VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử cám gạo” Mã số: KC.04.TN01/11-15, thuộc Chương trình khoa học cơng nghệ trọng điểm cấp Nhà nước KC.04/11-15 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Mai Phương Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học 9720 Hà Nội, tháng 11 năm 2012 _ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2012 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN I THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử cám gạo Mã số đề tài, dự án: Mã số: KC.04.TN01/11-15 Thuộc: - Chương trình: KHCN cấp nhà nước KC 04/11-15 Nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài/dự án: Họ tên: Nguyễn Thị Mai Phương Ngày, tháng, năm sinh: 1/7/1966 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Tiến sỹ Chức danh khoa học: Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: 38362599 Nhà riêng: 35636124 Mobile: 0917500965 Fax: 38363144 E-mail: Phuong_nguyen_99@yahoo.com Tên tổ chức công tác: Viện Công nghệ Sinh học Địa tổ chức: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà Nội Địa nhà riêng: 39/41 ngõ Thịnh Quang, Tây Sơn, Đống Đa, Hà Nội Tổ chức chủ trì đề tài/dự án: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghệ Sinh học Điện thoại: 04-38362599 Fax: 84-4-38363144 E-mail: admin@ibt.ac.vn Website: http://www ibt.ac.vn Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Họ tên thủ trưởng tổ chức: GS.TS Trương Nam Hải Số tài khoản: 3711 Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội Tên quan chủ quản đề tài: Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực đề tài/dự án: - Theo Hợp đồng ký kết: từ ngày 05 tháng 01 năm 2012 đến 05 tháng 01 năm 2013 - Thực tế thực hiện: từ 05 tháng 01 năm 2012 đến 31 tháng 12 năm 2012 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 770 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 770 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ + Tỷ lệ kinh phí thu hồi dự án (nếu có): b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) 1/2013 3/2012 9/ 2012 (Tr.đ) 250 289 231 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) 13/3/2012 18/5/2012 30/10/2012 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: (Tr.đ) 250 289 231 Ghi (Số đề nghị toán) Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng 400 Thực tế đạt SNKH Nguồn khác 400 Tổng 400 SNKH Nguồn khác 400 300 300 300 300 70 770 70 770 0 70 770 70 770 0 - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban hành Tên văn TT văn Phê duyệt kinh phí, tổ chức Quyết định số cá nhân chủ trì nhiệm 3856/QĐ-BKHCN vụ KH&CN ngày 15/12/2011 Hợp đồng số 01 ngày 5/1/2012 Hợp đồng nghiên cứu khoa học Tổ chức phối hợp thực đề tài, dự án: Ghi Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme – Protein Tên tổ chức tham gia thực Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme – Protein Nội dung tham gia chủ yếu Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus Viện Công Viện Công Nghiên cứu nghiệp Thực nghiệp Thực quy trình cơng phẩm phẩm nghệ sản xuất XOS dẫn xuất Học Viện Học Viện Đánh giá tác Quân Y Quân Y dụng sinh học chế phẩm synbiotic tạo thành mơ hình in vivo chuột Sản phẩm Ghi chủ yếu đạt chú* Sản phẩm probiotic B subtilis dạng bào tử có khả tiêu thụ XOS có mật độ ≥ 109 CFU/g Sản phẩm XOS dẫn xuất thu chiếm > 60% - Các số liệu độc tính cấp, thể trạng, miễn dịch - Mơ hình gây rối loạn đại tiện số liệu hoạt tính sinh học chế phẩm lên mơ hình - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực đề tài, dự án: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá Nội dung tham nhân gia tham gia thực Nguyễn Thị Nguyễn Thị - Viết thuyết Mai Phương Mai Phương minh đề tài, thu thập tài liệu tham khảo, viết Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Sản phẩm chủ yếu đạt -Thuyết minh đề tài - Báo cáo tổng kết -Bài báo khoa học -Sản phẩm XOS Ghi chú* Hoàng Phương Hà Hoàng Phương Hà báo, viết báo cáo tổng kết đề tài -Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu phù hợp xác định phương pháp xử lý -Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất XOS dẫn xuất -Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus -Sản xuất 30 kg chế phẩm synbiotic chứa XOS bào tử vi khuẩn Bacillus -Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm synbiotic tạo thành mơ hình in vivo chuột -Đánh giá hiệu kinh tế việc sản xuất chế phẩm synbiotic - Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu phù hợp xác định phương pháp xử lý -Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus dẫn xuất thu chiếm > 60% -Sản phẩm Probiotic B subtilis dạng bào tử có khả tiêu thụ XOS - Xác định tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis HU58 đồng hóa XOS - Số liệu giá thành sản phẩm XOS, probiotic synbiotic P&P - Đánh giá hiệu kinh tế việc sản xuất chế phẩm synbiotic Nguyễn Thị Nguyễn Thị Nghiên cứu tạo chế phẩm Vân Anh Vân Anh probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus Nghiên cứu quy Nguyễn Nguyễn trình cơng nghệ Thúy Hường Thúy sản xuất XOS Hường dẫn xuất Anh Đánh giá tác Nguyễn Lĩnh Hồ Sơn dụng sinh học Tồn chế phẩm synbiotic tạo thành mơ hình in vivo chuột Phạm Thị Phạm Thị -Nghiên cứu tạo phẩm Thu Phương Thu Phương chế probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus -Sản xuất 30 kg chế phẩm synbiotic chứa XOS bào tử vi khuẩn Bacillus Hoàng Yến Đỗ Thị Liên (đồng/kg) - Sản phẩm Probiotic B subtilis dạng bào tử có khả tiêu thụ XOS có mật độ>109CFU/g Sản phẩm XOS dẫn xuất thu chiếm > 75% -Các số liệu độc tính cấp, thể trạng, miễn dịch chuột -Mơ hình gây rối loạn đại tiện số liệu hoạt tính sinh học chế phẩm mơ hình -Tuyển chon sản xuất B subtilis dạng bào tử có khả tiêu thụ XOS - Sản phẩm synbiotic P&P (30kg) chứa XOS bào tử vi khuẩn Bacillus - Các số liệu độc tính cấp, thể trạng, miễn dịch chuột - Chế phẩm XOS dẫn xuất thu chiếm > 60% - Đánh giá chất lượng sản phẩm XOS Nghiên cứu quy Tuyển chọn Đỗ Thị Liên trình cơng nghệ chủng vi khuẩn sản xuất XOS Bacillus subtilis Thị Hoàng Thị Nghiên cứu quy trình cơng nghệ Yến sản xuất XOS dẫn xuất dẫn xuất Phạm Thị Phạm Thị Sản xuất 30 kg chế phẩm Ngọc Lan Ngọc Lan synbiotic chứa XOS bào tử vi khuẩn Bacillus Đinh Thị Đinh Thị Nghiên cứu lựa nguyên Ngọc Thúy Ngọc Thúy chọn liệu phù hợp xác định phương pháp xử lý 10 Trần Nhung Thị Trần Thị -Nghiên cứu lựa chọn nguyên Nhung liệu phù hợp xác định phương pháp xử lý -Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất XOS dẫn xuất HU58 đồng hóa XOS -Chế phẩm XOS dẫn xuất thu chiếm > 60% - Đánh giá chất lượng sản phẩm probiotic - Các số liệu đánh giá chất lượng sản phẩm XOS, probiotic synbiotic P&P -Số liệu số miễn dịch máu chuột - Xác định nguyên liệu đầu vào - Quy trình sản xuất XOS quy mơ phòng thí nghiệm - Xác định tiêu chuẩn ngun liệu đầu vào - Quy trìnhsản xuất XOS quy mơ phòng thí nghiệm -Tinh XOS - Đánh giá chất lượng XOS - Tạo 30kg synbiotic đánh giá chất lượng - Lý thay đổi ( có) TS Nguyễn Lĩnh Toàn bận thực nhiệm vụ khoa học khác nên giao lại cho TS Hồ Anh Sơn, nhóm nghiên cứu quan đảm nhiệm nội dung đăng ký tham gia thực TS Nguyễn Lĩnh Tồn tham gia với vai trò tư vấn Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đồn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Tổ chức 03 seminar nhóm Viện Cơng nghệ sinh học Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) -Tổ chức ngày 24/4/2012 Viện CNSH -Nôi dung: Giới thiệu đề tài vấn đề nghiên cứu liên quan -Kinh phí: 3.590.000 đồng -Tổ chức ngày 26/7/2012 Viện CNSH -Nội dung: Các nghiên cứu ứng dụng bào tử Bacillus, Seminare tiếng Anh -Kinh phí: 3.670.000 đồng -Tổ chức ngày 15/9/2012 Viện CNSH - Nội dung: Trình bày kết nghiên cứu đề tài đến thời điểm tháng 9/2012 - Kinh phí: 3.740.000 đồng Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) -Tổ chức ngày 24/4/2012 Viện CNSH - Nôi dung: Giới thiệu đề tài vấn đề nghiên cứu liên quan -Kết quả: Đã có báo cáo trình bày với tham gia 25 cán bộ, sinh viên , học viên cao học Viện CNSH quan đối tác -Tổ chức ngày 26/7/2012 Viện CNSH -Nội dung: Các nghiên cứu ứng dụng bào tử Bacillus, Seminar tiếng Anh - Kết quả: Đã có báo cáo tiếng Anh trình bày với tham gia 22 cán bộ, sinh viên, học viên cao học Viện CNSH quan đối tác -Tổ chức ngày 15/9/2012 Viện CNSH - Nội dung: Trình bày kết nghiên cứu đề tài đến thời điểm tháng 9/2012 - Kết quả: Đã có báo cáo từ quan phối hợp nghiên cứu đề tài trình bày với tham gia 22 cán bộ, sinh viên, học viên cao học Viện CNSH quan đối tác - Lý thay đổi (nếu có): Ghi chú* Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Hoàn chỉnh thuyết minh đề tài Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu phù hợp xác định phương pháp xử lý Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch 1/2012 Thực tế đạt 1/2012 1-3/2012 2-4/2012 2-8/2012 3-8/2012 Người, quan thực NTMP, Viện CNSH NTMP nhóm nghiên cứu, Viện CNSH Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất XOS dẫn xuất Nghiên cứu tạo chế phẩm 4-8/2012 4-8/2012 probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm 30 kg chế phẩm synbiotic 9/2012 9/2012 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm synbiotic tạo thành mơ hình in vivo chuột 1011/2012 9-11/2012 -NTMP nhóm nghiên cứu, Viện CNSH - HAS nhóm nghiên cứu, Học viện Quân -NTMP nhóm nghiên cứu, Viện CNSH - NTH nhóm nghiên cứu, Viện CNTP -NTMP nhóm nghiên cứu, Viện CNSH - NTVA nhóm nghiên cứu, Đại học KHTN -NTMP nhóm nghiên cứu, Viện CNSH NGHIÊN CỨU THU NHẬN XYLOOLIGOSACCHARIDE (XOS) TỪ CÁM GẠO BẰNG CÔNG NGHỆ ENZYME Trần Thị Nhung1, Nguyễn Thúy Hường2, Phạm Thị Thu Phương1, Nguyễn Thị Mai Phương1* Viện Công nghệ Sinh học, *Email: phuong_nguyen_99@yahoo.com Viện Cơng nghiệp Thực phẩm TĨM TẮT Cám gạo phụ phẩm trình xay xát gạo giàu hydratcarbon, đặc biệt xylan Vì thế, nguồn nguyên liệu sử dụng để sản xuất chất xơ hòa tan oligosaccharide (XOS) Một số vi khuẩn phổ biến ruột kết Bifidobacteria and Lactobacillus sử dụng XOS nguồn chất Thị trường cho XOS ngày hấp dẫn lợi tính chất sinh học cơng nghệ so với oligosaccharide phổ biến khác fructooligosaccharide (FOS) hay glactooligosaccharide (GOS) XOS sản xuất từ cám gạo sử dụng cơng nghệ hóa học cơng nghệ enzyme Thủy phân cám gạo sử dụng β-1,4-xylanase phương pháp thường lựa chọn để sản xuất XOS từ cám gạo Hiện tại, Việt Nam thiếu cơng nghệ sản xuất XOS từ cám gạo có độ cao an toàn thực phẩm Bài báo trình bày kết nghiên cứu thu nhận XOS từ cám gạo sử dụng công nghệ đa enzyme thân thiện với mơi trường Chế phẩm XOS có độ tới 81,4% thu nhận cách thủy phân cám gạo tiền sử lý với Ultraflo L xylanase 0,6% hãng Novozyme pH 7,0 50oC đệm phosphate buffer 100mM 15 Đây cơng nghệ thích hợp để sản xuất XOS từ cám gạo Việt Nam Từ khóa: Xylooligosaccharide (XOS), xylanase, cám gạo MỞ ĐẦU Việt Nam nước xuất gạo lớn giới Theo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, lượng gạo xuất năm 2011 đạt khoảng 7,5 triệu Vì lượng cám gạo, phụ phẩm trình xay xát gạo, lớn Cám gạo có giá trị dinh dưỡng cao với thành phần hydratcacbon chiếm từ 38,7 – 44,3%, chủ yếu xylan nên nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất chất xơ hòa tan xylooligosaccharide (XOS) XOS olygomer chứa từ 2-7 gốc đường xylose XOS sử dụng vi khuẩn Bifidobacteria số Lactobacillus, vi khuẩn phổ biến ruột kết người [4, 6, 8, 11, 14] XOS có nhiều ưu việt oligosaccharide khác fructooligosaccharide (FOS) hay galactooligosaccharide (GOS) khía cạnh lợi ích sức khỏe đặc tính liên quan đến cơng nghệ [1] Vì thế, thị trường thương mại cho sản phẩm triển vọng [1, 3, 7, 9] Hiện có hai hướng cơng nghệ để thu nhận XOS từ cám gạo sử dụng cơng nghệ hóa học công nghệ enzyme [2, 10, 15] Hướng thu nhận XOS công nghệ enzyme quan tâm nhiều tính chất thân thiện mơi trường độ an tồn sản phẩm Q trình thủy phân cám gạo tạo XOS enzyme thực endo β 1-4 xylanase Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất oligosaccharide từ cám gạo Hồ Kim Vĩnh Nghi cộng tiến hành nghiên cứu [16] Tuy nhiên, tác giả khơng định hướng thu sản phẩm XOS nên hiệu suất thu hồi chất thấp Có thể nói cám gạo nguồn nguyên liệu giàu xylan đến chưa có cơng nghệ phù hợp hiệu để thu XOS có chất lượng cao Bài báo trình bày kết nghiên cứu thu nhận XOS từ cám gạo sử dụng công nghệ enzyme thân thiện với môi trường NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Cám gạo thu mua từ nhà máy sở xay xát gạo có uy tín tỉnh Hà Tây Cám gạo sau xử lý làm giàu xylan enzyme protease α amylase Enzyme Ultraflo L (xylanase) mua từ hãng Novozyme (Đan Mạch) Các hóa chất lại đạt mức tinh phân tích Phương pháp nghiên cứu Định lượng xylose XOS Dựa vào phương pháp quang phổ để định lượng xylose tổng số có mẫu nghiên cứu sau xử lý với axit HCl, từ tính hàm lượng XOS dựa vào chất chuẩn (Wako) XOS xử lý với HCl 1,3 M 100oC để thủy phân hoàn toàn xylan thành xylose Sau trung hòa với NaOH 1,3 M, mẫu nghiên cứu ly tâm thu dịch Hàm lượng xylose dung dịch xác định kit D - xylose (Megazyme) Sắc ký lớp mỏng định tính đường XOS XOS định tính sắc ký lớp mỏng (TLC) silicagel 60 F254 (Merck 1.05554; 20 x 20 cm) sử dụng hệ dung môi phân tách n-butanol : axit acetic : H2O với tỷ lệ 3:1:1 Bản sắc ký màu aniline hỗn hợp axit phthalic n-butanol bão hòa Các vạch đường màu nâu sau chạy sắc ký khoảng 90 phút phun thuốc màu Xác định hoạt tính xylanase (Endo-1,4-β-xylanase - EC 3.2.1.8) Hoạt tính enzyme xác định dựa việc đo sản phẩm xylose tạo thành thủy phân 1% xylan oat-spelts (Sigma) đệm phosphate natri pH 7,0 50oC 30 phút Một đơn vị hoạt tính enzyme số µmol xylose giải phóng điều kiện phản ứng Xylose tạo thành định lượng kit đo D-xylose Hoạt tính riêng chế phẩm enzyme số đơn vị enzyme/mg protein chế phẩm Xác định protein Hàm lượng protein mẫu nghiên cứu xác định thông qua phản ứng màu với thuốc thử Bradford sử dụng albumin huyết bò (BSA) làm chất chuẩn [17] KẾT QUẢ Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho thủy phân cám gạo xylanase Hiện nay, thị trường thương mại số sản phẩm enzyme xylanase cơng nghiệp khác có nguồn gốc vi sinh vật để phục vụ cho công nghiệp chế biến thực phẩm sản xuất bia, bánh mì hay chăn ni Ví dụ, chế phẩm Ultraflo L (Novozyme, Đan Mạch), Porzyme (Canada) hay số công ty hóa chất Trung Quốc Kết phân tích hoạt độ mẫu enzyme công nghiệp gồm Porzyme (dạng bột, Canada); Pentopan (dạng bột, Trung Quốc), Trichoderma (dạng bột, Trung Quốc) Ultraflo L (dạng dịch, Novozyme) Aspergillus (dạng bột, Trung Quốc) cho thấy hoạt độ riêng Ultraflo L (Novozyme) cao nhất, đạt 12,68 U/mg protein, cao khoảng 10 lần so với enzyme Aspergillus cao nhiều lần so với enzyme lại (số liệu khơng trình bày đây) Trong số enzyme cơng nghiệp có hoạt tính thủy phân malt để sản xuất bia Ultraflo L có hàm lượng xylanase cao khơng chứa beta-glucanase Vì thế, chúng tơi sử dụng Ultraflo L nguồn xylanase cho trình sản xuất XOS từ cám gạo Để thu nhận XOS có hiệu suất cao, chúng tơi tiến hành nghiên cứu điều kiện tối thích cho q trình thủy phân Ảnh hưởng pH đến khả thủy phân cám gạo xylanase Dung dịch cám gạo đệm phosphate natri 100 mM, pH 5,0; 6,0; 7,0 bổ sung xylanase với nồng độ 0,3% tiến hành thủy phân 50oC khoảng thời gian 21 Hàm lượng đường xylose sau thủy phân kiểm tra để đánh giá khả thủy phân enzyme Kết thu cho thấy sau thủy phân pH 7,0 21 giờ, hàm lượng đường xylose đạt giá trị ∆A340 0,660, tương ứng với hàm lượng XOS 6,8%, cao đáng kể so với giá trị thu thủy phân điều kiện pH 6,0 (5,46%) cao tới gần 50% so với thủy phân điều kiện pH 5,0 (4,9%) (Bảng 1) Kết lý giải xylanase Ultraflo L enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn (Bacillus) nên vùng pH tối thích cho hoạt động gần giá trị pH trung tính, khác với xylanase có nguồn gốc từ nấm (Aspergillus), thường có pH tối thích cho hoạt động vùng axit (pH 5,0) [12] Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả thủy phân cám gạo xylanase Dung dịch cám gạo đệm phosphate natri 100 mM, pH 7,0 bổ sung xylanase với nồng độ 0,3% tiến hành thủy phân nhiệt độ 37oC; 45oC; 50oC; 55oC khoảng thời gian 21 Hàm lượng xylose sản phẩm thủy phân sau định lượng để đánh giá hiệu thủy phân Kết thu bảng cho thấy hàm lượng XOS nhiệt độ thủy phân 50oC sau 21 cao đáng kể so với nhiệt độ khác Dựa số liệu thu thấy hàm lượng chất cao gấp lần so với thủy phân nhiệt độ 37oC 21 (5,46% so với 2,93%) cao khoảng 70% so với thủy phân nhiệt độ 45oC (3,4%) Ở nhiệt độ cao 50oC, khả thủy phân enzyme bị giảm Các số liệu thu cho thấy nhiệt độ 50oC tối thích cho xylanase Ultraflo L thủy phân cám gạo Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến khả thủy phân cám gạo xylanase Dung dịch cám gạo đệm phosphate natri 100 mM, pH 7,0 bổ sung xylanase với nồng độ khác 0,15%; 0,3%; 0,6%; 0,9% Quá trình thủy phân thực 50oC 21 Kết thủy phân trình bày bảng Số liệu thu cho thấy sử dụng xylanase nồng độ 0,6% thích hợp để thủy phân cám gạo thu XOS Ảnh hưởng thời gian đến khả thủy phân cám gạo xylanase Dung dịch cám gạo đệm phosphate natri 100 mM, pH 7,0 bổ sung xylanase với nồng độ 0,3% tiến hành thủy phân nhiệt độ 50oC khoảng thời gian 0; 5; 10; 15 21 Kết xác định hàm lượng XOS dịch thủy phân cám gạo trình bày bảng Số liệu bảng hình cho thấy thời điểm thủy phân 15 giờ, hàm lượng XOS đạt cao (5,32%) Sau thời điểm này, hàm lượng XOS tăng không đáng kể Như vậy, thời gian thủy phân 15 thích hợp để thu XOS có hàm lượng cao Kiểm tra sản phẩm thủy phân cám gạo với xylanse TLC (Hình 1) cho thấy sản phẩm q trình thủy phân xylobiose Đây nguồn XOS chứng minh thích hợp cho vi khuẩn Bifidobacteria số Lactobacillus ruột kết đồng hóa [6, 11] Độ sản phẩm thủy phân cám gạo thu từ qui trình (dịch thủy phân 1) so sánh với độ sản phẩm XOS thu từ qui trình thủy phân cám gạo Hồ Kim Vĩnh Nghi cộng công bố (dịch thủy phân 2) [16] Kết thu hình cho thấy hiệu suất độ XOS thu từ qui trình cơng bố tác giả thấp Bằng chứng vệt sắc ký sắc ký đồ thu tương đương với đường xylobiose, xylobiose lớn mờ nhạt Như vậy, điều kiện thích hợp cho thủy phân cám gạo để thu XOS pH 7,0 nhiệt độ 50oC thời gian 15 với nồng độ enzyme 0,6% Sản phẩm trình thủy phân cám gạo với điều kiện lựa chọn chủ yếu xylobiose, xylose số XOS mạch ngắn khác xylotriose, xylotetraose Xác định độ chế phẩm XOS sau thủy phân Sản phẩm XOS thu sau sấy phun dịch thủy phân (Hình 3) xác định độ máy phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Kết thu hình 4A 4B cho thấy chế phẩm sau thủy phân chứa phần lớn xylobiose, xylotriose phần xylose, phù hợp với kết phân tích TLC Sản phẩm XOS thu có độ đạt 81,4% Tồn qui trình thu nhận XOS sử dụng cơng nghệ đa enzyme tóm tắt sơ đồ hình Hiệu suất sản phẩm tính dựa hàm lượng chất khô thu được/trọng lượng nguyên liệu đầu vào Hiệu suất thu hồi XOS sau thủy phân cám gạo sử dụng qui trình nêu đạt 13,2% (13,2 gram XOS 100 gram cám gạo xử lý) với độ đạt 81,4% Có thể nói, qui trình sản xuất XOS chúng tơi đưa đơn giản, thân thiện với môi trường hiệu qui trình XOS công bố trước với cám gạo lõi ngô [4, 5, 10, 13, 15] Cụ thể là: i) Không sử dụng hóa chất để xử lý nguyên liệu làm giàu xylan nên đảm bảo an toàn thực phẩm; ii) Khơng có sản phẩm phụ thải mơi trường nên xử lý môi trường; iii) Các enzyme sử dụng để sản xuất XOS phổ biến chế biến thực phẩm giá thành thấp; iv) Sản phẩm thu có độ tương đối cao Chính yếu tố góp phần làm giảm giá thành sản phẩm XOS thu nhờ có tính cạnh tranh cao với sản phẩm XOS thương mại khác thị trường KẾT LUẬN Đã sản xuất XOS từ cám gạo qui mơ phòng thí nghiệm có độ đạt 81,41% qui trình thủy phân cám gạo xử lý loại bỏ protein tinh bột với enzyme xylanase (Ultraflo L, Novozyme) nhiệt độ 50oC, pH 7,0 với nồng độ enzyme 0,6% thời gian 15 LỜI CẢM ƠN Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí đề tài KC.04.TN01 /11-15, Bộ Khoa học Công nghệ, 2012 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aachary A and Prapulla S., 2011 Xylooligosaccharide (XOS) as an emerging prebiotic: microbial synthesis, utilization, structural characterization, bioactive properties, and applications Comp Rev Food Sci Food Safety., 10: 2-16 Akpinar O., Erdogan K., Bostanci S., 2009 Enzymatic production of xylooligosaccharide from selected agricultural wastes Food Biop Pro., 87: 145-151 De Vrese M., Schrezenmeir J., 2008 Probiotics, prebiotics, and synbiotics Adv Biochem Eng Biotechnol., 111: 1-66 Gullón P., Moura P., Esteves MP., Girio FM., Domínguez H., Parajó JC., 2008 Aug 27 Assessment on the fermentability of xylooligosaccharides from rice husks by probiotic bacteria J Agric Food Chem.; 56(16): 7482-7 Hamid A.A., and Luan Y.S., 2000 Functional properties of dietary fiber prepared from defatted rice bran Food Chem., 68 (1): 15-19 Hsu CK., Liao JW., Chung YC., Hsieh CY and Chan YC., 2004 Xylooligosaccharides and Fructooligosaccharides Affect the Intestinal Microbiota and Precancerous Colonic Lesion Development in Rats J Nutr., 134 (6): 1523-1528 Menrad K., 2003 Market and marketing of functional food in Europe J Food Engin., 56: 181–188 Moura P., Barata R., Carvalheiro F., Gírio F., Loureiro-Dias M., and Esteves P., 2007 In vitro fermentation of xylooligosaccharide from corn cobs autohydrolysis by Bifidobacterium and Lactobacillus strains LWT – Food Sci Technol., 40 (6): 963-972 Nakakuki T., 2003 Development of functional oligosaccharide in Japan Trends Glycosci Glyc., 15 ( 82): 57-64 10 Nicole G., 2009 Methods for optimizing enzymatic hydrolysis of xylan to improve xylooligosaccharide yield MMG 445 Biotechnology, 5: 31-36 11 Palframan RJ., Gibson GR., Robert A., Rastall RA., 2003 Carbohydrate Preferences of Bifidobacterium SpeciesIsolated from the Human Gut Curr Issues Intest Microbiol., 4: 71-75 12 Polizeli M.L.T.M., Rizzatti A.C.S., Monti R., Terenzi H.F., Jorge J.A., and Amorim D.S., 2005 Xylanases from fungi: properties and industrial application Appl Microbiol Biot., 67(5): 577-591 13 Teng C., Yan Q., Jiang Z., Fan G., Shi B., 2010 Production of xylooligosaccharide from the steam explosion liquor of corncobs coupled with enzymatic hydrolysis using a thermostable xylanase Bioresour Technol., 101(19): 7679-82 14 Vigsnæs LK., Holck J., Meyer AS and Licht TR., 2011 In Vitro Fermentation of Sugar Beet Arabino-Oligosaccharides by Fecal Microbiota Obtained from Patients with Ulcerative Colitis To Selectively Stimulate the Growth of Bifidobacterium spp and Lactobacillus spp Appl Environ Microb., 77 (23): 8336-8344 15 Yang R.X.S., and Wang Z.Y.W., 2005 Aqueous extraction of corncob xylan and production of xylooligosaccharide LWT – Food Sci Technol., 38: 677682 16 Hồ Kim Vĩnh Nghi cộng sự, 2009 Nghiên cứu qui trình sản xuất chất xơ thực phẩm từ nguồn nguyên liệu thực vật ứng dụng làm hoạt chất sinh học bổ sung vào thực phẩm ăn liền thực phẩm chức Viện Công nghiệp thực phẩm, Báo cáo đề tài nghiên cứu cấp Bộ Công Thương 17 Phan Tuấn Nghĩa, 2012 Giáo trình Hóa sinh học Thực nghiệm Nhà xuất giáo dục Việt Nam OPTIMISATION OF RICE BRAN HYDOLYSATION BY XYLANASE FOR XYLOOLIGOSACCHRIDE PRODUCTION SUMMARY Tran Thi Nhung1, Nguyen Thuy Huong2, Pham Thi Thu Phuong1, Nguyen Thi Mai Phuong1* Institute of Biotechnology, *Email: phuong_nguyen_99@yahoo.com Food Industries and Research Institute Rice bran is a subsidy product of rice processing It is rich in carbohydrate, especially xylan therefore, has being used for production of soluble fiber oligosaccharide including xylooligosaccharides (XOS) XOS has been proven to be fermented by beneficial bacteria Bifidobacteria and Lactobacillus in colon The market for XOS is increasing rapidly due to its advantages in biological and technological properties compared to other common oligosaccharides, such as fructooligosaccharide (FOS) or galactooligosaccharide (GOS) XOS can be produced from rice bran using either chemical or enzymatic hydrolysation technologies The hydrolyzation using 1-4 xylanase is commonly used to produce XOS from rice bran However, the appropriate technology for XOS production from rice bran with high purity and food safe in Vietnam is still badly needed This paper presents new results on XOS production from rice bran using a multienzymatic and environmental friendly technology The XOS with purity of 81.4% has been obtained by hydrolyzing protease and α-amylase pretreated rice bran with 0.6% commercial xylanase named Ultraflo L from Novozyme at 50oC in 100 mM phosphate buffer at pH 6.8 for 15 hours, demonstrating that it is a appropriate technology for XOS production from rice bran in Vietnam Key words: Xylooligosaccharide (XOS), xylanase, rice bran Ngày nhận : 7/8/2012 Bảng Ảnh hưởng pH đến khả thủy phân cám gạo xylanase Thời gian (giờ) XOS % pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 0,007 0,007 0,005 4,59 5,05 5,46 21 4,90 5,46 6,80 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân cám gạo xylanase XOS % Thời gian (giờ) 37oC 45 oC 50 oC 55 oC 0,002 0,004 0,005 0,003 1,71 1,96 4,03 4,22 21 2,93 3,40 5,46 5,00 Bảng Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến khả thủy phân cám gạo xylanase Thời gian XOS % (giờ) Nồng độ enzyme 0,15% 0,3% 0,6% 0,9% 0,008 0,008 0,007 0,005 0,006 21 4,21 5,05 5,06 6,49 5,79 Bảng Ảnh hưởng thời gian đến khả thủy phân cám gạo xylanase Thời gian (giờ) XOS % 0,009 3,06 10 3,98 15 5,12 21 5,32 Xylose Xylobiose Xylotriose Hình 1: Sắc ký đồ TLC dịch thủy phân cám gạo sử dụng qui trình 1 Xylose; XOS; giờ; giờ; 10 giờ; 15 giờ; 21 Xylose Xylobiose Xylotriose Xylose XOS Dịch thủy Dịch thủy phân phân Hình So sánh sản phẩm thủy phân cám gạo theo qui trình khác Hình Sản phẩm XOS sau sấy phun 11.825 1.65 6.125 9.39 Xylose 6.483 9.84 Volts 0.02 A 8.400 7.51 N am e R etention Tim e Area Percent 0.04 Xylobiose 7.092 45.96 Xylosetriose 7.533 25.65 RID lanhuong 115-1.x10.05042012 0.00 10 12 14 9.467 2.54 Volts 02 B 8.883 15.00 N am e R et ention Tim e Area Perc ent 04 7.950 17.92 Xylobiose 6.917 38.12 R ID lanhuong XOS0.25% 05042012 Xylosetriose 7.458 26.42 M inutes 00 10 12 14 M inutes Hình Phân tích thành phần dịch thủy phân cám gạo với xylanase HPLC A Dịch thủy phân cám gạo sau loại tinh bột protein xử lý với xylanase; B XOS chuẩn 0,25% Cám gạo Dịch cám thô đệm phosphate natri 100mM, pH= 7.0 (1:7 w/v) Làm giàu xylan thủy phân với protease α-amylase Cám gạo xử lý Thu hồi dịch rửa Đệm phosphate natri 100mM, pH= 6,8 ( 1:7 w/v) Chăn nuôi Bổ sung Ultraflo L, ủ 50oC 15 Ly tâm thu dịch Bã ly tâm Sấy thu sản phẩm Hình Sơ đồ qui trình sản xuất XOS từ cám gạo sử dụng cơng nghệ đa enzyme ... cơng nghệ sản xuất XOS dẫn xuất -Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus -Sản xuất 30 kg chế phẩm synbiotic chứa XOS bào tử vi khuẩn Bacillus... hóa nhiều loại vi khuẩn probiotic Xuất phát từ thực tế nêu trên, đề xuất ý tưởng Nghiên cứu sản xuất chế phẩm synbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử cám gạo Đề tài chương trình Nghiên cứu ứng dụng... yếu Nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử từ chủng vi khuẩn probiotic sinh bào tử Bacillus Vi n Công Vi n Công Nghiên cứu nghiệp Thực nghiệp Thực quy trình cơng phẩm phẩm nghệ sản xuất