QUAN hệ GIỮA HAI CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN có KHẢ NĂNG KHỬ CLO yếm KHÍ CHLORODIBENZO p DIOXIN và CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4 TETRACHLOROBENZENE TRONG TRẦM TÍCH ô NHIỄM CHẤT độc DA CAM

63 31 0
  • Loading ...
1/63 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 12/04/2018, 21:49

Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT DIỆP NGUYỄN DIỄM CHÂU QUAN HỆ GIỮA HAI CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHỬ CLO YẾM KHÍ CHLORODIBENZO -P-DIOXIN VÀ CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4-TETRACHLOROBENZENE TRONG TRẦM TÍCH Ơ NHIỄM CHẤT ĐỘC DA CAM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Cần Thơ, 2011 -1- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT Tên đề tài: QUAN HỆ GIỮA HAI CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN CĨ KHẢ NĂNG KHỬ CLO YẾM KHÍ CHLORODIBENZO -P-DIOXIN VÀ CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4-TETRACHLOROBENZENE TRONG TRẦM TÍCH Ơ NHIỄM CHẤT ĐỘC DA CAM Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Dương Minh Viễn Diệp Nguyễn Diễm Châu MSSV: 3077437 Lớp: Khoa học đất K33 Cần Thơ, 2011 -2- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu LỜI CẢM TẠ Tôi xin gởi lời tri ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ anh Tôi không ngại khó khăn, gian khổ tiếp sức, lo lắng động viên cho Tơi có ngày hơm Tơi xin ghi ơn thầy Dương Minh Viễn tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hồn thành luận văn Chân thành biết ơn thầy Trần Bá Linh, cô Châu Thị Anh Thy cố vấn học tập lớp Khoa học Đất Khóa 33 giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt khóa học Xin gởi lời biết ơn đến quý Thầy Cô Bộ môn Khoa học đất quý Thầy Cô Khoa Nông Nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập Trường Tôi xin gởi lời biết ơn tới chị Thị Tú Linh giúp đỡ Tơi nhiều q trình thực đề tài giúp chỉnh sửa luận văn Các chị Phòng Sinh học đất, Bộ mơn Khoa học đất tận tình giúp đỡ Tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi thân gởi lời chúc sức khỏe, thành đạt đến bạn lớp Khoa học đất Khóa 33, người bạn động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Chúc bạn gặp nhiều may mắn sống DIỆP NGUYỄN DIỄM CHÂU -3- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu MỤC LỤC Trang Nhận xét cán hướng dẫn .i Nhận xét hội đồng ii Lời cam đoan iii Lý lịch cá nhân iv Lời cảm tạ v Mục lục .vi Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách biểu bảng viii Danh sách biểu hình .ix Tóm lược x MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIOXINS 1.1.1 Giới thiệu dioxins 1.1.2 Tính chất dioxins mơi trường 1.1.3 Nguồn gốc phát sinh dioxins môi trường 1.1.4 Sự tích tụ dioxins mơi trường chuỗi thức ăn 1.2 TÌNH HÌNH Ơ NHIỄM DIOXINS TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.2.1 Ô nhiễm dioxins giới .5 1.2.2 Ô nhiễm dioxins Việt Nam 1.3 KHẮC PHỤC Ô NHIỄM DIOXIN 1.3.1 Các biện pháp khắc phục ô nhiễm dioxins giới 1.3.2 Các biện pháp khắc phục ô nhiễm dioxins ứng dụng Việt Nam 10 1.4 CƠ CHẾ PHÂN HỦY DIOXINS BỞI VI KHUẨN 11 -4- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu 1.4.1 Sự phân hủy sinh học hiếu khí 11 1.4.2 Sự phân hủy sinh học yếm khí 12 1.5 MỘT SỐ TIẾN TRÌNH ẢNH HƯỞNG LÊN HOẠT ĐỘNG KHỬ CLO DIOXINS CỦA VI SINH VẬT YẾM KHÍ 14 1.5.1 Tiến trình metan hóa 15 1.5.2 Tiến trình acetate hóa 16 1.5.3 Tiến trình khử sulfate 16 1.6 NGUYÊN LÝ CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ KHỐI PHỔ (GC-MS - Gas Chromatography-Mass Spectrometry) SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DIOXINS 16 1.6.1 Tổng quan khối phổ sắc ký khí 16 1.6 Nguyên tắc hoạt động máy khối phổ .17 1.6 Khối phổ kết hợp với sắc kí khí (Gas Chromatography Mass Spectometry) 17 1.7 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ SỬ DỤNG PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI SINH VẬT THAM GIA VÀO SỰ PHÂN HỦY DIOXINS 19 1.7.1 Phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 19 1.7.1.1 Giới thiệu 19 1.7.1.2 Nguyên tắc 19 1.7.1.3 Cách tiến hành phản ứng PCR 20 1.7.1.4 Các thành phần phản ứng PCR 21 1.6.2 Phương pháp điện di biến tính tăng cấp (DGGE) 21 1.6.2.1 Giới thiệu 21 1.6.2.2 Nguyên tắc phản ứng 22 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP .23 2.1 PHƯƠNG TIỆN 23 2.1.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 23 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 23 2.1.3 Sử dụng cộng đồng vi khuẩn phân hủy Chlorodibenzo-p-dioxin .23 -5- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu 2.1.4 Các hóa chất dùng thí nghiệm 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP 24 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 24 2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi .25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 28 3.1 KHẢ NĂNG KHỬ CLO YẾM KHÍ CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN ĐỐI VỚI 1,2,3,4TCDD; 2,3-DCDD VÀ 2,3,7,8-TCDD TRONG TRẦM TÍCH Ơ NHIỄM DIOXINS 28 3.2 HOẠT ĐỘNG KHỬ CLO YẾM KHÍ CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN ĐỐI VỚI 1,2,3,4TeCB TRONG TRẦM TÍCH Ơ NHIỄM DIOXINS .30 3.2.1 Hoạt động khử clo 1,2,3,4-TeCB cộng đồng vi khuẩn khử PCDDs mẫu ủ lần .30 3.2.2 Hoạt động khử clo 1,2,3,4-TeCB cộng đồng vi khuẩn khử PCDDs mẫu ủ lần 34 3.3 MỐI QUAN HỆ GIỮA CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO PCDDs VÀ CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4-TeCB 35 3.3.1 Sự diện dòng vi khuẩn khử clo Chloroflexi nghiệm thức 35 3.3.2 Mối tương quan hai cộng đồng vi khuẩn khử clo PCDDs khử clo 1,2,3,4-TeCB 36 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .38 4.1 KẾT LUẬN 38 4.1 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ CHƯƠNG 42 -6- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Từ gốc 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2.4-Dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DiCB Dichlorobenzene DNA Deoxyribonucleic acid GCMS – QP 2010 Gas Chromatography Mass Spectometry QP 2010 I-TEQ International-Total Toxic Equivalents MCB Monochlorobenzene PCBs Polychlorinated Biphenyls PCDDs Polychlorodibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid TCDD 2,3,7,8 - Tetrachlorodibenzo-p-dioxin TCVN Vietnamese Standards TeCB Tetrachlorobenzene TEFs Toxic Equivalance Factors TEQ Toxicity Equivalent TrCB Trichlorobenzene WHO World Health Organization -7- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu DANH SÁCH BIỂU BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Giá trị TEF theo International System (I-TEFs; Kutz et al., 1990) Trang theo WHO System (WHO-TEQs; Van Den Berg et al., 1998, 2000) 1.2 Hàm lượng dioxins chứa số hợp chất khai hoang 1.3 Ngưỡng dioxins đất trầm tích điểm bị ô nhiễm nặng dioxin (tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8183: 2009) 1.4 Mức độ ảnh hưởng đến người ứng với nồng độ dioxins -8- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu DANH SÁCH BIỂU HÌNH Hình 1.1 1.2 Tên hình Trang Cấu trúc hóa học Polychlorinated dioxins Cơ chế tạo sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trình tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5-T 1.3 Sự tích tụ dioxins môi trường chuỗi thức ăn 1.4 Máy bay C130 phun chất độc da cam chiến tranh Việt Nam 1.5 1.6 Con đường phân hủy DF với cách thức oxy hóa kép phía bên (A) oxy hóa kép gốc(B) 12 Con đường loại bỏ clo 1,2,3,4-TCDD (A) 1,2,3,7,8-PeCDD (B) lồi “Dehalococcoides” sp dòng CBDB1 14 1.7 Dòng điện tử trao đổi chất yếm khí (Max M Häggblom, 2004) 14 1.8 Cấu tạo máy sắc kí khí khối phổ GC-MS 2.1 Các mẫu ủ bố trí hồn chỉnh 25 3.1 28 Sản phẩm mẫu 3T4 (trầm tích đập Đội 4) sau tháng ủ 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 18 Phổ đồ mẫu 3T4-1 cấy 1,2,3,4-TCDD phân tích máy GC-MS QP2010 28 Mẫu 8T6 (trầm tích hồ Lâm Ly) cấy 2,3-DCDD sau tháng ủ 29 Sản phẩm mẫu 8T6 (trầm tích hồ Lâm Ly) cấy 2,3,7,8-TCDD sau tháng ủ 30 Nồng độ (μM) 1,2,3,4-TeCB mẫu 3_1, 3_2 3_3 qua tháng ủ 31 Diện tích peak sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 3_1,3_2 3_3 qua tháng ủ 31 3.7 Nồng độ (μM) 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_1, 8_2 qua tháng ủ 32 3.8 Diện tích peak sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_1, 8_2 qua tháng ủ 3.9 Nồng độ (μM) 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_2’, 8_3’ qua tháng ủ 3.10 Diện tích peak sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_2’, 8_3’ tháng ủ 33 3.11 Nồng độ (μM) 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng 3.12 Diện tích peak sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng ủ 34 3.13 Nồng độ (μM) 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng 3.14 35 Diện tích peak sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng 3.15 3.16 33 34 35 Điện di đồ sản phẩm PCR nhóm vi khuẩn khử clo Chloroflexi nghiệm thức với cặp mồi 338F/1101R 36 Điện di đồ sản phẩm PCR nghiệm thức 37 -9- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Diệp Nguyễn Diễm Châu, 2011 “Quan hệ hai cộng đồng vi khuẩn có khả khử clo yếm khí Chlorodibenzo-p-dioxin cộng đồng khử clo 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene trầm tích nhiễm chất độc da cam” Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Giảng viên hướng dẫn khoa học TS Dương Minh Viễn TÓM LƯỢC Đề tài: “Quan hệ hai cộng đồng vi khuẩn có khả khử clo yếm khí Chlorodibenzo-p-dioxin cộng đồng khử clo 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene trầm tích nhiễm chất độc da cam” thực từ tháng 04/2010 đến tháng 04/2011 nhằm nghiên cứu khả khử clo cộng đồng vi khuẩn trầm tích nhiễm chất độc da cam 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene (1,2,3,4-TeCB) mối quan hệ cộng đồng vi khuẩn khử clo polychlorodibenzo-p-dioxins (PCDDs) với cộng đồng khử clo 1,2,3,4-TeCB trầm tích hồ Lâm Ly thuộc huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế trầm tích đập Đội 4, Cam Nghĩa, Quảng Trị Thí nghiệm thực phòng thí nghiệm Sinh học đất, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD Trường Đại học Cần Thơ Thí nghiệm sử dụng dòng vi khuẩn có khả khử clo 1,2,3,4-Tetrachlorodibenzop-dioxins (1,2,3,4-TCDD), 2,3-Dichlorodibenzo-p-dioxin (2,3-DCDD) 2,3,7,8- Tetrachlorodibenzo-p-dioxins (2,3,7,8-TCDD) làm giàu hai mẫu trầm tích đập Đội 4- Cam Nghĩa - Quảng Trị Hồ Lâm Ly- A Lưới- Thừa Thiên Huế chuyển sang môi trường ủ có bổ sung 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene (1,2,3,4-TeCB) Sau bố trí lấy mẫu thời điểm tháng thứ 1,2,3,7,11; sau tháng ủ chuyển sang môi trường ủ với 1,2,3,4-TeCB sử dụng cộng đồng vi khuẩn mẫu ủ lần 1, lấy tiêu tháng thứ 2;3 Đem mẫu phân tích khử 1,2,3,4-TeCB máy GC-MS QP2010 Đồng thời trích DNA mẫu ủ sử dụng phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) kép phương pháp điện di biến tính tăng cấp (DGGE) phân tích cộng đồng vi khuẩn tham gia chuyển hóa 1,2,3,4-TeCB; 1,2,3,4-TCDD; 2,3-DCDD 2,3,7,8-TCDD Sau 11 tháng ủ lần tháng mẫu chuyển lần 2, kết thí nghiệm cho thấy có hoạt động khử clo yếm khí 1,2,3,4-TeCB cộng đồng vi khuẩn khử clo 1,2,3,4-TCDD; 2,3DCDD 2,3,7,8-TCDD Kết phân tích với phương pháp DGGE, cộng đồng vi khuẩn khử clo yếm khí mẫu ủ đa dạng Cộng đồng vi khuẩn khử clo 1,2,3,4-TeCB có thành phần khơng khác -10- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Cộng đồng vi khuẩn khử clo PCDDs có khả khử clo 1,2,3,4-TeCB sau 11 tháng ủ lần tháng ủ lần Sản phẩm chiếm ưu 1,2,3-TrCB - Cộng đồng vi khuẩn khử clo 1,2,3,4-TeCB có thành phần khơng khác biệt so với cộng đồng vi khuẩn khử clo PCDDs môi trường ủ với 1,2,3,4-TeCB nồng độ cao số dòng vi khuẩn tham gia trực tiếp khử clo 1,2,3,4-TeCB có mật số tăng lên - Giữa dòng vi khuẩn khử clo 1,2,3,4-TCDD; 2,3-DCDD 2,3,7,8-TCDD khơng có khác biệt số lượng dòng vi khuẩn 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục giải mã trình tự DNA băng có liên quan đến dòng vi khuẩn khử 1,2,3,4-TeCB dựa sở liệu NCBI để thành lập phả hệ - Nghiên cứu ảnh hưởng 1,2,3,4-TeCB lên hoạt động khử clo yếm khí Tetrachlorodibenzo-p-dioxin cộng đồng vi sinh vật khả sử dụng 1,2,3,4TeCB phân lập vi khuẩn khử clo trầm tích vùng ô nhiễm chất độc da cam -49- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu TÀI LIỆU THAM KHẢO Barry Dellinger (2003) Treatment and prevention of formation of dioxins U.S.-Viet Nam Scientific workshop on dioxin screening, remediation methodologies and site characterization: 76-79 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999) Di truyền phân tử Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông Nghiệp TP.HCM Bunge, M., Adrian, L., Klaus, A., Opel, M., Lorenz, W.G., Andresen, J.R., Gorisch, H., Lechner, U (2003) Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium Nature 421: 357-360 Bünge, M., Adrian, L., Klaus, A., Opel, M., Lorenz, W.G., Andresen, J.R., Gorisch, H., Lechner, U (2003) Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium Nature 421: 357-360 Dương Minh Viễn (2004) Giáo trình sinh thái và sinh học đất Bộ mơn Khoa học đất Đặng Đình Bạch et al., 2006 Giáo trình hóa học mơi trường Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, trang 222-224 Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang (2008) Khảo sát vi sinh vật vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin khu vực sân bay Đà Nẵng khử độc đất nhiễm điều kiện phòng thí nghiệm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6(4A)837-846 Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng (1985) Các phương pháp sắc kí Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Fennel DE, Nijenhui I, Wilson S, Zinder S, Hägglom MM (2004) Dehalococcoides ethenogenes Strain 195 Reductively Dechlorinates Diverse Chlorinated Aromatic Pollutants Environ Sci Technol 38: 2075-2081 Habe H., Chung J., Lee J., Kasuga K., Yoshida T., Nojiri H., and Omori T (2001) Degradation of Chlorinated dibenzofurans and Dibenzo-p-Dioxins by Two Types of Bacteria Having Angular Dioxygenases with Different Features Appl Environ Microbiol 67: 3610-3617 -50- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Habe H., Chung J., Lee J., Kasuga K., Yoshida T., Nojiri H., and Omori T (2001) Degradation of Chlorinated dibenzofurans and Dibenzo-p-Dioxin by Two Types of Bacteria Having Angular Dioxygenase with Different Features Appl Environ Microbiol 67: 3610-3617 Hendrickson ER, Payne JA, Young RM, Starr MG, Perry MP, Fahnestock S, Ellis DE, Ebersole RC (2002) Molecular analysic of Dehalococcoides 16S ribosomal DNA from chloroethene-contaminated sites throughout North America and Europe Appl Environ Microbiol 68: 485-496 Hiraishi A (2003) Biodiversity of dioxin-degrating microorganisms and potential utilisation in bioremediation Microb Environ 18: 105-123 Hiraishi A, Kaiya S, Miyakoda H, Futamara H (2005b) Biotransformation of polychlorinated dioxin and microbial community dynamic in sediment microcosm at different contamination levels Microb Environ 20: 227-242 Hiraishi A, Miyakoda H, Murayama T, Kato K, Futamara H (2005a) Estimation of “Dehalococcoides” population in lake sediment contaminated with low levels of PCDD Microb Environ 20: 216-226 Holscher T, Goarisch H, Adrian L(2003) Reductive dehalogenation of chlorobenzene congeners in cell extracts of Dehalococcoides sp Strain CBDB1 Microb Environ Microbiol 69: 2999-3001 Holscher T, Krajmalnik – Brown R, Ritalahti KM, von Wintzingerode F, Gorisch H, Loffler FE, Adrian L (2004) Multiple nonidentical reductive-dehalogenasehomologous genes are common in Dehalococcoides Microb Environ Microbiol 70: 5290-5297 Jik A.Field, Reyes Sierra (2004) Review of scientific literature on microbial dechlorination and chlorination of key chlorinated compounds: 7-23 Nguyễn Bá Hữu, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006) Xác định nhóm vi khuẩn khử Chlor Dehalococcoides xử lý tẩy độc đất nhiễm chất dioxin Tạp chí cơng nghệ sinh học 4(4): 519-526 -51- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Thanh Phương, Đặng Thị Cẩm Hà (2004) Sử dụng phương pháp điện di gel Gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng vi sinh vật công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học Tạp chí Cơng nghệ sinh học 2(3): 381-388 Nguyễn Văn Minh (2003) Nghiên cứu tẩy độc Việt Nam Hội thảo Việt NamHoa Kỳ phương pháp xác định, xử lý đánh giá vùng ô nhiễm dioxin Trang 80-85 Phạm Ngọc Long (2009) Nghiên cứu khả phân hủy 2,4,5-T đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập từ Bioreactor xử lý dất nhiễm chất diệt cỏ/Dioxin Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ sinh học Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Phạm Thành Hổ (1998) Di truyền học NXB Giáo dục Trần Xuân Thu (2003) Bước đầu đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin môi trường Việt Nam Hội thảo Việt Nam-Hoa Kỳ phương pháp xác định, xử lý đánh giá vùng ô nhiễm dioxin Trang 38-47 Vien M Duong, Joong-Wook Park, Young-Beom Ahn, Max M Häggblom (2009) Dechlorination of Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins in soils and sediments from Areas Sprayed with Agent orange Rutgers School Environmental and Biological Sciences Võ Qúy, Đặng Huy Huỳnh, Mai Đình n, Phùng Tửu Bơi, Phạm Bình Quyền (2002) Thử đánh giá lại hậu chất màu da cam/dioxin lên trường vùng A Lưới sau gần 30 năm kết thúc chiến tranh Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài người thiên nhiên Hội thảo quốc tế lần II: 205-213 -52- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu PHỤ CHƯƠNG  Phương pháp pha dung dịch yếm khí (thể tích 1L): theo Christof (Christof H et al., 1992) Houwen (Houwen et al., 1987) Đầu tiên chuẩn bị hóa chất để pha mơi trường khống theo bảng sau: Bảng: Hóa chất pha mơi trường khống Hóa chất g/L KH2PO4 1.77 NaCl 0.3 NH4Cl 0.3 CaCl2.2H2O 0.11 MgCl2.2H2O 0.1 NaHCO3 0.8 Ghi Làm dung dịch cách sục khí N2 40 phút Sau dùng hỗn hợp ( 70% N2 30% CO2) sục lại phút, sục cho NaHCO3 vào Sau sục, đậy lọ nút cao su đem khử trùng ướt Tiếp theo pha dung dịch vi lượng Bảng: Hóa chất pha dung dịch vi lượng Muối vi lượng 1/L g/L MnCl2.6H2O 0.05 H3PO4 0.05 ZnCl2 0.05 CoCl2.6H2O 0.05 NiCl2.6H2O 0.05 CuCl.2H2O 0.03 FeCl2.4H2O (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.05 AlCl3 0.05 EDTA 0.5 HCl đậm đặc 1mL -53- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Dung dịch vi lượng phải khử trùng ướt sục với khí Argon Kế đến pha dung dịch vitamin Bảng: Hóa chất pha dung dịch Vitamin Vitamin/L g/L d-biotin 0.02 Folic acid 0.02 Thiamin hydrocloride 0.05 Pyrodoxine hydrocloride 0.1 Riboflavin 0.05 Nicotinic acid 0.05 DL_calcium pantothenate 0.05 Vitamin B12 0.01 p-aminobenzoic acid 0.05 Lipoic acid ( thiotic acid) 0.05 1,4-napthaquinone 0.04 Nicotinamide 0.1 Hemin 0.01 Dung dịch Vitamin phải khử trùng ướt sục khí Argon Hỗn hợp chất cho điện tử gồm hóa chất sau: Pyruvic acid (hoặc pyruvate) + acetic (hoặc acetate) + butyric (hoặc butyrate) + lactic (hoặc lactate) + propionic (hoặc propiovate) 250nM chất Đem khử trùng sục khí Argon  Pha mơi trường yếm khí với thể tích 1L: 1L mơi trường khoáng + 1mL + 0.1mL dung dịch vitamin + 4mL hỗn hợp chất cho điện tử  Thành phần phản ứng chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) (đơn vị: μL) GoTaq ® Green Master Mix, 2X 12,5 -54- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Mồi xuôi 10μM 0.5 Mồi ngược 10μM 0.5 Mẫu DNA Nước 10,5 Tổng thể tích 25 μL Sử dụng cặp mồi 338F/1101R cặp 341F-GC/534R  Quy trình trích mẫu phân tích hóa học Lấy 2mL mẫu cần phân tích từ lọ 40mL bố trí vào lọ bi Thêm 3mL hỗn hợp toluene: acetone (2:1) vào lọ bi Trộn mẫu máy vortex đặt máy lắc 24h, tốc độ 130 vòng/phút Chuẩn bị lọ bi tương ứng với mẫu lấy Đem lọ bi trộn mẫu máy vortex thật kỹ, sau ly tâm tốc độ 2500 vòng phút Dùng pipet thủy tinh hút hết phần dung dịch chuyển sang lọ bi Thêm 2mL hỗn hợp toluene: acetone (2:1) vào lọ bi đất Trộn mẫu máy vortex thật kỹ đặt máy lắc 24h, tốc độ 130 vòng/phút Đem lọ bi trộn mẫu máy vortex thật kỹ, sau ly tâm tốc độ 2500 vòng phút Dùng pipet thủy tinh hút hết phần dung dịch chuyển sang lọ bi chứa dung dịch chuyển trước Thêm 1mL hợp toluene: acetone (2:1) vào lọ bi đất Trộn mẫu máy vortex thật kỹ Ly tâm tốc độ 2500 vòng phút Dùng pipet thủy tinh hút hết phần dung dịch chuyển sang lọ bi chứa dung dịch chuyển trước Chuẩn bị lọ bi tương ứng để trích dung dịch Trộn mẫu máy vortex kỹ lọ bi chứa dung dịch chuyển, sau ly tâm tốc độ 2500 vòng phút -55- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Dùng pipet thủy tinh hút phần nước chuyển sang lọ bi chuẩn bị Thêm 2mL hỗn hợp toluene: acetone (2:1) vào lọ bi vừa trích Trộn mẫu máy vortex kỹ, sau ly tâm tốc độ 2500 vòng phút Dùng pipet thủy tinh hút phần nước chuyển sang lọ bi chứa phần nước Chú ý: cần kiểm tra xem lọ bi chứa phần nước có bị nhiễm nước hay khơng Nếu có, cần chuyển sang lọ bi Để lọ bi bay tự nhiên tủ hút đến thể tích khỏang 0.25 - 0.5mL , sau dùng pipet thủy tinh thêm toluene để đạt thể tích 1mL Chuẩn bị ống vial thể tích 1,5mL, bên đặt ống insert để chuyển mẫu Dùng pipet thủy tinh chuyển lượng mẫu vào insert tương ứng vạch 1mL vial chứa insert Phân tích mẫu máy sắc ký khí khối phổ GCMS - QP2010 với điều kiện ghi mẫu: Cột DB-1, kích thước 30m x 0.32mm; film 0.25μm Nhiệt độ đầu cột: 70oC Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250 oC Nhiệt độ đầu dò: 280 oC Chế độ dòng: khơng chia (splitless) Kỹ thuật bơm mẫu: kim nóng Thể tích mẫu bơm vào buồng bơm mẫu: 1μL  Quy trình trích DNA theo Kit hãng PowerSoil® Isolation Cân 0.25g mẫu đất cần phân tích vào ống Power Bead nhà cung cấp Trộn ống máy vortex Kiểm tra dung dịch C1 Nếu dung dịch C1 trạng thái kết tủa phải nung lên đến nhiệt độ 60oC để dung dịch C1 hòa tan trước sử dụng Cho 60 μL dung dịch C1 vào ống Lật lên xuống vài lần, sau trộn mẫu máy vortex thật nhanh -56- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Đặt ống lên máy MO BIO Vortex Adapter trộn mẫu tốc độ tối đa thời gian 15 – 20 phút Ly tâm ống với tốc độ 10.000xg 30 giây nhiệt độ phòng Chú ý: tốc độ ly tâm khơng đuợc vượt q 10.000xg khơng ống bị vỡ Chuyển dung dịch nước qua ống 2mL Collection Chú ý: luợng nuớc dao động từ 400 – 500μL, dung dịch nước lẫn hạt đất Thêm 250μL dung dịch C2 vào ống 2mL Collection Trộn mẫu máy vortex giây ủ mẫu 4oC phút Ly tâm ống với tốc độ 10.000xg phút nhiệt độ phòng Chuyển 600μL dung dịch nuớc qua ống 2mL Collection Chú ý: tránh cặn lắng chuyển dung dịch Thêm 200μL dung dịch C3 vào ống Trộn mẫu máy vortex thật nhẹ, ủ 40C phút Ly tâm ống tốc độ 10.000xg phút nhiệt độ phòng Chuyển 750μL dung dịch nước qua ống 2mL Collection Chú ý: tránh cặn lắng chuyển dung dịch Lắc dung dịch C4 trước sử dụng Thêm 1200 μL dung dịch C4 vào ống Trộn mẫu máy vortex giây Cho khoảng 675μL dung dịch vào màng lọc Trước đưa vào cần trộn dung dịch ống Ly tâm ống với tốc độ 10.000xg phút nhiệt độ phòng Loại bỏ phần dung dịch qua màng lọc Tiếp tục bước lần Thêm 500μL dung dịch C5 Ly tâm ống với tốc độ 10.000xg 30 giây nhiệt độ phòng Loại bỏ phần nước qua màng lọc Ly tâm lần với tốc độ 10.000xg phút nhiệt độ phòng Cẩn thận đặt màng lọc vào ống 2mL Collection Cần loại hết dung dịch C5 màng lọc Để yên khoảng 15 phút nhiệt độ phòng Thêm 100μL dung dịch C6 vào ống Để yên phút -57- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Ly tâm ống với tốc độ 10.000xg 30 giây nhiệt độ phòng Loại bỏ màng lọc DNA ống trữ nhiệt độ -20 đến -80 oC  Phương pháp điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5% Đặt khay nơi phẳng, để khuôn vào khay, đặt lược vào khuôn, kiểm tra cân khay miếng bọt khí Cân 1,5g agarose cho vào chai thủy tinh xanh dung tích 500mL, thêm 100 mL dung dịch TAE 0.5X, lắc nhẹ cho agarose tan Đặt chai thủy tinh xanh vào lò vi sóng, đun chế độ phù hợp khoảng - phút cho agarose hòa tan hoàn toàn, tạo thành dung dịch suốt Lấy chai thủy tinh xanh khỏi lò vi sóng; đậy nắp lại tránh bay hơi; để nguội khoảng 70 oC Đổ nhẹ dung dịch vào khuôn chuẩn bị sẵn, tránh bọt khí, để nguội khoảng 20 phút cho gel đặc lại, lấy nhẹ lược khỏi khuôn, tránh bể giếng, lấy khuôn gel khỏi khay chuẩn bị chạy điện di Bước 2: Chạy điện di gel agarose Đặt khuôn gel vào bể điện di TAE buffer 0.5X cho ngập giếng Load (nạp) vào giếng μL dung dịch sản phẩm PCR Load khoảng μL thang chuẩn vào giếng lại Bật nguồn điện, cho thiết bị chạy 150V 35 phút Quan sát thấy chất thị màu di chuyển đến gần cuối gel (khoảng - 1,5 cm), tắt nguồn điện, lấy khuôn gel khỏi thiết bị điện di chuẩn bị chụp hình gel Bước 3: Chụp hình gel chạy điện di Sau chạy gel sản phẩm PCR, quan sát kết băng DNA xuất gel hệ thống chụp hình gel để kiểm tra chất lượng dịch trích DNA Đồng thời, phát dòng vi khuẩn cách so sánh độ dài băng DNA vi khuẩn phân lập xuất với độ dài băng DNA so với thang chuẩn gel Cuối chụp hình gel chứa sản phẩm PCR đoạn DNA đặc trưng vi khuẩn có lưu vào máy tính Nếu băng DNA dòng vi khuẩn xuất vị trí phù hợp với vị trí 800 bp (vạch nhận diện dòng vi khuẩn khử clo Chloroflexi) so với thang chuẩn chọn để tiếp tục chạy PCR với cặp mồi tổng qt  Quy trình chạy điện di biến tính tăng cấp (DGGE) -58- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Chuẩn bị nồng độ gel 8% ống nhựa thí nghiệm theo bảng sau: 40% 60% Stacking 100% DS 4.80 7.20 0.00 Nước 4.56 2.16 3.32 40% PAGE 2.40 2.40 0.60 50 x TAE 0.24 0.24 0.08 Tổng(mL) 12.00 12.00 4.00 Thêm 100 μL APS 10% cho hai ống 60% 40% Thêm μL TEMED vào ống 60%, trộn cho vào ống tiêm Thêm μL TEMED vào ống 40%, trộn cho vào ống tiêm Đổ gel vào Cho mL butanol lên bề mặt trơn láng Để yên nhiệt độ phòng 2h Khởi động làm nóng máy chạy DGGE khoảng 1h nhiệt độ 600C Sau tạo dung dịch stacking khoảng 2h từ bắt đầu khởi động máy Thêm 33 μL APS 10% μL TEMED vào 4mL hỗn hợp stacking Trộn đều, đổ lên bề mặt gel, để nhiệt độ phòng 30 phút Lấy mẫu thử: 25 μL 2x thuốc nhuộm + 25 μL sản phẩm chạy PCR Mẫu chạy điện di dung dịch đệm TAE 1X 60oC 16h với hiệu điện 45V Sau điện di gel nhuộm 20 phút thuốc nhuộm Ethidium Bromide Mẫu sau nhuộm quan sát đèn tử ngoại (UV) thiết bị chụp hình Gel Logic 1500 Imaging System hãng Kodak PHỤ CHƯƠNG Tỷ lệ phần trăm (%) sản phẩm mẫu 3T4 sau tháng ủ -59- Luận văn đại học Nghiệm thức SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu 3T4-1 3T4-2 3T4-3 1,2,3,4-TCDD 15.493 6.631 15.622 1,2,4-TrCDD 0.069 0.116 0.245 1,2,3-TrCDD 0.178 0.013 1,4-DCDD 0.270 29.944 1,2-DCDD 57.444 0.044 1,3-DCDD 0.879 0.073 Sản phẩm 2,3-DCDD 2-MCDD 0.015 22.910 9.479 1-MCDD DD (Dibenzo-p-dioxin ) 40.990 2.758 19.331 19.699 34.352 23.445 Tỷ lệ phần trăm (%) sản phẩm mẫu 8T6 cấy 2,3,7,8-TCDD sau tháng ủ Nghiệm thức 8T6-2 8T6-3 2,3,7,8-TCDD 66.099 63.985 2,3,7-TrCDD 0.567 0.513 2,3-DCDD 0.710 0.667 2-MCDD 32.445 34.473 DD (Dibenzo-p-dioxin) 0.178 0.344 Sản phẩm Tỷ lệ phần trăm (%) mẫu 8T6 cấy 2,3-DCDD sau tháng ủ Nghiệm thức 8T6-1 8T6-2 2-MCDD 8.123 7.208 2,3-DCDD 91.860 92.778 Sản phẩm Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB mẫu 3_1, 3_2 3_3 qua tháng ủ -60- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Thời gian (tháng) Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB 17.029 12.68 8.46 5.375 11 0.058 Diện tích peak trung bình sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 3_1,3_2 3_3 qua tháng ủ Thời gian Diện tích peak trung Diện tích peak trung Diện tích peak trung (tháng) bình 1,2,3-TeCB bình 1,2-DiCB bình 1,3-DiCB 32392 41570 82502 94995 11 83324 4541 4560 Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_1, 8_2 qua tháng ủ Thời gian (tháng) Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB 12.711 8.110 4.116 0.068 11 0.046 Diện tích peak trung bình sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_1, 8_2 qua tháng ủ -61- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Thời gian (tháng) Diện tích peak trung bình 1,2,3-TeCB 7918 6977 35209 64766 11 29787 Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_2’, 8_3’ qua tháng ủ Thời gian (tháng) Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB 6.796 5.042 4.248 0.177 11 0.087 Diện tích peak trung bình sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu 8_2’, 8_3’ qua tháng ủ Thời gian Diện tích peak trung bình 1,2,3- Diện tích peak trung bình (tháng) TeCB 1,3-DiCB 294 2530 116 2711 313 2083 250765 11 43040 Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng Nghiệm thức Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB -62- Luận văn đại học SVTH: Diệp Nguyễn Diễm Châu Mẫu (3_1, 3_2, 3_3) 3.730 Mẫu (8_1, 8_2) 12.943 Mẫu 8' (8_2’, 8_3’) 2.531 Diện tích peak trung bình sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng Diện tích peak trung bình Diện tích peak trung bình 1,2,3-TeCB 1,3-DiCB Mẫu (3_1, 3_2, 3_3) 129916 61646 Mẫu (8_1, 8_2) 71401 Mẫu 8' (8_2’, 8_3’) 20502 Nghiệm thức Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng Nghiệm thức Nồng độ (μM) trung bình 1,2,3,4-TeCB Mẫu (3_1, 3_2, 3_3) 3.642 Mẫu (8_1, 8_2) 5.174 Mẫu 8' (8_2’, 8_3’) 0.197 Diện tích peak trung bình sản phẩm khử 1,2,3,4-TeCB mẫu ủ đợt sau tháng Diện tích peak trung bình Diện tích peak trung bình 1,2,3-TeCB 1,3-DiCB Mẫu (3_1, 3_2, 3_3) 22008 7942 Mẫu (8_1, 8_2) 26088 Mẫu 8' (8_2’, 8_3’) 39756 Nghiệm thức -63- ... Nguyễn Diễm Châu, 2011 Quan hệ hai cộng đồng vi khuẩn có khả khử clo yếm khí Chlorodibenzo- p-dioxin cộng đồng khử clo 1,2,3,4-Tetrachlorobenzene trầm tích nhiễm chất độc da cam Luận văn tốt nghiệp... lập vi khuẩn khử clo PCDDs sử dụng TeCB chất mồi halogen thúc đẩy vi khuẩn khử PCDDs Chính đề tài Quan hệ hai cộng đồng vi khuẩn có khả khử clo yếm khí chlorodibenzo- p-dioxins cộng đồng khử clo. .. –Tetrachlorobenzene trầm tích nhiễm chất độc da cam thực nhằm nghiên cứu khả khử clo cộng đồng vi khuẩn trầm tích nhiễm dioxins TeCB mối quan hệ cộng đồng khử clo chlorodibenzo- p-dioxins trước cộng đồng bổ
- Xem thêm -

Xem thêm: QUAN hệ GIỮA HAI CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN có KHẢ NĂNG KHỬ CLO yếm KHÍ CHLORODIBENZO p DIOXIN và CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4 TETRACHLOROBENZENE TRONG TRẦM TÍCH ô NHIỄM CHẤT độc DA CAM , QUAN hệ GIỮA HAI CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN có KHẢ NĂNG KHỬ CLO yếm KHÍ CHLORODIBENZO p DIOXIN và CỘNG ĐỒNG KHỬ CLO 1,2,3,4 TETRACHLOROBENZENE TRONG TRẦM TÍCH ô NHIỄM CHẤT độc DA CAM

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay