Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định

94 6 0
  • Loading ...
1/94 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 13/04/2018, 18:30

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  BK TP.HCM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH SVTH: LÊ ANH DŨNG MSSV: 60700417 GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Tp Hồ Chí Minh, tháng 01/ 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH SVTH: LÊ ANH DŨNG MSSV: 60700417 GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 / 2012 -i- Luận văn tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tp HCM, tháng 12 năm 2011 Giáo viên hướng dẫn -ii- Luận văn tốt nghiệp NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN Tp HCM, tháng 01 năm 2012 Giáo viên phản biện -iii- Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin cảm ơn Tiến sĩ Trần Bích Lam, người trực tiếp hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức q báu cho tơi suốt thời gian làm luận văn Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, đặc biệt Thầy Cơ Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm truyền đạt kiến thức chuyên ngành kiến thức xã hội giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô hội đồng chấm luận văn dành thời gian quý báu để đọc đưa nhận xét giúp tơi hồn thiện luận văn Con xin cảm ơn ba mẹ gia đình ln chỗ dựa vững cho con, động viên, khuyến khích tạo điều kiện cho học tập tốt Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn bè chia sẻ, động viên thời gian thực Luận văn Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2012 Sinh viên thực Lê Anh Dũng -iv- Luận văn tốt nghiệp TÓM TẮT LUẬN VĂN Lipase (EC 3.1.1.3) họ enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất béo Enzyme chiếm vị trí bật loại xúc tác sinh học khả ứng dụng nhiều lĩnh vực khác tổng hợp hữu cơ, chất tẩy rửa dinh dưỡng Lipase cố định nhằm làm tăng độ bền, khả tái sử dụng dễ dàng phân tách khỏi sản phẩm so với enzyme tự Các nghiên cứu giới cố định thành công enzyme lipase lên nhiều loại chất mang khác Đề tài “Nghiên cứu cố định lipase tính chất enzyme cố định” sử dụng loại chất mang có nguồn gốc nước để cố định lipase nhằm so sánh tính chất enzyme cố định so với nghiên cứu khác Nội dung nghiên cứu đề tài gồm:  Chọn vật liệu để cố định enzyme lipase  Tối ưu hóa q trình cố định enzyme lipase vật liệu  Khảo sát tính chất enzyme lipase sau cố định so sánh với enzyme tự -v- Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT LUẬN VĂN v MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Lipase 1.1.1 Giới thiệu lipase 1.1.2 Đặc điểm lipase 1.1.3 Tính đặc hiệu lipase 1.2 Cố định lipase 1.2.1 Định nghĩa enzyme cố định 1.2.2 Đặc điểm enzyme cố định 1.2.3 Ưu nhược điểm enzyme cố định 1.2.4 Các phương pháp cố định enzyme lipase 1.2.5 Các nghiên cứu gần cố định enzyme lipase CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22 2.1.1 Enzyme lipase 22 2.1.2 Chitosan 22 2.1.3 Natri alginate 24 2.1.4 Dầu olive 27 2.2 Thiết bị 28 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 29 -vi- Luận văn tốt nghiệp 2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính riêng lipase tự 29 2.3.2 Thí nghiệm 2: Chọn vật liệu cố định lipase 30 2.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa q trình cố định enzyme 32 2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tính chất lipase cố định 33 2.4 Các phương pháp phân tích 36 2.4.1 Đo pH 36 2.4.2 Đo độ hấp thu 36 2.4.3 Xác định hàm lượng protein 38 2.4.4 Xác định hoạt tính riêng enzyme lipase 40 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 41 2.5.1 Phương pháp xử lý số liệu phân tích ANOVA 41 2.5.2 Tính hệ số tương quan R Excel 42 2.5.3 Tối ưu hóa phần mềm Modde 5.0 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Xác định hoạt tính enzyme tự 43 3.2 Vật liệu cố định lipase 43 3.3 Tối ưu hóa trình cố định 45 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ Na-alginate đến trình cố định lipase 45 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến trình cố định lipase 49 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian ủ đến trình cố định lipase 50 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ enzyme tự đến trình cố định lipase 52 3.3.5 Sử dụng quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa q trình cố định 53 3.4 Khảo sát tính chất lipase cố định 57 3.4.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính lipase 57 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase 58 3.4.3 Động học phản ứng thủy phân 60 3.4.4 Khả tái sử dụng lipase cố định 64 -vii- Luận văn tốt nghiệp 3.4.5 Phương pháp bảo quản lipase cố định 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1 Kết luận 69 4.2 Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 77 -viii- Luận văn tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Đặc tính enzyme lipase 22 Bảng 2.2: Đặc điểm kỹ thuật enzyme lipase 22 Bảng 2.3: Các thông số dầu olive 28 Bảng 2.4: Phương pháp pha loãng dung dịch protein chuẩn 39 Bảng 3.1:Hiệu suất cố định protein enzyme hoạt tính lipase cố định loại chất mang khác 43 Bảng 3.2: Hiệu suất cố định protein enzyme hoạt tính lipase cố định giá trị nồng độ Na-alginate khác 46 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 đến hiệu suất cố định protein enzyme hoạt tính lipase cố định 49 Bảng 3.4: Hiệu suất cố định protein enzyme hoạt tính lipase cố định thời gian ủ khác 51 Bảng 3.5: Hiệu suất cố định protein enzyme hoạt tính lipase cố định nồng độ lipase tự khác 52 Bảng 3.6: Các thông số để xây dựng phương trình hồi quy tối ưu hóa 54 Bảng 3.7: Kết giá trị phương trình hồi quy 54 Bảng 3.8: Giá trị Vmax Km lipase tự cố định 62 Bảng 3.9: Giá trị Km Vmax lipase tự lipase cố định 64 Bảng P.1: Độ hấp thu nồng độ protein khác 77 Bảng P.2: Độ hấp thu nồng độ protein khác 77 Bảng P.3: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính lipase cố định 79 Bảng P.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase cố định 79 Bảng P.5: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính lipase cố định 79 Bảng P.6: Các thông số lipase cố định để xác định hệ số phương trình Lineweaver – Burk 79 Bảng P.7: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính lipase tự 80 -ix- Luận văn tốt nghiệp Chương 3: Kết bàn luận phosphate, citrate lactate): Hợp chất chelate làm giảm độ bền gel alginate chúng cạnh tranh với Ca2+ việc tạo gel  Nồng độ số ion khơng có khả tạo gel khác Na+ hay Mg2+: Các ion làm cho hạt trương nở dẫn đến kích thước lỗ xốp tăng, khiến cấu trúc gel ổn định phá vỡ cấu trúc gel  Tính chất Na-alginate: Gel alginate thường không tạo thành hàm lượng acid guluronic Na-alginate nhỏ 20 – 25% Tính chất gel alginate cũngphụ thuộc lớn vào thành phần alginate Nếu tỉ lệ M/G nhỏ tạo thành gel chắc, tỉ lệ M/G cao tạo thành gel đàn hồi Độ bền gel tăng tỉ lệ với khối lượng phân tử polysaccharide tăng từ 400 – 500 kDa Theo số nghiên cứu, mạch phân tử alginate ngắn tạo nên mắt lưới gel nhỏ Khi chiều dài mạch tăng lên có nhiều phân đoạn guluronic, làm cho kích thước mắt lưới tăng lên Khi kích thước mắt lưới đạt đến cực đại, dù có tăng độ dài mạch tăng kích thước mắt lưới khơng đáng kể  Nồng độ Ca2+ Na-alginate: Do trình tạo gel thực liên kết phân tử alginate với ion Ca2+ nên nồng độ dung dịch alginate nồng độ Ca2+ ảnh hưởng đến độ bền gel Khi nồng độ tăng số liên kết tăng, mật độ mạng lưới gel dày đặc, hạt gel xốp hơn, giữ nước nhiều co rút giảm  pH môi trường: Cấu trúc hạt gel alginate không bị ảnh hưởng pH = – 10, pH < thể tích hạt nhỏ, pH > 10 thể tích hạt tăng Nguyên nhân pH < xảy q trình proton hóa COO- thành COOH, làm giảm lực đẩy tĩnh điện sợi alginate, giúp chúng tiến lại gần liên kết chặt chẽ làm giảm thể tích Khi pH thấp (pH < 2) alginate kết tủa tạo thành hạt gel nhỏ, màu trắng không đàn hồi Khi pH > 10 hình thành Ca(OH)+ Ca(OH)2 làm giảm nồng độ Ca2+, dẫn đến liên kết sợi alginate Ca2+ khơng triệt để Ngồi ra, làm tăng số nhóm COO- tự làm tăng lực đẩy tĩnh điện chúng, kết thể tích hạt gel tăng Trang 67 Luận văn tốt nghiệp Chương 3: Kết bàn luận Việc lipase cố định loại (B) tan mơi trường giải thích có mặt hợp chất chelate số ion khơng có khả tạo gel khác Na+ hay Mg2+ chất làm giảm độ bền hạt gel Trong đó, enzyme loại (A) để khô nên cấu trúc bền hơn, khiến cho hợp chất ion khó di chuyển vào bên làm phá vỡ cấu trúc hạt gel Như vậy, việc để khô lipase cố định cần thiết để làm tăng độ bền khả bảo quản enzyme Đây lí mà nghiên cứu khác cố định lipase alginate sấy chân không enzyme cố định để khô enzyme cố định nhiệt độ phòng (Dave & Madamwar, 2006; Won, 2005; Pereira, 2001; Mustranta, Forssel, & Poutanen, 1993) Trang 68 Luận văn tốt nghiệp Chương 4: Kết luận kiến nghị CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Bước đầu nghiên cứu khả cố định lipase, qua q trình thử nghiệm, chúng tơi rút số thơng số tối ưu cho q trình cố định enzyme lipase sau:  Vật liệu cố định: Na-alginate  Nồng độ Na-alginate: 1,177% (w/v)  Nồng độ CaCl2: 1% (w/v)  Nồng độ enzyme lipase tự do: 29,652 mg/ml  Thời gian cố định:  Thời gian ủ: Lipase cố định với thông số tối ưu thể số tính chất ưu việt so với lipase tự độ bền nhiệt cao hơn, khả phản ứng thủy phân tốt điều kiện pH acid, khả tái sử dụng nhiều lần Tuy nhiên, lipase cố định bộc lộ nhược điểm hoạt tính thấp enzyme tự do, lực với chất cao enzyme tự 4.2 Kiến nghị Do hạn chế thời gian điều kiện thí nghiệm nên chưa thể nghiên cứu sâu để khắc phục nhược điểm enzyme lipase cố định Na-alginate Vì chúng tơi có số kiến nghị sau:  Khảo sát thêm yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định hoạt tính enzyme lipase cố định kích thước hạt gel, tốc độ khuấy trộn  Tìm cách giảm lượng lipase tự thất q trình tái sử dụng enzyme cách bao phủ bề mặt gel alginate vật liệu thích hợp Trang 69 Luận văn tốt nghiệp Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Đức Lượng (2004) Công nghệ enzyme NXB Đại học Quốc Gia TP HCM [2] Alsarra, I A., Neau, S H., & Howard, M A (2004) Effects of preparative parameters on the properties of chitosan hydrogel beads containing Candida rugosa lipase Biomaterials 25, 2645-2655 [3] Bai, Y.-X., Li, Y.-F., Yang, Y., & Y, L.-X (2006) Covalent immobilization of triacylglycerol lipase onto functionalized novel mesoporous silica supports Journal of Biotechnology, 574-582 [4] Betiger, S S., & S H (2002) Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads Biomaterials, 3627-3636 [5] Bolivara, J M., Gallego, F L., & Mateo, C (2009) The presence of thiolated compounds allows the immobilization of enzymes on glyoxyl agarose at mild pH values: New strategies of stabilization by multipoint covalent attachment Enzyme and Microbial Technology, 477–483 [6] Bradford, M M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Analytical Chemistry, 248-254 [7] Brady, L (1990) A serine protease triad forms the catalytic center of a triacylglycerol lipase Nature, 767-770 [8] Brigida, A I., & Pinheiro, A D (2007) Immobilization of Candida antarctica Lipase B by Covalent Attachment to Green Coconut Fiber Applied Biochemistry and Biotechnology, 67-80 [9] Brzozowski, A e (1991) A model for interfacial activation in lipases from the structure of a fungal lipase-inhibitor complex Nature 351, 491-494 [10] Chang, S -W., Shaw, J -F., & Yang, K -H (2008) Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(glutamic acid) by RSM Bioresource Technology, 2800–2805 Trang 70 Luận văn tốt nghiệp [11] Tài liệu tham khảo Chaubey, A., Parshad, R., & Taneja, S C (2009) Arthrobacter sp lipase immobilization on magnetic sol–gel composite supports for enantioselectivity improvement Process Biochemistry, 154–160 [12] Cheirsilp, B., Jeamjounkhaw, P., & H-Kittikun, A (2009) Optimizing an alginate immobilized lipase for monoacylglycerol production by the glycerolysis reaction Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 206-211 [13] Dalla-Vecchia, R., Sebrao, D., Nascimento, M d., & Soldi, V (2005) Carboxymethylcellulose and poly(vinyl alcohol) used as a film support for lipases immobilization Process Biochemistry, 2677-2682 [14] lipase Dave, R., & Madamwar, D (2006) Esterification in organic solvents by immobilized in polymer of PVA–alginate–boric acid Process Biochemistry, 951-955 [15] Deng, H.-T., Xu, Z.-K., & Dai, Z.-W (2005) Immobilization of Candida rugosa lipase on polypropylene microfiltration membrane modified by glycopolymer: hydrolysis of olive oil in biphasic bioreactor Enzyme and Microbial Technology, 996–1002 [16] Desai, P D., Daveb, A M., & Devi, S (2004) Entrapment of lipase into -carrageenan beads and its use in hydrolysis of olive oil in biphasic system Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 143–150 [17] Dhake, K P., Deshmukh, K M., Patil, Y P., Singhal, R S., & Bhanage, B M (2011) Improved activity and stability of Rhizopus oryzae lipase via immobilization for citronellol ester synthesis in supercritical carbon dioxide Journal of Biotechnology, 45-51 [18] Dutta, P K., Dutta, J., & Tripathi, V S (2004) Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications Journal of Scientific and Industrial Research, 20-31 [19] Forde, J., Vakurov, A., & Gibson, T D (2010) Chemical modification and immobilisation of lipase B from Candida antarctica onto mesoporous silicates Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 203–209 Trang 71 Luận văn tốt nghiệp [20] Tài liệu tham khảo Gao, S., Wang, Y., & Wang, T (2009) Immobilization of lipase on methyl-modified silica aerogels by physical adsorption Bioresource Technology, 996–999 [21] Gao, S., Wang, Y., & Wang, W (2010) Enhancing performance of lipase immobilized on methyl-modified silica aerogels at the adsorption and catalysis processes: Effect of cosolvents Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 218–224 [22] Grochulski, P (1994) Two conformational states of Candida rugosa lipase Protein Science, 82-91 [23] Gupta, R., Gupta, N., & Rathi, P (2004) Bacterial lipases: An overview of production, purification and biochemical properties Applied Biochemistry and Biotechnology, 763-781 [24] Haug, A (1967) Correlation between chemical structure and physical properties Acta Chemica Scandinavica, 768-78 [25] Hernandez, K., Garcia-Galan, C., & Fernandez-Lafuente, R (2011) Simple and efficient immobilization of lipase B from Candida antarctica on porous styrene–divinylbenzene beads Enzyme and Microbial Technology, 72– 78 [26] Huang, X.-J., Ge, D., & Xu, Z.-K (2007) Preparation and characterization of stable chitosan nanofibrous membrane for lipase immobilization European Polymer Journal, 3710-3718 [27] lipase Huang, X.-J., Yu, A.-G., & Xu, Z.-K (2008) Covalent immobilization of from Candida rugosa onto poly(acrylonitrile-co-2-hydroxyethyl methacrylate) electrospun fibrous membranes for potential bioreactor application Bioresource Technology, 5049-5465 [28] Hung, T.-C., Giridhar, R., & Chiou, S.-H (2003) Binary immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 69–78 Trang 72 Luận văn tốt nghiệp [29] Tài liệu tham khảo Jegannathan, K R., Chan, E.-S., & Ravindra, P (2009) Physical and stability characteristics of Burkholderia cepacia lipase encapsulated in Kcarrageenan Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 78-83 [30] Karimpi, J J., Melo, J., & D'Souza, S (2011) Immobilization of lipase on cotton cloth using the layer-by-layer self-assembly technique International Journal of Biological Macromolecules [31] Kharrat, N., & Ali, Y B (2011) Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme Process Biochemistry, 1083–1089 [32] Kim, M H., An, S., Won, K., & Joo, H (2011) Entrapment of Enzymes into Cellulose-Biopolymer Composite Hydrogel Beads Using Biocompatible Ionic Liquid Journal of Molecular Catalysis [33] Knezevic, Z., Bobic, S., & Milutinovic, A (2002) Alginate-immobilized lipase by electrostatic extrusion for the purpose of palm oil hydrolysis in lecithin/isooctane system Process Biochemistry, 313-318 [34] Le, G (2003) Molecular diversity through sugar scaffolds Drug Discovery today [35] Li, Y., Zhou, G., Qiao, W., & Wang, Y (2009) Immobilization of Porcine pancreas lipase on fiber-like SBA-15 mesoporous material Materials Science and Engineering B, 120–126 [36] Manzano, M F., & Igarzabal, C I (2011) Immobilization of lipase from Candida rugosa on synthesized hydrogel for hydrolysis reaction Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 28–35 [37] Matsumoto, M., & Ohashi, K (2003) Effect of immobilization on thermostability of lipase from Candida rugosa Biochemical Engineering Journal, 75-77 [38] McHugh, D J (1987) Production, properties and uses of alginates In D J McHugh (Ed.), Production and utilization of products from commercial seaweeds (pp 58-115) Food and Agriculture Organisation of UN Trang 73 Luận văn tốt nghiệp [39] Tài liệu tham khảo Monier, M., Wei, Y , & Sarhan, A A (2010) Evaluation of the potential of polymeric carriers based on photo-crosslinkable chitosan in the formulation of lipase from Candida rugosa immobilization Journal of Molecular Catalysis, 93101 [40] Moreno, J.-M., Arroyo, M., Hernhiz, M.-J., & Sinisterra, J.-V (1997) Covalent immobilization of pure isoenzymes from lipase of Candida rugosa Enzyme and Microbial Technology, 552-558 [41] Mukherjee, K., & Hills, M (1994) Lipases from plants Cambridge University Press, 49-75 [42] Muller, G., & Petry, S (2004) Lipases and phospholipases in drug development: from biochemistry to molecular pharmacology Wiley VCH [43] Murty, V R., Bhat, J., & Muniswaran, P K (2002) Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review Biotechnology and Bioprocess Engineering, 57-66 [44] Mustranta, A., Forssel, P., & Poutanen, K (1993) Applications of immobilized lipases to transesterification and esterification reactions in nonaqueous systems Enzyme and Microbial Technology, 133-139 [45] Orrego, C (2010) Novel chitosan membranes as support for lipases immobilization: Characterization aspects Carbohydrate Polymers, 9-16 [46] Ozyilmaz, G., & Gezer, E (2010) Production of aroma esters by immobilized Candida rugosa and porcine pancreatic lipase into calcium alginate gel Journal of Molecular Catalysis B, 140-145 [47] Pahujani, S., Kanwar, S S., Chauhan, G., & Gupta, R (2008) Glutaraldehyde activation of polymer Nylon-6 for lipase immobilization: Enzyme characteristics and stability Bioresource Technology, 2566–2570 [48] Pereira, E B (2001) Kinetic studies of lipase from Candida rugosa Applied Biochemistry and Biotechnology, 739-752 [49] Pereira, E B., Castro, H F., & Moraes, F F (2002) Esterification activity and stability of Candida rugosa lipase immobilized into chitosan Applied Biochemistry and Biotechnology, 977-986 Trang 74 Luận văn tốt nghiệp [50] Tài liệu tham khảo Polaina, J., & MacCabe, A P (Eds.) (2007) Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications Springer [51] Rodrigues, D S., Mendes, A A., & Adriano, W S (2008) Multipoint covalent immobilization of microbial lipase on chitosan and agarose activated by different methods Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic, 100-109 [52] Rodrigues, R C., Godoy, C A., & Volpato, G (2009) Immobilization – stabilization of the lipase from Thermomyces lanuginosus: Critical role of chemical amination Process Biochemistry, 963–968 [53] Schmidt, A (2001) Industrial biocatalysts, today and tomorrow Nature, 258-268 [54] Silva, J., Macedo, G., Rodrigues, D., & Giordano, R (2011) Immobilization of Candida antarctica lipase B by covalent attachment on chitosan-based hydrogels using different support activation strategies Biochemical Engineering Journal [55] Soares, C M., & Castro, H F (1999) Characterization and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica Applied Biochemistry and Biotechnology, 745-757 [56] Taqieddin, E., & Amiji, M (2004) Enzyme immobilization in novel alginate–chitosan core-shell microcapsules Biomaterials, 1937–1945 [57] Uyanik, A., Sen, N., & Yilmaz, M (2011) Improvement of catalytic activity of lipase from Candida rugosa via sol–gel encapsulation in the presence of calix(aza)crown Bioresource Technology, 4313-4318 [58] Wang, Y., & Hsieh, Y L (2008) Immobilization of lipase enzyme in polyvinyl alcohol (PVA) nanofibrous membranes Journal of Membrane Science, 73-81 [59] Whitaker, J (2001) Current Protocols in Food Analytical Chemistry John Wiley & Sons, Inc [60] Winkler, F., D'Arcy, A., & Hunziker, W (1990) Structure of human pancreatic lipase Nature, 771 – 771 Trang 75 Luận văn tốt nghiệp [61] Tài liệu tham khảo Won, K (2005) Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads Process Biochemistry, 2149–2154 [62] Ye, P., Jiang, J., & Xu, Z.-K (2007) Adsorption and activity of lipase from Candida rugosa on the chitosan-modified poly(acrylonitrile-co-maleic acid) membrane surface Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 62-67 [63] Yigitoglu, M., & Temocin, Z (2010) Immobilization of Candida rugosa lipase on glutaraldehyde-activated polyester fiber and its application for hydrolysis of some vegetable oils Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 130–135 [64] Yilmaz, E., Sezgin, M., & Yilmaz, M (2010) Enantioselective hydrolysis of rasemic naproxen methyl ester with sol–gel encapsulated lipase in the presence of sporopollenin Journal of Molecular Catalysis B, 162-168 [65] Yucel, Y (2012) Optimization of immobilization conditions of Thermomyces lanuginosus lipase on olive pomace powder using response surface methodology Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 39–44 [66] Zou, B., & Hu, Y (2011) Functionalized ionic liquid modified mesoporous silica SBA-15: A novel, designable and efficient carrier for Porcine pancreas lipase Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 93–99 Trang 76 Luận văn tốt nghiệp Phụ lục PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN SỬ DỤNG TRONG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD Đường chuẩn protein dung môi nước Bảng P.1: Độ hấp thu nồng độ protein khác Nồng độ protein (mg/ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Độ hấp thu bước sóng 595 nm 0,038 0,054 0,104 0,157 0,227 0,323 0.4 Độ hấp thu 0.3 y = 0.3047x - 0.006 R² = 0.9816 0.2 0.1 0 0.2 -0.1 0.4 0.6 0.8 Nồng độ enzyme (mg/ml) Hình P.1: Đồ thị biểu diễn tương quan độ hấp thu nồng độ protein Kết đường chuẩn: Độ hấp thu = 0,304 × Nồng độ enzyme – 0,006 Hệ số tương quan R² = 0,981 > 0,95 Phương trình phù hợp để biểu diễn tương quan độ hấp thu nồng độ protein Đường chuẩn protein dung mơi có hexane Bảng P.2: Độ hấp thu nồng độ protein khác Nồng độ protein (mg/ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Độ hấp thu bước sóng 595 nm 0,043 0,055 0,073 0,106 0,174 0,206 Trang 77 Luận văn tốt nghiệp Phụ lục 0.25 Độ hấp thu 0.2 y = 0.1939x + 0.008 R² = 0.9691 0.15 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ enzyme (mg/ml) Hình P.2: Đồ thị biểu diễn tương quan độ hấp thu nồng độ protein Kết đường chuẩn: Độ hấp thu = 0,193 × Nồng độ enzyme + 0,008 Hệ số tương quan R² = 0,969> 0,95 Phương trình phù hợp để biểu diễn tương quan độ hấp thu nồng độ protein Trang 78 Luận văn tốt nghiệp Phụ lục PHỤ LỤC 2: TÍNH CHẤT CỦA LIPASE CỐ ĐỊNH Bảng P.3: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính lipase cố định pH 8,91 Hoạt tính riêng 351,928 1057,024 382,290 711,845 805,364 593,362 (U/g protein) Hoạt tính tương đối (%) 33,294 100,000 36,167 67,344 76,192 56,135 Bảng P.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase cố định Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 70 Hoạt tính riêng (U/g protein) 711,512 6968,348 6793,151 5570,399 904,064 Hoạt tính tương đối (%) 10,211 100,000 97,486 79,939 12,974 Bảng P.5: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính lipase cố định Nồng độ chất ([S]) (g/l) Hoạt tính protein) riêng (U/g V(mg/ml/phút) a a 125 100 75 804,193 828,784 0,047 0,048 50 25 885,069 723,439 522,473 0,052 0,0423 0,031 Xem acid béo thủy phân acid oleic Bảng P.6: Các thông số lipase cố định để xác định hệ số phương trình Lineweaver – Burk [S] (mg/ml) 30 40 50 60 70 1/[S] (ml/mg) 0,033 0,025 0,020 0,017 0,014 1/V(ml.phút/mg) 28,985 25,639 23,639 21,096 19,261 Trang 79 Luận văn tốt nghiệp Phụ lục PHỤ LỤC 3: TÍNH CHẤT CỦA LIPASE TỰ DO Bảng P.7: Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính lipase tự pH Hoạt tính riêng (U/g protein) 510,214 Hoạt tính tương đối (%) 2,949 8,91 553,757 2164,340 9745,598 17300,651 15881,366 3,201 12,510 56,331 100,000 91,796 Bảng P.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính lipase tự Nhiệt độ (oC) 30 40 50 60 70 Hoạt tính 9975,224 10849,019 12068,215 5305,478 3505,168 riêng(U/g protein) Hoạt tính tương đối (%) 82,657 89,897 100,000 43,962 29,045 Bảng P.9: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính lipase tự Nồng độ chất ([S]) (g/l) 125 Hoạt tính riêng (U/g protein) 11191,097 V(mg/ml/phút) a a 100 75 50 25 11725,574 11565,209 9720,892 8161,521 0,383 0,402 0,396 0,335 0,278 Xem acid béo thủy phân acid oleic Bảng P.10: Các thông số lipase tự để xác định hệ số phương trình Lineweaver – Burk [S] (mg/ml) 30 40 50 60 70 1/[S] (ml/mg) 0,033 0,025 0,020 0,017 0,014 1/V(ml.phút/mg) 3,433 3,083 2,987 2,817 2,640 Trang 80 Luận văn tốt nghiệp Phụ lục PHỤ LỤC 4: KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH Bảng P.11: Hoạt tính lipase cố định qua lần tái sử dụng Lần tái sử dụng Hoạt tính riêng 725,900 453,687 302,458 272,212 226,844 151,229 (U/g protein) Hoạt tính tương 100,000 đối (%) 62,500 41,667 Trang 81 37,500 31,250 20,833
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định, Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay