BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y ****************** LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM, GÀ TA CHĂN NUÔI THEO PHƯƠNG THỨC CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR, NUÔI CẤY PHÂN LẬP TRÊN PHƠI TRỨNG VÀ BỆNH TÍCH VI THỂ Họ tên sinh viên : LÊ THỊ NGA Lớp : DH07DY Ngành : Dược Thú Y Niên khóa : 2007 – 2012 Tháng 08/2012 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y ****************** LÊ THỊ NGA CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM, GÀ TA CHĂN NUÔI THEO PHƯƠNG THỨC CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR, NUÔI CẤY PHÂN LẬP TRÊN PHÔI TRỨNG VÀ BỆNH TÍCH VI THỂ Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ Thú y Giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Năm Tháng 08/2012 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực hiện: Lê Thị Nga Tên luận văn: “Chẩn đoán bệnh Marek gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn nuôi theo phương thức công nghiệp kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập phơi trứng bệnh tích vi thể” Đã hồn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp Hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…… Giáo viên hướng dẫn ThS.Nguyễn Thị Thu Năm ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gởi lời biết ơn đến bố mẹ hết lòng chăm lo, dạy dỗ, vất vả lo toan tạo điều kiện tốt cho ăn học khôn lớn nên người Xin cảm ơn Ban giám hiệu Nhà Trường Nông Lâm, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y tận tình truyền đạt cho chúng tơi kiến thức khoa học chuyên môn, thực tế đời sống suốt năm năm qua Đó kiến thức vô quý giá, hành trang thiếu cho sinh viên trước bước vào đời Xin khắc ghi lòng kính trọng nhớ ơn Nguyễn Thị Thu Năm hết lòng dìu dắt, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình thực hồn thành đề tài tốt nghiệp, chia bảo động viên em lúc khó khăn Xin cảm ơn Ban Quản Lý Bệnh Viện Thú Y tạo điều tốt để tơi hồn thành đề tài Xin cảm ơn anh Lê Trần Thái Anh (công ty thuốc Viphavet), chị Lê Thị Tuyết Toan, anh Nguyễn Phạm Huỳnh chị làm việc Bệnh Viện Thú Y giúp đỡ nhiều thực tập Cuối xin cảm ơn tất bạn bè giúp đỡ, chia với khó khăn suốt thời gian học tập thực tập Chân thành cảm ơn Lê Thị Nga iii TĨM TẮT Đề tài “Chẩn đốn bệnh Marek gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn nuôi theo phương thức công nghiệp kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập phơi trứng bệnh tích vi thể” tiến hành Bệnh Viện Thú Y, thời gian từ ngày 01/02/2012 đến 30/06/2012 Chúng tơi thu thập 21 ca có triệu chứng bệnh tích nghi ngờ bệnh Marek, tiến hành lấy mẫu thực phản ứng PCR, nuôi cấy phân lập phôi trứng cắt vi thể để xác định bệnh Marek gà Chúng ghi nhận kết sau: Kỹ thuật PCR xác định bệnh Marek cho kết dương tính là: 85,71 % 16 ca nuôi cấy phân lập qua phôi trứng cho kết âm tính (khơng xuất nốt pock) Thực bệnh tích vi thể cho kết nghi ngờ bệnh Marek 100 % iv MỤC LỤC Trang tựa i Xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách hình ix Danh sách bảng x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử bệnh 2.2 Căn bệnh 2.2.1 Phân loại hình thái 2.2.2 Kháng nguyên 2.2.3 Sức đề kháng 2.2.4 Nuôi cấy 2.2.5 Khả gây bệnh 2.3 Dịch tễ học 2.3.1 Loài mắc bệnh 2.3.2 Chất chứa bệnh 2.3.4 Cơ chế sinh bệnh v 2.4 Triệu chứng 2.4.1 Thể mãn tính 2.4.2 Thể cấp tính 10 2.5 Bệnh tích đại thể 11 2.5.1 Thể mãn tính 11 2.5.2 Thể cấp tính 11 2.6 Bệnh tích vi thể 12 2.7 Chẩn đoán 13 2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 13 2.7.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 13 2.7.3 Chẩn đoán phân biệt 13 2.8 Phòng bệnh 15 2.3 Giới thiệu phương pháp PCR 15 2.3.1 Giới thiệu 15 2.3.2 Nguyên tắc chung 15 2.3.3 Các giai đoạn phản ứng PCR 16 2.3.4 Thành phần phản ứng PCR 18 2.3.4.1 Tag DNA polymerase 18 2.3.4.2 Đoạn mồi hay primer 18 2.3.4.3 Các nucleotide (dNTP) 18 2.3.4.4 MgCl2 19 2.3.4.5 Bufer 19 2.3.4.6 Nước 19 2.3.4.7 DNA khuôn mẫu 19 2.3.5 Ưu nhược điểm kỹ thuật PCR 20 2.3.6 Kiểm tra kết PCR 20 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 22 vi 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.1.1 Thời gian 22 3.1.2 Địa điểm 22 3.2 Đối tượng khảo sát 22 3.3 Vật liệu, hóa chất dụng cụ thí nghiệm 22 3.3.1 Vật liệu 22 3.3.2 Hóa chất 22 3.3.3 Dụng cụ 23 3.4 Nội dung thí nghiệm 23 3.5 Phương pháp nghiên cứu 23 3.5.1 Xác định bệnh Marek kỹ thuật PCR 25 3.5.1.1 Ly trích DNA từ bệnh phẩm 25 3.5.1.2 Phản ứng PCR để xác định bệnh Marek gà 26 3.5.2 Phân lập MDV phôi trứng gà 27 3.5.3 Lấy mẫu cắt vi thể 30 3.6 Đánh giá phương pháp chẩn đoán MD 32 3.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết chẩn đoán bệnh Marek kỹ thuật PCR 33 4.3 Kết chẩn đoán MD qua bệnh tích vi thể 36 4.4 Đánh giá kỹ thuật PCR, ni cấy phơi trứng bệnh tích vi thể dùng chẩn đoán MD 38 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ TÓM TẮT MD: Marek’s Disease MDV: Marek’s Disease Virus HVT: Herpese Virus of Turkey Meq: Marek’s ECoQ MATSA: Marek’s disease turmor – associated surface antigent CPE: Cytopathogen Effect DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: deoxyribonucleic triphosphate PBS: Phosphate Buffered Saline PCR: Polymera Chain Reaction Tag: Thermus aquaticus TBE: Tris Berate EDTA Tm: Temperature melting UV: Utral Violet Bp: Base pair µl: Microlit µm: micromole ng: nanograms nM: nanomolar mM: milimolar Ds DNA: Double strand Deoxyribonucleic acid ss DNA: single strand Deoxyribonucleic acid CAM: Chorio Atlantoid Membran SPF: System Pathogen Free viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế sinh bệnh MDV Hình 2.2 Gà bị liệt Hình 2.3 Trên da có nhiều khối u Hình 2.4 Con bị hẹp méo mó, mống mắt đổi màu (a), mắt gà bình thường (b) 10 Hình 2.5 Dây thần kinh sưng to 11 Hình 2.6 Gan có nhiều khối u 12 Hình 2.7 Nguyên tắc PCR 17 Hình 3.1 Cách chọn lơng cánh 24 Hình 3.2 Gan có khối u 24 Hình 3.3 Lách sưng, có khối u 25 Hình 3.4 Dạ dày tuyến sưng to, xuất huyết 25 Hình 3.5 Đường tiêm túi lòng đỏ 28 Hình 3.6 (a) sát trùng buồng hơi; (b) tiêm huyễn dịch 28 Hình 3.7 Cắt vỏ trứng hút nước trứng 29 Hình 4.1 Kết chạy PCR .34 Hình 4.2 Màng CAM thu hoạch trứng 35 Hình 4.3 Lympho lan tràn khắp nơi mô gan 38 Hình 4.4 Lmpho xâm nhập múi tuyến dày tuyến 37 ix lympho quanh virus Marek Số nốt sần trắng màng CAM từ – 20 Von Biilow đánh giá dấu cộng (+); có 20 – 100 nốt sần trắng đánh giá hai dấu cộng (++) 100 pock có màng CAM đánh giá ba dấu cộng (+++) Nếu màng CAM có pock xem kết âm tính Từ – 20 pock cho kết nghi ngờ 20 pock khẳng định dương tính Thơng thường có 30 – 50 % số phơi sống có số pock từ hai dấu cộng (++) trở lên việc khẳng định bệnh hoàn toàn chắn Nếu số pock tiêu phải kết hợp với phương pháp khác để chẩn đoán bệnh (Lê Văn Năm, 2003) Xác định MDV nước trứng kỹ thuật PCR Sau nuôi cấy phân lập phôi, thu hoạch nước trứng từ mẫu không xác định kết chắn từ việc quan sát nốt pock, đem ly tâm lấy phần nước phía để tiếp tục kiểm tra kỹ thuật PCR nhằm xác định diện MDV Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ mẫu dương tính ni cấy phơi trứng Tỷ lệ mẫu nước trứng có PCR dương tính 3.5.3 Lấy mẫu cắt vi thể Bảng 3.2 Số quan thực cắt mẫu vi thể Cơ quan Gan Số mẫu 16 Lách  16 Thận Tim Dạ dày tuyến 14 Ruột Dây thần kinh đùi Tổng số mẫu 10 81 Sau thu thập mẫu tiến hành cắt mẫu vi thể theo qui trình cắt mẫu vi thể Bệnh viện Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm Tp HCM 30 Quy trình cắt mẫu vi thể Bệnh viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM  Xử lý mô bệnh phẩm Cắt mẫu bệnh phẩm kích thước cm2 nơi tiếp giáp mô lành mô bệnh với độ dày 0,1 cm cho vào ô cassette, kèm theo ký hiệu mẫu mô Chuyển qua dung dịch formol 10 % (ít lâu 24 giờ, thường ngâm vào buổi chiều để qua đêm) Sau xử lý formol 10 %, lấy cassette tiếp tục cho vào dung dịch xử lý mẫu mô, lắc tốc độ 1.000 vòng/ phút (máy lắc ngang) - Dung dịch cồn 96 0C/4 - Dung dịch cồn 96 0C/2 - Xylen/2 (không nên dùng lại xylen này) Lấy cassette khỏi lọ xylen để khô ráo, sau cho vào nồi paraffin tan chảy nhiệt độ 60 0C/30 phút Mô sau xử lý đúc thành block khuôn nhôm, block bảo quản nhiệt độ mát - ngày  Cắt mẫu vi thể Mẫu cắt hệ thống máy cắt microtom Độ dày – µm Block cố định giá kẹp mẫu, cắt nhiều lát cắt mô, chọn lát cắt mỏng cho vào bếp cách thủy nhiệt độ 60 0C cho tan hết paraffin, vớt lên lam, sau sấy bàn sấy lam nhiệt độ 60 – 70 0C 30 phút  Nhuộm hematoxyline Rã paraffin xylen: - Xylen phút - Xylen phút Tan cồn: 31 - Cồn 99 0C phút - Cồn 96 0C phút Rửa nước cất phút Nhuộm hematoxylin phút Rửa nước phút Tẩy HCL 1% nhúng Rửa nước nhúng Nhuộm Eosin phút Cồn 96 0C nhúng Cồn 96 0C nhúng Cồn 99 0C nhúng Cồn 99 0C nhúng Xylen nhúng Xylen 2 nhúng Để Trong chuyển từ hóa chất sang hóa chất khác phải vẩy cho khơ Lame nhuộm xong dán keo Baume du canada, sau sấy 70 0C 30 phút quan sát mô học kính hiển vi 3.6 Đánh giá phương pháp chẩn đoán MD Sau lấy mẫu chẩn đoán MD, tiến hành đánh giá phương pháp mẫu thực 3.7 Phương pháp xử lý số liệu Các kết tính tốn phần mềm Microsoft Excel 2003 Sử dụng phần mềm χ2 (chi – square) để so sánh tỷ lệ (minitab16) 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết chẩn đoán bệnh Marek kỹ thuật PCR Mẫu gà có bệnh tích nghi ngờ hay đặc trưng bệnh Marek thu thập, dùng kỹ thuật PCR để xác định bệnh Marek gà Kết trình bày qua Bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết xác định bệnh Marek kỹ thuật PCR (n = 21) Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Dương tính 18 85,71 % Âm tính 14,29 % Qua Bảng 4.3 cho thấy có 18 21 mẫu dương tính với MDV serotype chẩn đoán kỹ thuật PCR chiếm tỷ lệ 85,71 % Kết cao Do kỹ thuật PCR có độ nhạy độ xác cao việc chẩn đoán Kết cho thấy thực địa có diện serotype Theo Nguyễn Thị Phước Ninh (2010), serotype có khả gây bệnh cao, gồm chủng có khả tạo khối u, độc lực thay đổi từ độc đến độc độc, ảnh hưởng đến chăn nuôi lớn Trong q trình thu nhận mẫu, chúng tơi ghi nhận từ chủ nuôi mức độ thiệt hại cho người chăn nuôi lớn, gà ta với tỷ lệ chết từ – 10 %, gà đẻ giảm đẻ từ – 10 %, đặc biệt tăng chi phí điều trị 33 10 11 Lad 200 bp 184 bp Hình 4.1 Kết chạy PCR Ghi chú: Lad (Ladder): thang chuẩn Mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: dương tính Mẫu 10: đối chứng âm Mẫu 11: đối chứng dương 4.2 Kết chẩn đốn MDV phương pháp ni cấy phân lập qua phôi trứng Chúng lấy mẫu gà nghi ngờ đặc trưng bệnh Marek làm huyễn dịch tiêm vào phôi trứng gà – ngày tuổi, 12 – 14 ngày sau tiêm chúng tơi thu nước trứng, quan sát bệnh tích màng CAM đếm nốt pock Kết 124 trứng thu hoạch 16 mẫu chúng tơi khơng thấy nốt pock màng CAM 34 Hình 4.2 Màng CAM thu hoạch trứng Kết kiểm tra bệnh tích màng CAM khơng cho phép chúng tơi khẳng định cách chắn 16 mẫu không bị bệnh Marek Vì chúng tơi tiến hành lấy nước trứng xét nghiệm kỹ thuật PCR để xác định diện MDV nước trứng, kết trình bày qua Bảng 4.2 Kết kiểm tra MDV từ nước trứng kỹ thuật PCR thể qua Bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết kiểm tra MDV từ nước trứng kỹ thuật PCR Kết Số mẫu Tỷ lệ (%) Dương tính 12 75 % Âm tính 25 % Qua Bảng 4.2 cho thấy có 12 mẫu dương tính với MDV, điều chứng tỏ nước trứng 12 mẫu có diện MDV mẫu gà bị MD, mẫu âm tính Kết hợp kết ni cấy phơi trứng kết PCR chúng tơi nhận thấy nuôi cấy phân lập phôi trứng bệnh tích nốt pock virus sống không đủ mạnh để tạo nốt pock sử dụng phôi trứng nuôi cấy trứng thương phẩm, khơng có trứng tuyệt đối vơ trùng (SPF: System Pathogen Free) chúng tơi chưa tìm nguồn cung cấp trứng SPF Việt Nam Do 35 đó, thực tế nghiên cứu thực địa sản xuất việc chọn nuôi cấy phôi trứng xem nốt pock để chẩn đốn bệnh Marek khơng có trứng SPF gặp nhiều khó khăn Vì việc ni cấy khơng cho rõ bệnh tích, cần phải xét nghiệm lại kỹ thuật PCR tốn 4.3 Kết chẩn đốn MD qua bệnh tích vi thể Từ 16 ca nghi bệnh Marek tiến hành cắt mẫu vi thể Kết cho thấy có 16 ca nghi bệnh Marek với xâm nhập tế bào lympho quan Kết trình bày qua Bảng 4.3 Bảng 4.3 Kết bệnh tích vi thể Cơ quan Bệnh tích Số mẫu có Tỷ lệ (%) bệnh tích Gan Tế bào lympho xâm nhập tồn mô gan tạo thành khối u (n = 16) 15 93,75 Lách Mô lympho tăng sinh dày đặc mô lách tạo thành khối lớn (n = 16) 14 87,50 Thận Có mơ lympho xâm nhập vào mô thận tạo thành khối u nhỏ làm hư mô (n = 9) thận, ống lượn bị lympho xâm nhập 55,56 Tim (n = 8) Tế bào lympho xâm nhập bên tim xâm lấn tim 37,50 Dạ dày tuyến (n = 14) Tế bào lympho xâm nhập vào cấu tạo dày tuyến tạo thành khối u lớn 11 78,57 30,00 37,50 Ruột Tế bào lympho xâm nhập vào niêm mạc lớp niêm mạc (n = 10) mô tuyến Dây thần kinh đùi Tế bào lympho xâm nhập vào dây thần kinh (n = 8) Qua Bảng 4.3 cho thấy có xâm nhập tế bào lympho vào quan Qui trình ghi nhận bệnh tích chúng tơi thấy cá thể gan (93,75 %), lách 36 (87,50 %) dày tuyến (78,57 %) bị tế bào lympho xâm nhập mạnh Đây bệnh tích đặc trưng bệnh Marek Điều phù hợp với việc quan sát bệnh tích đại thể khối u thường xuất mô gan, lách, dày tuyến Kết phù hợp với kết nghiên cứu Lê Văn Năm (2003) gan 97,77 %; lách 96,66 %, dày tuyến 71,1 % có mặt tế bào u thần kinh số quan trọng để khẳng định bệnh Marek Như vậy, điều kiện thiếu trang bị đại kỹ thuật PCR, bệnh tích vi thể vi có vai trò tốt chẩn đoán nghi ngờ ca bệnh MDV gây bệnh tích rõ Hình 4.3 Lympho lan tràn khắp nơi mơ gan (100X) Hình 4.4 Lympho xâm nhập múi tuyến dày tuyến (100X) 37 4.4 Đánh giá kỹ thuật PCR, nuôi cấy phơi trứng bệnh tích vi thể dùng chẩn đoán MD Sau ứng dụng kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập phôi trứng – ngày tuổi, cắt mẫu quan sát bệnh tích vi thể 16 ca chẩn đoán nghi bệnh Marek chúng tơi rút kết đánh giá kỹ thuật trình bày qua bảng 4.4 Bảng 4.4 Đánh giá kỹ thuật dùng chẩn đoán MD Mẫu Kỹ thuật PCR Nuôi cấy trứng Vi thể 10 11 12 13 14 15 16 Tổng + + + + + + + + + + + + + + + + 16 + + + + + + + + + + + + + + + + 16 Tỷ lệ (+) 100 % 0% 100 % P P = 0,000 Qua Bảng 4.4 cho thấy thực ba phương pháp 16 ca bệnh tích nghi ngờ bị MD kỹ thuật PCR cho dương tính có bệnh tích vi thể bệnh Marek 38 Qua phân tích thống kê cho thấy, khác biệt phương pháp thực hiện, kỹ thuật PCR nuôi cấy trứng, vi thể ni cấy trứng chẩn đốn bệnh Marek có ý nghĩa với P = 0,000 Kỹ thuật PCR xác định MDV với số lượng MDV chết mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên khảo sát này, chúng tơi kiểm tra gà có biểu lâm sàng có bệnh tích nghi bệnh Marek, bệnh gây ảnh hưởng cho đàn Vì chúng tơi nghĩ khả cao virus mẫu bệnh phẩm sống gây thiệt hại cho nhà chăn nuôi Kỹ thuật PCR phương pháp xét nghiệm đại, có độ nhạy độ xác cao, cho kết nhanh Tuy nhiên, phòng xét nghiệm chưa trang bị hệ thống PCR thực cắt vi thể để chẩn đốn bệnh Trong nghiên cứu, cần nuôi cấy virus sống nên xem xét thêm phương pháp khác thay ni cấy phân lập phơi trứng điều kiện chưa có trứng SPF để có kết tốt 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tiến hành làm đề tài “Chẩn đoán bệnh Marek gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn nuôi theo phương thức công nghiệp kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập phôi trứng bệnh tích vi thể” Bệnh viện Thú Y – Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh chúng tơi rút kết luận sau:  Có virus gây bệnh Marek serotype gà ta gà đẻ thương phẩm  Trong phương pháp:  Kỹ thuật PCR phương pháp cho kết nhanh, xác đáng tin cậy chẩn đốn MD (85,71 %)  Bệnh tích vi thể cho hướng chẩn đốn MD cao (100 % ca thực cắt vi thể có bệnh tích nghi ngờ MD)  Ni cấy phân lập qua phơi trứng không cho kết tốt 5.2 Đề nghị Tiếp tục phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh Marek kết nhanh xác Khi cần virus gây bệnh Marek sống nên thay nuôi cấy trứng phương pháp nuôi cấy tế bào để khắc phục khó khăn từ ni cấy phân lập qua phơi trứng Cần có chiến lượcTÀI phòng LIỆU chống bệnh Marek để giảm tối đa thiệt hại bệnh gây THAM KHẢO cho người chăn nuôi 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Hồng Mận, Trần Công Xuân, Lưu Kỷ Phùng Đức Tiến, 1999 Chuyên san chăn nuôi gia cầm Hội chăn nuôi Việt Nam, trang 320 – 321 Lê Văn Năm, 2003 Bệnh Marek mơ hình khối u truyền nhiễm Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Lê Văn Năm Lê Văn Tạo, 2004 100 câu hỏi đáp quan trọng cho cán thú y người chăn nuôi gà Tủ sách Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, trang 246 – 268 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010 Truyền nhiễm chung gia cầm Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm khoa CNTY, trường ĐH Nông Lâm TP.HCM Trần Thanh Phong, 1996 Những bệnh truyền nhiễm thường gặp gà Nhà xuất nông nghiệp, trang 46 – 73 Lò Thanh Sơn, 2009 Cơng nghệ di truyền Nhà xuất Đại học Tây Bắc Phan Đức Thắng, 2007 Thử nghiệm vaccine Marek trại gà đẻ thương phẩm thuộc tỉnh Đồng Nai LVTY, khoa CNTY, Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất y học Chi Nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân, 1996 Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR), đại cách mạng sinh học phân tử Y học Tp.HCM, trang 27 – 35 10 Tạ Thành Văn, 2010 PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà suất y học Hà Nội 41 TIẾNG ANH 11 Awatif I., Salim., Eisa, M And Kheir., A.A.M., 2001 Marek’s Disease in the Sudan: Isolation in Tissue Culture and Cytopathological Feature The Sudan J Vet Res 17 12 Mohamred Faizal Abdul_Careem., Bruce D.Hunter., Éva Nagy., Lead R.Read., Babak Sanei., J.Lloyd Spencer., and Shayan Sharid., 2005 Development of a real – time PCR assay using SYBR Green chemistry for monitoring Marek’s disease virus genome load in feather tips Journal of Virological Methods 13 Saif Y.M., Fadly A.M., Glission J.R., and McDuogald L.R., 2008 Disease of Poultry Neoplastic disease by Fadly A.M., pp 449 – 486 14 OIE Terrestrial Manual, 2010 Marek’s disease The World Assemly of Delegates of the OIE, chapter 2.3.13 Tài liệu internet 15 http://agriviet.com/nd/2788-benh-marek/ 16 http://chovietvn.com/thu-nuoi-cay-canh/33948-ha-noi-hcm-ga-tre-choi-nuoc-gia 300k.html 17 http://diendankienthuc.net/diendan/cong-nghe-sinh-hoc/72230-phuong-phap pcr.html 18 http://gatredatviet.com/showthread.php?422-B%E1%BB%87nh-Marek 19 http://www.aquabird.com.vn/forum/showthread.php?t=80377&page=1 20 http://www.biopharmachemie.com/vi/technical/benh-marek-tren-ga-de-va-ga-thit-109 42 PHỤ LỤC Sự khác biệt phương pháp PCR, nuôi cấy phối trứng vi thể chẩn đoán MD ý nghĩa Chi-Square Test: Dương tính; Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Dương tính 16 10,67 2,667 Âm tính 5,33 5,333 Total 16 10,67 10,667 16 5,33 21,333 16 16 10,67 2,667 5,33 5,333 16 Total 32 16 48 Chi-Sq = 48,000; DF = 2; P-Value = 0,000 Sự khác biệt kỹ thuật PCR & nuôi cấy phơi trứng chẩn đốn MD có ý nghĩa Chi-Square Test: Dương tính; Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Dương tính 16 8,00 8,000 Âm tính 8,00 8,000 Total 16 8,00 8,000 16 8,00 8,000 16 Total 16 16 32 Chi-Sq = 32,000; DF = 1; P-Value = 0,000 43 Sự khác biệt phương pháp nuôi cấy phôi trứng bệnh tích vi thể chẩn đốn MD có ý nghĩa Chi-Square Test: Dương tính; Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Dương tính Âm tính Total 16 16 8,00 8,00 8,000 8,000 16 8,00 8,000 8,00 8,000 16 Total 16 16 32 Chi-Sq = 32,000; DF = 1; P-Value = 0,000 44 ... Base pair µl: Microlit µm: micromole ng: nanograms nM: nanomolar mM: milimolar Ds DNA: Double strand Deoxyribonucleic acid ss DNA: single strand Deoxyribonucleic acid CAM: Chorio Atlantoid Membran... nucleotide (dNTP) Bốn loại nucleotide thường sử dụng nồng độ 20 – 200 nM/mỗi loại nucleotide Nếu nồng độ cao dẫn đến khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm Sự cân thành phần nucleotide... Phước Ninh, 2010) 2.3 Dịch tễ học 2.3.1 Loài mắc bệnh Trong thi n nhiên số loài gia cầm thủy cầm như: gà, gà tây, trĩ, vịt, thi n nga, ngỗng…đều cảm thụ với bệnh Nhưng virus Marek không gây bệnh