các thí nghiệm kỹ thuật lên men

13 11 0
  • Loading ...
1/13 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 14/04/2018, 11:52

BÀI THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP PECTINASE TỪ NẤM MỐC Mục đích Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu trình sản xuất pectinase từ nấm mốc theo phương pháp lên men chìm Cơ sở lý thuyết - Pectin: Nguồn gốc, cấu tạo tính chất, ứng dụng - Cơ chế xúc tác pectinase - Quá trình sản xuất pectinase từ vVi sinh vật sinh tổng hợp pectinase - Quy luật trình sinh tổng hợp enzyme + Sự cảm ứng chất + Sự ức chế enzyme + Sự ức chế dị hoá - Quá Quy trình sản xuất pectinase theo phương pháp lên men chìm + Thành phầnChuẩn bị mơi trường + Điều kiệnPhương pháp lên men Nội dung thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị môi trường Mỗi học viên chuẩn bị 150mL môi trường erlen 250mL, thành phần sau (g/L): + Bột vỏ bưởi (đã sấy khô) (tương đương 1g pectin/L) + (NH4)2SO4 + Na2HPO4 0,2 + KH2PO4 + FeSO4 0,1 + CaCl2 0,01 + MnSO4 0,04 + H3BO3 0,01 Các học viên hiệu chỉnh giá trị pH cuả môi trường tương ứng 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 Tiệt trùng môi trường: 121oC, 15 phút 3.2 Cấy giống - Nấm mốc: Aspergillus awamori - Dùng pipette cho 10mL nước cất vào ống giống có chứa bào tử - Hút 2mL huyền phù có chứa bào tử cho vào erlen môi trường 3.3 Nuôi cấy Các học viên đặt erlen vao vào tủ lắc điều nhiệt với thông số sau: - Nhiệt độ: 30oC - Tốc độ lắc: 125rpm - Thời gian: 72h 3.4 Thu hồi enzym Sơ đồ thu hồi enzym: Canh trường → Lọc tách sinh khối → Ly tâm (40C, 6000rpm, 10min) tách huyền phù → Dung dịch enzyme thô Xác định hoạt tính enzym Báo cáo kết HOẠT TÍNH PECTINASE 1.1 Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme endopolygalacturonase định nghĩa lượng enzyme thuỷ phân dung dịch pectin 1%(w/w) điều kiện 45oC 30 phút để độ nhớt dung dịch pectin giảm 50% so với độ nhớt ban đầu unit of endopolygalacturonase is equivalent to a determined quantity of enzyme that o hydrolyzes 1% pectin solution at 45 C for 30min and the viscosity of this pectin solution decreases 50% of initial viscosity 1.2 Hóa chất - Pectin: dung dịch 1%(w/w) pectin - Dung dịch đệm acetate 0.1M acetate, pH 4.5 1.3 Dụng cụ - Nhớt kế Osvald - Bể điều nhiệt 1.4 Thực - Hút 7.5mL dung dịch pectin 1%(w/w) cho vào ống nghiệm - Cho tiếp 2.5mL enzyme thô vào ống nghiệm - Đặt ống nghiệm bể điều nhiệt: 45oC, 30 phút - Vô hoạt enzym cách đun sôi 100oC phút - Làm nguội đến 25oC - Mẫu trắng: thực tương tự thay 2.5mL enzyme thô 2.5mL nước cất - Xác định độ nhớt nhớt kế Osvald: xác định thời gian mẫu chảy qua hết thể tích nhớt kế Độ nhớt tương đối enzyme: Ve = Te/Tw + Te: thời gian chảy mẫu enzyme + Tw: thời gian chảy nước cất Độ nhớt tương đối mẫu đối chứng: Vc = Tc/Tw + Tc: thời gian chảy mẫu đối chứng - Tính tốn kết quả: + Độ giảm độ nhớt: V = (Vc-Ve)*100% + Hoạt độ enzyme pectinase: E = (V/d)*(100/n) = V/1.25; U/mL d=50 (độ nhớt dung dịch pectin giảm 50% so với độ nhớt dung dịch ban đầu) n=2.5mL (Thể tích dung dịch enzyme thơ) BÀI THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ NẤM MỐC Mục đích Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm mơi trường q trình sinh tổng hợp protease từ nấm mốc theo phương pháp lên men môi trường rắn Cơ sở lý thuyết - Protease: Nguồn gốc, cấu tạo, phân loại, tính chất, ứng dụng - Cơ chế xúc tác protease - Vi sinh vật sinh tổng hợp protease - Quy luật trình sinh tổng hợp enzyme + Sự cảm ứng chất + Sự ức chế enzyme + Sự ức chế dị hố - Quy trình sản xuất protease theo phương pháp lên men bề sâu + Chuẩn bị môi trường + Phương pháp lên men Nội dung thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị môi trường Mỗi học viên chuẩn bị ? gam mơi trường có thành phần sau (%w/w tính theo chất khơ): + Cám 82.98 (làm tròn số) + Đậu nành xay 4.25 + Trấu: 12.76 Các học viên hiệu chỉnh độ ẩm môi trường nước cất tương ứng 40%, 45%, 50%, 55% Tiệt trùng môi trường: 121oC, 20 phút 3.2 Cấy giống nuôi mốc - Nấm mốc: Aspergillus oryzae - Dùng pipette cho 5mL nước cất vào ống giống có chứa bào tử, dùng que cấy đánh nhẹ cho bào tử phân bố nước - Hút 1mL huyền phù có chứa bào tử cho vào môi trường trải nia tre (khối lượng môi trường tương ứng khoảng 56g) - Đậy vải lại - Nuôi điều kiện nhiệt độ phòng thời gian 39h (Lưu ý giữ ẩm cho môi trường cách ???) 3.3 Thu hồi enzym Sơ đồ thu hồi enzym: Canh trường → Trộn → Cân → Nghiền sơ → Trích ly (dung dịch đệm pH 6.5, tỷ lệ canh trường/dung môi 1g/8mL, thời gian trích ly, tốc độ khuấy đảo…) → Ly tâm (40C, 5000rpm, 15min) tách huyền phù → Định mức → Dung dịch enzyme thơ Xác định hoạt tính enzym Báo cáo kết HOẠT TÍNH PROTEASE 1.1 Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme protease định nghĩa lượng enzyme thuỷ phân lượng chất tạo sản phẩm tương đương với 1umol tyrosin điều kiện 30oC phút 1.2 Hóa chất - Dung dịch tyrorin chuẩn (1umol/mL) dung dịch HCl 0.2N - Dung dịch caseine 2%: cân xác 2g caseine, hòa tan 30mL dung dịch NaOH 0.1N, đun nhẹ khuấy caseine tan hết Dùng dung dịch KH 2PO4 1/15M để chỉnh pH – 7, sau định mức thành 100mL dung dịch đệm phosphate 1/15M - Dung dịch A (NaH2PO4 1/15M) - Dung dịch B (KH2PO4 1/15M) - Dung dịch đệm phosphate (pH = 7.4): trộn A B theo tỷ lệ 4:1 - Dung dịch TCA: 10% - Dung dịch Na2CO3 6% - Thuốc thử Folin - Ciocalteau 1.3 Dụng cụ - May quang phổ - Bể điều nhiệt 1.4 Thực Quá trình thuỷ phân - Cho vào ống nghiệm 2mL dung dịch caseine 2% - Bổ sung vào 1mL dung dịch enzyme thô - Lắc đều, để thủy phân 30oC 10 phút - Bổ sung 5mL dung dịch TCA 10% để tuả proteine (30oC, 10 phút) - Lọc (sử dụng giấy lọc ??) - Lấy 1mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, sau bổ sung 1mL thuốc thử Folin - Ciocalteau 4mL dung dịch Na2CO3 6% - Lắc đều, chờ phản ứng tạo màu 10 phút 30oC - Đo độ hấp thu bước sóng 750nm Mẫu đối chứng thực tương tự thay 1mL dung dịch enzyme thô 1mL nước cất Dựng đường chuẩn: - Dùng dung dịch tyrosin chuẩn pha loãng để lập đường chuẩn (pha loãng dung dịch HCl 0.2N) - Lấy 1mL dung dịch tyrosincho vào ống nghiệm, sau bổ sung 1mL thuốc thử Folin Ciocalteau 4mL dung dịch Na2CO3 6% - Lắc đều, chờ phản ứng tạo màu 10 phút 30oC - Đo độ hấp thu bước sóng 750nm Tính tốn kết quả: - Hoạt độ protease 1mL dung dịch enzym H = 8T/τ T: nồng độ tyrosin dung dịch đem đo τ: thời gian phản ứng (10 phút) 8: số mL toàn hỗn hợp phản ứng (1mL dung dịch enzyme, 2mL dung dịch caseine, 5mL dung dịch TCA) BÀI THÍ NGHIỆM CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE Mục đích So sánh hiệu cố định nấm men chất mang Bacterial Cellulose (BC) theo phương pháp: hấp phụ hấp phụ - ủ Cơ sở lý thuyết (Học viên tự chuẩn bị) - Kỹ thuật cố định tế bào - Chất mang BC - Cố định tế bào chất mang BC: phương pháp cố định, yếu tố ảnh hưởng - Ứng dụng nấm men cố định chất mang BC - Các phương pháp định lượng: hàm lượng ni tơ ammonium, hàm lượng đường khử, mật độ nấm men trên/ chất mang Nội dung thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị mơi trường (phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn) − Dịch nho chuẩn bị để làm môi trường nhân giống nấm men (150mL), môi trường cố định nấm men (400mL/học viên - TN3) môi trường lên men rượu vang nho (200mL/học viên - TN4) Nho Tách cuống Rửa Chà Pectinase 0,1% Xử lý enzyme 45 – 50oC, 120ph Gia nhiệt 70oC, 5ph Lọc sơ Bentonite 0,2% Gia nhiệt 70oC, 2ph Lọc chân không Dịch nho Hình Quy trình thu nhận dịch nho − Kiểm tra pH, hàm lượng chất khô, hàm lượng đường khử, hàm lượng nitơ ammonium ban đầu dịch nho thu được, dùng (NH4)2SO4 để hiệu chỉnh thông số nitơ ammonium thành 195 ppmN Dịch nho chưa sử dụng bảo quản tủ đông (200mL/phần) 3.2 Chuẩn bị giống nấm men (phòng thí nghiệm chuẩn bị sẵn) − Nấm men Saccharomyces cerevisiae − Nhân giống cấp môi trường dịch nho Cấp 1: lấy từ đến vòng que cấy nấm men từ ống giống gốc để cấy vào 10mL môi trường nước nho (đã hiệu chỉnh hàm lượng nitơ ammonium tiệt trùng), nuôi cấy 24h nhiệt độ 30oC Cấp 2: cho toàn canh trường nhân giống cấp vào 100mL môi trường nước nho (đã hiệu chỉnh hàm lượng nitơ ammonium, dùng đường glucose hiệu chỉnh hàm lượng chất khô đến 15oBx tiệt trùng), nuôi cấy 24h nhiệt độ 30oC − Ly tâm, thu sinh khối: Sau nhân giống, nấm men đem ly tâm với tốc độ 4000v/phút, nhiệt độ 40C, thời gian 30 phút để tách sinh khối 3.3 Chuẩn bị BC (chuẩn bị nguyên nhóm) − BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinium − Quy trình chuẩn bị BC ∗ Sấy nhẹ 70oC 5’ để làm chất mang ∗ Cắt BC thành miếng vuông 1x1 cmxcm ∗ Hấp tiệt trùng miếng BC 121oC 20 phút ∗ Làm nguội đến nhiệt độ thường ∗ Lượng chất mang sử dụng 40g/200mL dịch nho 3.4 Cố định nấm men BC (thực riêng học viên) − Thực song song mẫu dùng phương pháp cố định: hấp phụ hấp phụ - ủ − Phương pháp hấp phụ (hình 2)  Chỉnh pH dịch nho dùng để cố định nấm men giá trị 3,0 – 4,0 – 5,0 – 6,0 acid lactic 5% NaOH 5%  Lượng dịch nho sử dụng cho thí nghiệm 200mL / erlen 500mL  Dùng dịch nho chuẩn bị pha loãng sinh khối nấm men sau ly tâm để đạt dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 185.108 tb/mL  Trộn chất mang BC vào huyền phù giống (40g/200mL)  Lắc tủ lắc tốc độ 200v/ph  Thời gian cố định 4h45’  Vớt BC khỏi dịch huyền phù nấm men rửa nước vô khuẩn  Xác định mật độ tế bào đơn vị chất mang (phá mẫu máy xay với 200mL nước vơ khuẩn, pha lỗng, đếm buồng đếm Thomas) − Phương pháp hấp phụ - ủ (hình 3)  Tiến hành giống phương pháp hấp phụ, 200mL dịch nho / erlen 500mL  Sau đó, chất mang BC cố định nấm men cho vào erlen vô trùng, ủ tủ ấm 30oC ngày (48h)  Xác định mật độ tế bào đơn vị khối lượng chất mang BC Hình Quy trình cố định nấm men BC theo phương pháp hấp phụ Hình Quy trình cố định nấm men BC phương pháp hấp phụ - ủ Báo cáo kết − Mật độ tế bào nấm men cố định chất mang BC trường hợp Tính hiệu suất cố định H = n (%) n0 Cho thời gian cố định, nấm men dịch huyền phù nấm men không tăng sinh khối − So sánh, nhận xét, giải thích PHỤ LỤC: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH pH: Sử dụng máy đo pH Nồng độ chất khô: Sử dụng khúc xạ kế để bàn, đơn vị đo oBx Nồng độ đường khử (phương pháp AOAC) 3.1 Hóa chất Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid − Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) 1,6g NaOH khoảng 60-70mL nước cất Sau cho 30g KNa tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp khuấy cho tan hoàn toàn − Chuyển dung dịch vào bình định mức 100mL định mức đến vạch − Dung dịch sau pha bảo quản chai thủy tinh màu điều kiện lạnh (6-8 oC), dùng tốt 15 ngày Dung dịch đường chuẩn − Dung dịch đường chuẩn dung dịch chứa hỗn hợp glucose fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w), có nồng độ 2g/L 3.2 Cách tiến hành Xử lý mẫu − Acid hữu cơ: trung hòa acid mẫu dung dịch NaOH 0,1N − Tách tạp chất protein: cho dung dịch Ba(OH) 0,3N ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu → protein biến tính tạo tủa Mặt khác, Ba(OH) ZnSO4 phản ứng với tạo kết tủa, với tủa protein, hấp phụ chất màu, tạp chất khác làm mẫu Dựng đường chuẩn − Pha loãng dung dịch đường chuẩn thành mẫu có nồng độ khác − Cho 1mL dung dịch chuẩn vào ống nghiệm Sau bổ sung 1mL dung dịch DNS Lắc − Dùng miếng nylon bịt kín miệng ống nghiệm tiến hành đun cách thủy nhiệt độ 100oC thời gian phút − Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất lắc dung dịch không phân lớp − Đo độ hấp thu A bước sóng λ = 540nm − Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu − Từ kết đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A) Xác định hàm lượng đường khử mẫu thí nghiệm − Pha loãng mẫu cho nồng độ đường khử mẫu ≤ 2g/L − Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu 1mL dung dịch DNS, lắc Sau tiến hành tương tự − Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử có mẫu nghiên cứu Hàm lượng nitơ vô (phương pháp phân tích AOAC) 4.1 Hố chất Dung dịch phenol: trộn 11mL phenol lỏng (≥ 89%) định mức thành 100mL ethanol 95% Dung dịch dùng tuần Sodium nitroprusside 0,5%w/v: hoà tan 0,5g sodium nitroprusside vào 100mL nước Dung dịch dùng tháng Alkaline citrate: hòa tan 200g trisodium citrate 10g NaOH nước cất → định mức thành 1L Sodium hypochlorite 5%: dung dịch có bán sẵn thị trường Dung dịch dùng tháng Dung dịch oxy hóa: trộn 100mL dung dịch alkaline citrate với 25mL sodium hypochlorite Dung dịch dùng ngày Dung dịch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH 4)2HPO4 nước cất định mức thành 1L Dung dịch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dịch chuẩn N 1g/L định mức thành 1L Từ dung dịch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành dung dịch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L 0,5mg/L 4.2 Cách tiến hành Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó: 1mL dung dịch phenol, 1mL dung dịch sodium nitroprusside, 2,5mL dung dịch oxy hóa Bao erlen màng plastic, để nhiệt độ phòng (22 - 27 oC) nơi có ánh sáng nhẹ vòng 1h Dung dịch bền màu vòng 24h Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự với dung dịch chuẩn 0,1mg/L; 0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L 0,5mg/L Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy Đo màu bước sóng 640nm BÀI THÍ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG BẰNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN BC Mục đích Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường ban đầu đến động học trình sinh trưởng nấm men trình lên men rượu vang nho nấm men cố định Cơ sở lý thuyết (Học viên tự chuẩn bị) - Kỹ thuật lên men rượu vang - Lên men rượu vang nấm men cố định chất mang BC - Các phương pháp định lượng: mật độ tế bào nấm men, đường khử, cồn Nội dung thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị môi trường − Dịch nho chuẩn bị TN3 rã đông, hấp tiệt trùng, làm nguội − Lượng dịch nho dùng để lên men 200mL, lên men erlen 500mL 3.2 Chuẩn bị giống nấm men − Naám men Saccharomyces cerevisiae cố định BC phương pháp hấp phụ − Mật độ nấm men ban đầu cấy vào dịch lên men 5x106 tb/mL 3.3 Lên men rượu vang nho − Tiến hành lên men với thông số  Lượng dịch nho: 200mL  Thay đổi hàm lượng đường khử ban đầu glucose: 200 – 240 – 280 – 320g/L  Hàm lượng N ammonium: 195 ppmN  Mật độ nấm men ban đầu: 5x106 tb/mL  Nhiệt độ lên men: 25oC  Thời gian lên men: 120 h − Lấy mẫu định kỳ 24h, xác định mật độ tế bào dịch lên men (trong BC dịch lên men), pH dịch lên men − Sau thời gian lên men, xác định hàm lượng đường sót, lượng cồn tạo thành Báo cáo kết − Vẽ đồ thị biểu diễn thay đổi mật độ tế bào pH dịch lên men theo thời gian lên men ∆S − Xác định tốc độ sử dụng đường trung bình: K S = (g/L/h) τ − Xác định độ lên men: α= ∆S So − Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình: K P = − Xác định hiệu suất sinh tổng hợp cồn: η = Trong đó, ∆P (g/L/h) τ ∆P / 46 (mol ethanol/mol glucose) ∆S/ 180 ∆S = So – S : tổng lượng đường sử dụng g/L So : hàm lượng đường ban đầu, g/L S : hàm lượng đường sót, g/L ∆P = P – Po : tổng lượng cồn sinh tổng hợp, g/L Po : hàm lượng cồn ban đầu, g/L P : hàm lượng cồn cuối cùng, g/L τ : thời gian lên men, h − So sánh, nhận xét, giải thích PHỤ LỤC: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Hàm lượng đường khử (phương pháp AOAC) - Bài Hàm lượng ethanol (phương pháp AOAC) 2.1 Chưng cất Cho 20mL mẫu vào bình cất 250mL, ghi lại nhiệt độ Thêm vào 20mL nước cất Bình hứng đặt chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước đá để làm lạnh Đun nhẹ bình cất, tránh sơi trào, tăng dần nhiệt độ bình cất sơi Chưng cất gần đạt 20mL, định mức thành 20mL nước cất nhiệt độ 2.2 Xác định tỷ trọng dịch cất Chuẩn bị bình tỷ trọng: rửa sạch, tráng lần nước cất, lần ethanol 96% (hay ether ethylic, aceton), để khô tự nhiên 30 phút, cân khối lượng bình (m, g) Cho nước cất nhiệt độ cần đo vào bình đậy nắp cho vào bể điều nhiệt để ổn định nhiệt độ đo 30 phút, lấy bình ra, dùng bơng tẩm cồn lau cho bên ngồi bình, lau lại giấy khơ, thao tác nhanh tránh thay đổi nhiệt độ Cân khối lượng nước bình (m2, g) Lặp lại thao tác ethanol cất Cân khối lượng ethanol bình (m 1, g) 2.3 Tính kết Tỷ trọng tương đối ethanol tính theo cơng thức: d = Trong đó: m1 − m m2 − m m – khối lượng bình tỷ trọng, g m1 – khối lượng ethanol bình, g m2 – khối lượng nước bình, g Biết tỷ trọng tương đối d, tra bảng tìm hàm lượng ethanol, tính theo % thể tích, nhiệt độ khảo sát ... viên tự chuẩn bị) - Kỹ thuật lên men rượu vang - Lên men rượu vang nấm men cố định chất mang BC - Các phương pháp định lượng: mật độ tế bào nấm men, đường khử, cồn Nội dung thí nghiệm 3.1 Chuẩn... Mật độ nấm men ban đầu: 5x106 tb/mL  Nhiệt độ lên men: 25oC  Thời gian lên men: 120 h − Lấy mẫu định kỳ 24h, xác định mật độ tế bào dịch lên men (trong BC dịch lên men) , pH dịch lên men − Sau... nho dùng để lên men 200mL, lên men erlen 500mL 3.2 Chuẩn bị giống nấm men − Naám men Saccharomyces cerevisiae cố định BC phương pháp hấp phụ − Mật độ nấm men ban đầu cấy vào dịch lên men 5x106
- Xem thêm -

Xem thêm: các thí nghiệm kỹ thuật lên men, các thí nghiệm kỹ thuật lên men

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay