồng 2; 3: Buồng trung tâm; 1a: ồng giao tiếp uồng 1; 2a: ồng giao tiếp uồng Chứng A VPA300 VPA400 VPA500 Chứng-PP VPA-C VPA-PP B Chứng-C Hình PL 1.4 Đường động vật mê lộ chữ thập (A) Nội dung xây dựng mơ hình ệnh tự kỷ động vật (B) Nội dung đánh giá tác dụng môi trường phong phú mơ hình 1: Cánh mở; 2: Cánh đ ng; 3: Trung tâm Chứng A VPA300 VPA400 VPA500 Chứng-PP VPA-C VPA-PP Ngày Ngày II III I IV Ngày B Chứng-C Ngày Ngày Ngày Hình PL 1.5 Đường động vật mê lộ nước (A) Nội dung xây dựng mơ hình ệnh tự kỷ động vật (B) Nội dung đánh giá tác dụng mơi trường phong phú mơ hình I: G c 1, II: G c 2, III: G c 3, IV: G c IV (g c trước c ến đỗ) PHỤ LỤC Bảng PL 2.1 Cân nặng chuột (gam) theo nh m, ngày tuổi chuột nhóm chứng nh m phơi nhiễm VPA trước sinh ± SD Ngày tuổi Nh m n p a.Chứng 35 2,27 ± 0,44 pa,b < 0,01 b.VPA300 31 1,88 ± 0,43 pa,c < 0,01 c.VPA400 32 1,96 ± 0,31 pa,d < 0,001 d.VPA500 30 1,65 ± 0,33 a.Chứng 35 3,54 ± 0,73 pa,b > 0,05 b.VPA300 31 3,81 ± 1,09 pa,c > 0,05 c.VPA400 32 3,40 ± 0,68 pa,d < 0,01 d.VPA500 30 2,75 ± 0,79 a.Chứng 35 5,44 ± 1,20 b.VPA300 31 5,59 ± 1,25 14 p > 0,05 c.VPA400 32 5,25 ± 1,08 d.VPA500 30 4,83 ± 1,64 a.Chứng 35 7,73 ± 2,23 b.VPA300 31 8,38 ± 1,92 21 p > 0,05 c.VPA400 32 6,83 ± 2,00 d.VPA500 30 7,01 ± 3,23 a.Chứng 35 11,15 ± 3,27 b.VPA300 31 11,99 ± 2,41 28 p > 0,05 c.VPA400 32 9,23 ± 2,83 d.VPA500 30 9,68 ± 4,10 a.Chứng 35 15,36 ± 4,65 pa,b > 0,05 b.VPA300 31 14,37 ± 2,58 35 pa,c > 0,05 c.VPA400 32 12,82 ± 4,06 pa,d < 0,05 d.VPA500 30 12,05 ± 4,65 a.Chứng 35 20,52 ± 5,72 pa,b > 0,05 b.VPA300 31 17,96 ± 3,03 42 pa,c < 0,01 c.VPA400 32 15,61 ± 5,41 pa,d < 0,01 d.VPA500 30 15,37 ± 5,72 a.Chứng 35 24,62 ± 6,14 pa,b > 0,05 b.VPA300 31 22,00 ± 3,41 49 pa,c < 0,01 c.VPA400 32 19,32 ± 6,08 pa,d < 0,05 d.VPA500 30 19,31 ± 7,35 a.Chứng 35 29,15 ± 6,80 pa,b > 0,05 b.VPA300 31 27,10 ± 4,41 56 pa,c < 0,01 c.VPA400 32 21,97 ± 7,10 pa,d < 0,01 d.VPA500 30 21,68 ± 7,85 p pa,b >0,05; pa,c < 0,01; pa,d < 0,05 Bảng PL 2.2 Cân nặng chuột (gam) theo nh m, ngày tuổi chuột nhóm chứng mơ hình VPA500 nuôi MTC MTPP p Ngày tuổi Nh m n ± SD 14 21 28 35 42 49 56 a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP a.Chứng-C Chứng-PP c.VPA-C d.VPA-PP p 69 2,14 ± 0,44 72 1,96 ± 0,41 66 1,88 ± 0,37 65 2,03 ± 0,29 69 3,54 ± 0,75 72 3,36 ± 0,71 66 3,22 ± 0,89 65 3,52 ± 0,75 69 5,71 ± 1,39 72 5,76 ± 1,05 66 5,72 ± 1,77 65 6,08 ± 0,69 69 8,06 ± 2,28 72 8,08 ± 1,28 66 8,13 ± 3,15 65 8,82 ± 1,46 69 12,14 ± 3,18 72 12,12 ± 2,45 66 11,92 ± 4,09 65 12,78 ± 2,41 69 16,51 ± 4,59 72 16,73 ± 2,98 66 14,86 ± 5,11 65 17,13 ± 3,70 69 20,86 ± 5,10 72 21,24 ± 3,37 66 17,92 ± 5,76 65 22,16 ± 4,13 69 24,91 ± 5,78 72 25,74 ± 3,53 66 21,45 ± 6,69 65 26,09 ± 4,55 69 28,94 ± 5,80 72 28,27 ± 4,12 66 24,11 ± 7,21 65 28,43 ± 4,29 pa,b > 0,05; pa,c < 0,05; pc,d < 0,01 pa,b > 0,05 pa,c < 0,01 pc,d > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 pa,b > 0,05 pa,c > 0,05 pc,d < 0,05 pa,b > 0,05 pa,c < 0,05 pc,d < 0,001 pa,b > 0,05 pa,c < 0,01 pc,d < 0,001 pa,b > 0,05 pa,c < 0,001 pc,d < 0,001 PHỤ LỤC QUY TRÌNH GÂY MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT LIỀU 500 MG/KG CÂN NẶNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyên lý chung Gây mơ hình bệnh tự kỷ chuột nhắt trắng cách cho động vật phơi nhiễm với natri valproat thời kỳ bào thai Chuột nhắt độ tuổi sinh sản theo dõi chu kỳ động dục ghép đôi vào giai đoạn dễ thụ thai để xác định xác ngày thai kỳ Gây phơi nhiễm với natri valproat cho thai vào giai đoạn đ ng ống thần kinh phát triển cấu trúc thần kinh Chuột sinh mang số dấu hiệu tương ứng với biểu bệnh nhân tự kỷ Động vật gây mơ hình Chuột nhắt trắng chủng Swiss 10 – 14 tuần tuổi, cân nặng 30 – 35 gam, nuôi dưỡng điều kiện thức ăn nước uống đầy đủ với nhiệt độ ổn định 25 ± 10C, độ ẩm 60 – 70 % chu kỳ sáng tối 12/12 Chu kỳ động dục chuột theo dõi hàng ngày để ghép đôi vào giai đoạn tiền động dục giai đoạn động dục Phƣơng tiện, dụng cụ, hóa chất - Hộp nhựa plexiglass ni động vật, kích thước 30x20x15 cm - Thức ăn cám viên tổng hợp theo công thức Trung tâm nghiên cứu sản xuất động vật thí nghiệm chuẩn thức - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y - Chai nhựa đựng nước uống cho động vật - Trấu lót lồng ni - Cân điện tử độ xác 1/10.000 mg để cân hóa chất - Cân điện tử độ xác 1/10 mg để cân động vật - NaCl 0,9% - Natri valproat lọ dạng bột - Bơm tiêm ml, ông cồn Các bƣớc tiến hành Bƣớc 1: Tách chăm nuôi riêng chuột bố mẹ, theo dõi chu kỳ động dục chuột quan sát thay đổi quan sinh dục ngồi Có thể chụp ảnh để lưu trữ phân tích chuyên sâu cần thiết Bƣớc 2: Ghép đôi với chuột đực chuột giai đoạn tiền động dục động dục, tương ứng với giai đoạn rụng trứng, quan sát thấy cửa âm đạo mở, sưng hồng, ướt Thời gian ghép đôi 12 tiếng, từ 19 00 tối hôm trước đến 00 sáng hôm sau Bƣớc 3: Sau ghép đôi, kiểm tra quan sinh dục chuột cái, c nút tinh tr ng âm đạo chuột tuổi thai tính ngày (ngày 0,5) Bƣớc 4: Chuột mẹ tách chăm nuôi riêng theo dõi iểu mang thai tăng cân, ụng to, tuyến vú phát triển Bƣớc 5: Tiêm phúc mạc dung dịch natri valproat nồng độ 50 mg/ml liều 500 mg/kg cân nặng lần vào ngày 12,5 thai kỳ Bƣớc 6: Chuột mẹ sau tiêm thuốc tiếp tục nuôi riêng để theo dõi ngày sinh Bƣớc 7: Chuột sinh chuột mẹ nuôi dưỡng, cai sữa vào ngày tuổi 21 Đánh giá biểu dạng tự kỷ chuột kiểm định phù hợp ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VI N QUÂN Y ĐÀO THU HỒNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM BỆNH TỰ KỶ BẰNG NATRI VALPROAT VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI CỦA MÔI TRƢỜNG PHONG PHÚ TRÊN CHUỘT... hưởng natri valproat liều 500 mg/kg cân nặng lên hành vi chuột nhắt trước nuôi môi trường phong phú 68 3.2.2 Tác dụng môi trường phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình thực nghiệm bệnh tự. .. nhiễm natri valproat trước sinh liều 500 mg/kg cân nặng lên hành vi chuột nhắt trước nuôi môi trường phong phú 112 4.2.2 Tác dụng môi trường phong phú lên hành vi chuột nhắt gây mơ hình