Header Page of 128 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ************************* PHAN LÊ SƠN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ BÀO TRỨNG BỊ ĐỂ TẠO PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI- 2013 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ************************* PHAN LÊ SƠN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ BÀO TRỨNG BỊ ĐỂ TẠO PHƠI TRONG ỐNG NGHIỆM Chun ngành: Sinh sản bệnh sinh sản gia súc Mã số: 62 64 01 06 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TSKH CÙ XUÂN DẦN PGS.TS HOÀNG KIM GIAO HÀ NỘI- 2013 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 LỜI CAM ĐOAN - Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị - Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn ghi nhận thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Nghiên cứu sinh Phan Lê Sơn luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 Lêi cảm ơn Tụi xin by t lũng bit n sõu sắc đến thầy giáo, cô giáo Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, giảng dạy dìu dắt tơi suốt gần năm học đại học mà tạo điều kiện để tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo tồn thể cán cơng nhân viên Viện Chăn nuôi, quan chủ quản, nơi công tác, trưởng thành, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nhiệm vụ, học tập hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn chân thành đơn vị sau nhiệt tình giúp đỡ để tơi hồn thành luận án - Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Bộ mơn Hóa sinh, Sinh lý động vật, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Bộ mơn Sinh lý, Sinh hóa Tập tính vật nuôi, Viện Chăn nuôi - Trạm kiểm nghiệm Bảo tồn vật ni, Viện Chăn ni Để hồn thành luận án xin gửi tới thầy giáo người hướng dẫn khoa học GS.TSKH Cù Xuân Dần PGS.TS Hồng Kim Giao lòng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ, động viên, dìu dắt tơi sống suốt q trình hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Đặng Thái Hải động viên, dạy bảo, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận án Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ths Lưu Công Khánh, TS Nguyễn Văn Lý, Ths Nguyễn Thị Thoa, TS Phan Văn Kiểm, TS Đào Đức Thà, TS Nguyễn Thạc Hòa bạn đồng nghiệp Xin cảm ơn gia đình người thân động viên, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình cơng tác hoàn thành luận án Hà Nội, năm 2013 Nghiên cứu sinh Phan Lê Sơn luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan………………………………………………………… I Lời cảm ơn…………………………………………………………… II Mục lục……………………………………………………………… III Danh mục từ viết tắt……………………………………………… VI Danh mục bảng…………………………………………………… VII Danh mục hình…………………………………………………… IX MỞ ĐẦU……………………………………………………………… 1 Đặt vấn đề………………………………………………………… Mục đích nghiên cứu……………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài…………………………… Những đóng góp luận án học thuật lý luận………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 1.1 Buồng trứng……………………………………………………… 1.2 Tế bào trứng……………………………………………………… 1.2.1 Sự hình thành tế bào mầm nguyên thủy……………………… 1.2.2 Sự phát triển tế bào mầm nguyên thủy thành túi noãn…… 1.2.3 Sự phát triển túi noãn thành tế bào trứng………………… 1.3 Nang trứng……………………………………………………… 10 1.3.1 Sự hình thành nang trứng nguyên thủy……………………… 10 1.3.2 Sự phát triển nang trứng………………………………… 11 1.3.3 Chức nang trứng…………………………………… 14 1.3.4 Sự hình thành sóng nang……………………………………… 15 1.4 Hormone………………………………………………………… 16 1.4.1 Cơ chế điều khiển hormone đến phát triển nang trứng 16 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 1.4.2 Vai trò FSH ……………………………………………… 17 1.5 Thu tế bào trứng………………………………………………… 19 1.5.1 Thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ……………………… 19 1.5.2 Thu tế bào trứng từ bò sống………………………………… 20 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng số lượng, chất lượng tế bào trứng kết tạo phôi in vitro siêu âm hút tế bào trứng… 23 1.6 Nuôi tế bào trứng in vitro………………………………………… 32 1.6.1 Nuôi thành thục tế bào trứng in vitro………………………… 32 1.6.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết nuôi thành thục tế bào trứng…………………………………………………………………… 35 1.7 Tạo phôi in vitro………………………………………………… 43 1.7.1 Thụ tinh in vitro……………………………………………… 43 1.7.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình thụ tinh tế bào 46 trứng…………………………………………………………………… 1.8 Nuôi phôi in vitro………………………………………………… 48 1.8.1 Môi trường nuôi phôi……………………………………… 48 1.8.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phôi……… 50 1.9 Ảnh hưởng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến kết nuôi thành thục, thụ tinh tạo phôi in vitro………………………… 53 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 56 2.1.Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu…………………… 56 2.1.1.Vật liệu……………………………………………………… 56 2.1.2 Nội dung nghiên cứu………………………………………… 56 2.1.3.Phương pháp nghiên cứu…………………………………… 56 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu……………………………… 64 CHƯƠNG KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………… 66 3.1 Ảnh hưởng áp lực hút ………………………………… 66 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 3.2 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng ……………… 76 3.3 Ảnh hưởng kích thước nang trứng ………………………… 84 3.4 Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển pha nang trứng trội 91 3.5 Ảnh hưởng liều lượng FSH ………………………………… 96 3.6 Ảnh hưởng giống bò………………………………………… 104 3.7 Ảnh hưởng tuổi bò cho tế bào trứng………………………… 109 3.8 Ảnh hưởng mùa vụ…………………………………………… 113 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………… 120 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…………………………………………………………………… 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 123 TIẾNG VIỆT………………………………………………………… 123 TIẾNG ANH………………………………………………………… 124 PHỤ LỤC…………………………………………………………… 148 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA : Bovine Serum Albumin F3 : Holstein Friesian x Lai Sind FCS : Foetal Calf serum FSH : Follicle Stimulating Hormone GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone HEPES : N-(2 Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulforic acid) HF : Holstein Friesian LH : Luteinizing Hormone MEM : Minimum Essential Medium PGF2α : Prostaglandin F2α SOF : Synthetic oviduct fluid TCM-199 : Tisue culture medium 199 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Đặc điểm phát triển nang trứng bò giai đoạn đầu 1.2 Số lượng tế bào trứng tỉ lệ phôi nang thu giống bò khác 1.3 Trang 14 29 Số lượng tế bào trứng phôi nang thu bò độ tuổi khác 31 1.4 Đánh giá chất lượng tế bào trứng mức độ khác 37 1.5 Mối quan hệ đặc điểm tế bào chất chất lượng tế bào trứng 3.1 40 Số lượng nang trứng hút ảnh hưởng áp lực hút đến số lượng tế bào trứng thu 66 3.2 Ảnh hưởng áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng 69 3.3 Ảnh hưởng áp lực hút đến phân chia hợp tử, phôi dâu phôi nang 3.4 72 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.5 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng 3.6 3.9 80 Ảnh hưởng kích thước nang trứng đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.8 79 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến phân chia hợp tử, phôi dâu phơi nang 3.7 76 85 Ảnh hưởng kích thước nang trứng đến chất lượng tế bào trứng 86 Ảnh hưởng kích thước nang trứng đến phân chia 88 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page 10 of 128 hợp tử, phôi dâu phôi nang 3.10 Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển pha nang trứng trội đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.11 Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển pha nang trứng trội đến chất lượng tế bào trứng 3.12 91 93 Ảnh hưởng liều lượng FSH đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 96 3.13 Ảnh hưởng liều lượng FSH đến chất lượng tế bào trứng 98 3.14 Ảnh hưởng liều lượng FSH đến phân chia hợp tử, phôi dâu phơi nang 3.15 Ảnh hưởng giống bò cho tế bào trứng đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.16 110 Ảnh hưởng tuổi bò cho tế bào trứng đến phân chia hợp tử, phôi dâu phôi nang 3.21 109 Ảnh hưởng tuổi bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng 3.20 106 Ảnh hưởng tuổi bò cho tế bào trứng đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.19 105 Ảnh hưởng giống bò cho tế bào trứng đến phân chia hợp tử, phôi dâu phôi nang 3.18 105 Ảnh hưởng giống bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng 3.17 100 111 Ảnh hưởng mùa vụ đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 114 3.22 Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng 115 3.23 Ảnh hưởng mùa vụ đến phân chia hợp tử, phôi dâu phôi nang luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128 115 Header Page 154 of 128 nulliparous heifers and cows at diffent stages of lactation, Theriogenology, 69, pp 932-939 152 Russe I (1983), Oogenesis in cattle and sheep, Bibliotheca Anatomica, 24, pp 77-92 153 Saeki K., Nagao Y., Hoshil M., Nagai M (1995), Effects of heparin, sperm concentration and bull variation on in vitro fertilization of bovine oocytes in a protein-free media, Theriogenology, 43, pp 751-759 154 Sagirkaya H (2006), Developmental and molecular correlates of bovine preimplantation embryos, Reproduction, 131, pp 895-904 155 Saitoh N., Kanagawa H., Shimihira I (1995), Manual of bovine embryo transfer, Japan Livestock Technology Association 156 Sanbuissho A., Threfall W R (1985), The effect of estrous cow serum on the maturation and fertilization of bovine follicular oocyte in vitro, Theriogenology, 23, pp 226 157 Santos J E., Cerri R L., Sartori R (2008), Nutritional management of the donor cow, Theriogenology, 69, pp 88-97 158 Schellander K., Fayrer-Hosken R., Keefer C., Brown L., Malter H., Mcbride C., Brackett B (1989), In vitro fertilization of bovine follicular oocytes recovered by laparoscopy, Theriogenology, 31, pp 927-933 159 Schellander K., Fuhrer F., Brackett B G., Korb B., Schleger W (1990), In vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes matured in medium supplemented with estrous cow serum, Theriogenology, 33, pp 477-485 160 Scott L., Alvero R., Leondires M., Miller B (2000), The morphology of human pronuclear embryo is positively related to blastocyst development and implantion, Human Reproduction, 15, pp 2394-2403 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 154 of 128 Header Page 155 of 128 161 Senger P L (1997), Embryogenesis of the pituitary gland and the male and female reproductive system, Pathways to Pregnancy and Parturition, pp 58-76 162 Shiora Y., Kywayama M., Fukushima M., Iwasaki S., Hanada A (1988), In vitro fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus and matured in vivo, Theriogenology, 39, p 312 163 Sirard M A., Coenon K (1993), The use of a defined medium to evaluate meiotic resumption of immature bovine oocytes, Theriogenology, 39, p 314 164 Sirard M A., Leibfried-Rutledge M L., Parrish J J., Ware C., First N L (1988), The culture of bovine oocytes to obtain developmentally competent embryos, Biological Reproduction, 39, pp 546-552 165 Sirard M A., Picard L., Dery M., Coenen K., Blondin P (1999), The time interval between FSH administration and ovarian aspiration influences the development of cattle oocytes, Therigenology, 51, pp 699708 166 Sirois J., Fortune J E (1990), Lengthening the bovine estrus cycle with low levels of exogenous progesterone: A model for studying ovarian follicular dominance, Endocrinology, 127, pp 916-925 167 Smetanina I G., Tatarinova L V., Krivokharchenoko A S (2000), The effect of composition of culture media on bovine oocyte maturation and embryo development in vitro, Ontogenez, 31, pp 139-143 168 Smitz J E J., Cortvrindt R G (2002), The earliest stages of Folliculogenesis in vitro, Reproduction, 123, pp 185-202 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 155 of 128 Header Page 156 of 128 169 Stubbings, R B., Walton, J S (1995), Effect of ultrasonically-guided follicle aspiration on estrous cycle and follicular dynamics in Holstein cows, Theriogenology, 43, pp 705-712 170 Su L., Yang S., He X., Li X., Ma J., Wang Y., Presicce G., Ji W (2009), Effect of donor age on the development competence of bovine oocytes retrieved by ovum pick up, Reproduction in Domestic Animals, 25 171 Sylvie Bilodeau-Goeseels and Paul Panich (2002), Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos, Animal Reproduction Science, 71, pp 143-155 172 Takuma T., Sakai s., Ezoe D., Ichimaru H., Jinnouchi T., Kaeday Y., Nagai T., Otoi T (2010), Efect of season and reproductive phase on quality, quantity and developmental comprtence of oocytes aspirated from Japanese black cows, Journal of reproduction and development, 56, pp 55 – 59 173 Tanaka Y., Nakada K., Moriyoshi M., Sawamukai Y (2001), Appearance and number of follicles and change in the concentration of serum FSH in female bovine fetuses Animal Reproduction, 121, pp 777782 174 Tanghe S., Vansoom A., Duchateau L., Nauwynck H., De Kruip A (2004), Carbonhydrates and glycoprotein involved in bovine fertilization in vitro, Molecular Reproduction and Development, 68, pp 492-499 175 Techakumphu M., Lohachit C., Tantasuparak W., Intaramongkol C., Intaramongkol S (2000), Ovarian response and oocyte recovery in prepubertal swamp buffalo (Bubalus bubalis) calves after FSH or PMSG treatment, Theriogenology, 54, pp 305-312 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 156 of 128 Header Page 157 of 128 176 Tesarik J., Greco E (1999), The probability of abnormal preimplantation development can be predicted by a single static observation on pronuclear stage morphology, Human Reproduction, 14, pp 318 - 323 177 Townson D H., Tsang P C W., Butler W R., Frajblat M., Griel Jr L C., Johnson C J., Milvae R A., Niksis G M., Pate J L (2002), Relationship of fertility to ovarian follicular waves before breeding in dairy cows, Journal of Animal Science, 80, pp 1053-1058 178 Van Blerkom J (1990), Occurrence and development consequences of abberant cellular organization in meiotically mature oocytes after exogeneous ovarian hyperstimulation, J Electron Microsc, Technique, 16, pp 324-346 179 Van Soom A S., Tanghe I., de Pauw D., Maes, de Kruif (2002), Function of the cumulus oophorus before and during mammalian fertilization, Reprod Dom Anim, 37, pp 144-151 180 Viana J H M., Camargo L S A., Ferreina A M., De Sa., Fernades C A C., Junior A P M (2004), Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but not prevent establishment of dominant follicles in Gir breed (Bos indicus) of cattle, Animal Reproduction Science, 84, pp 1-12 181 Viana J H M., Ferreira A M., So W F., Camagor L S A (2000), Factors effecting recovery and quality of oocyte for bovine embryo production in vitro using ovum pick-up technology, Theriogenology, 54, pp 433-446 182 Viana J H M., Palhao M P., Siqueira L G B Fonseca J F., Camargo J.S.A (2010), Ovarian follicular dynamics, Follicle deviation, and oocyte luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 157 of 128 Header Page 158 of 128 yield in Gyr breed (Bos indicus) cows undergoing repeated ovum pick-up, Theriogenology, 73, pp 966-972 183 Wahid H., Gordon I., Sharif H., Lonergan P., Mongha P., Gallagher M (1992), Effect and efficiency of recovery methods for obtaining ovine follicular oocytes for in vitro procedures, Theriogenology, 37, pp 318 184 Walsh, J H., Montovani, R., Duby, R T., Overstrom, E W., Dobrinsky, J R., Enright, W J., Roche, J F., Boland, M P (1993), The effects of once or twice daily injections of pFSH on the superovulatory response in heifers, Theriogenology, 40, pp 313-322 185 Ward F A P., Lonergan B P., Enright M P (2000), Boland Factors affacting recovery and quality of oocytes for bovine embryo production in vitro using ovum pick up technology, Theriogenology, 54, pp 433-446 186 Wandij S A., Fortier M E., Sirard M A (1992), Differential response to gonadotropins and prostaglandin E2 in ovarian tissue during prenatal and postnatal development in cattle, Biology of Reproduction, 46, pp 10341041 187 Wolfenson D., Roth Z., Meidan R (2000), Impaired reproduction in heat-stressed cattle: basis and applied aspects, Animal Reproduction Science, 60/61, pp 535-547 188 Yamada O., Abe M., Takehana K., Hiraga T., Iwasa K., Hiratsuka T (1995), Microvascular changes during the development of follicles in bovine ovaries: a study of corrosion casts by scanning electron microscopy, Arch Histol Cytol, 58, pp 567-574 189 Yang X., Kubota C., Suzuki H., Taneja M., Bols P E., Presicce G A (1998), Control of oocyte maturation in cows-biological factors, Theriogenology, 49, pp 471-482 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 158 of 128 Header Page 159 of 128 190 Yang Y B., Lu K H (1990), The influence of bovine oocyte type on in vitro fertilization and subsequent in vitro development, Theriogenology, 33, p 355 191 Younis A I., Brckett B G., Fayrer-Hosken R A (1989), Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro, Gamete Research, 23, pp 189-201 192 Zeron Y A., Ocheretny O., Keda A., Borochov D., Skla., Arav A (2001), Seasonal changes in bovine fertility: Relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles, Reproduction, 121, pp 447-454 193 Ziebe S., Petersen K., Lindenberg S., Anderson A G., Gabrielsen A., Andersen A N (1997), Embryo morphology or cleavage stage: How to select the best embryo for transfer after in vitro fertilization, Human Reproduction, 12, pp 1545-1549 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 159 of 128 Header Page 160 of 128 PHỤ LỤC Dụng cụ hóa chất - Hệ thống siêu âm hút tế bào trứng gồm: hình siêu âm HS-2000, HONDA, đầu dò siêu âm có đường dẫn kim hút tế bào trứng 7,5 MHz HBV-4710 MV, máy tạo áp suất FHK, Model 4, kim hút tế bào trứng 18 G, COVA, bình ổn nhiệt Fujihira Nhật Bản - Các loại kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi vi thao tác Nikon TE 300; Kính hiển vi soi Wild M3B; Kính hiển vi soi Leica MZ6; Kính hiển vi soi Olympus SD 30; Kính hiển vi Olympus CH30 - Tủ nuôi cấy CO2 – Sanyo CO2 Incubator - Buồng vô trùng Labcaire - Cân phân tích Precisa - Máy li tâm Universal 32R - Bồn nước ổn nhiệt Memer Waterbath - Máy ổn nhiệt HT 50 - Máy rửa dụng cụ siêu âm - Tủ sấy khô SL Shel lab - Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator - Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS-325 - Máy đông lạnh CL – 2000 - Buồng đếm Thoma - Pippetteman cỡ: 100µl, 200 µl, 1000 µl - Các loại đĩa petri: Falcon disk, Grainer disk, Nunc disk - Pippete pasteur - Găng tay vô trùng, bơm tiêm ml, kim tiêm 18G, microfilter 0,22 µm - Các loại hóa chất chuyên dụng: luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 160 of 128 Header Page 161 of 128 Sucrose C12H22O11 196-00015 Wako Japan Disodium Hydrogenphosphate Na2HPO4 197-02865 Wako Japan D(+) – Glucose C6H12O6 041-00595 Wako Japan Potassium Dihydrogenphosphate KH2PO4 165-04242 Wako Japan Potassium Chloride KCl 163-03545 Wako Japan Sodium Hydrogen Carbonate NaHCO3 191-01305 Wako Japan Sodium Chloride NaCl 191-01665 Wako Japan Sodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate NaH2CO3.2H2O 192-02815 Wako Japan Calcium Chloride Dihydrate CaCl2.2H2O 031-00435 Wako Japan Phenol Red Solution 0,5% P0290 Sigma Magnesium Chloride Hexahydrate MgCl2.6H2O 131-00162 Wako Japan Ethylene Glycol C2H6O2 Prolabo Germany Glycerol Prolabo Germany Medium 199 3769 GIBCO BME Amino Acide Solution 50x B-6766 Sigma MEM Non-Essential Amino Acide Solution 100x 02380 GIBCO Penicilin G Potassium 200.000 Meiji Seika Kaisha LTD Tokyo Japan Novo-Heparin Pharmaceutical Products LTD V ventis Japan Streptomycin Sulphate 1g Meiji Kaisna LTD Tokyo Japan L-Glutamic Acid G-4815 Sigma Albumin, Bovine A-4378 Sigma Caffein Sodium Benzoate C-4144 Sigma L(+)-Lactic Acid L-4388 Sigma Albumin, Bovine A-7030 Sigma Sodium Pyruvate 199-03062 Wako Japan luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 161 of 128 Header Page 162 of 128 Chuẩn bị môi trường 2.1 Môi trường siêu âm hút tế bào trứng (mDPBS) Pha môi trường PBS (-) NaCl 8,0g KCl 0,2g Na2HPO4 1,15g KH2PO4 0,2g Nước cất khử ion 700ml Pha môi trường PBS (+) CaCl2 0,1g MgCl2.6H2O 0,1g Nước cất khử ion 200ml Sau chuẩn bị xong, rót từ từ mơi trường PBS (+) vào mơi trường PBS (-) để tránh kết tủa Sau bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion để đủ 1000ml Sau đó, bổ sung thêm 1,0 g glucose, 0,036 g Sodium pyruvate mDPBS Sau lọc seize bảo quản tủ lạnh Để siêu âm hút tế bào trứng sử dụng môi trường mDPBS bổ sung 2% heparin 100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml 2.2 Môi trường lọc tìm trứng Sử dụng mơi trương mDPBS, bổ sung 5% huyết bê sinh 100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml 2.3 Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM 199 47,5 ml CS 2,5 ml Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml) Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 162 of 128 Header Page 163 of 128 Bịt parafil lắc nhiều lần ta 50 ml mơi trương ni, sau lọc microfilter 2.4 Mơi trường BO để hoạt hóa tinh trùng, rửa tế bào trứng thụ tinh in vitro 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch BO gốc (BO = Brackett Oliphan) Dung dịch A NaCl 4,3092g KCl 0,1974g CaCl2.2H2O 0,2171g NaH2PO4.2H2O 0,0840g MgCl2.6H2O 0,0697g Phenol Red (dung dịch 0,5%) 0,1ml Nước khử ion Thêm đủ 500ml Dung dịch B NaHCO3 2,5873g Phenol Red 0,5% 0,04ml Nước khử ion Thêm đủ 200ml 2.4.2 Chuẩn bị môi trường BO Dung dịch A 76ml Na pyruvate 0,01375g Penicilin 10.000IU Streptomycin 10mg Dung dịch B 24ml Sau chuẩn bị xong, lọc microfilter 2.4.3 Chuẩn bị mơi trường hoạt hóa tinh trùng Dung dịch BO 50ml Na Caffein benzoate 0,1942g luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 163 of 128 Header Page 164 of 128 Heparin (Novo-heparin: 5000IU/ml) 50 µl 2.4.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng Dung dịch BO 40ml BSA 400mg 2.4.5 Dung dịch thụ tinh ống nghiệm Dung dịch BO 10ml BSA 200mg 2.5 Chuẩn bị môi trường nuôi phôi (CR1aa) Dung dịch A NaCl 6,7031g KCl 0,2311g Na Pyruvate 0,0440g NaHCO3 2,2011g Phenol Red 5% 2ml Nước cất khử ion Thêm đủ 760ml Dung dịch B Hemicalcium lactate 0,5996g Nước cất khử ion Thêm đủ 200ml Môi trường CR1aa Dung dịch A 76ml Dung dịch B 20ml BME Essential Amino Acids 2ml MEM Non Essential Amino Acids 1ml L-Glutamic Acid (2mg/ml) 1ml BSA 3mg/ml Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml) Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 164 of 128 Header Page 165 of 128 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 165 of 128 Header Page 166 of 128 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 166 of 128 Header Page 167 of 128 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 167 of 128 Header Page 168 of 128 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 168 of 128 ... ảnh hưởng đến hiệu kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phơi ống nghiệm" Mục đích nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến hiệu kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phơi ống nghiệm. .. dạng tế bào trứng, … Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến số lượng nang trứng hút, số lượng, chất lượng tế bào trứng, phôi dâu phôi nang thu tiến hành siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phơi ống nghiệm. .. lực hút đến phân chia hợp tử, phôi dâu phôi nang 3.4 72 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số lượng nang trứng hút số lượng tế bào trứng thu 3.5 Ảnh hưởng tần suất siêu âm hút tế bào