BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ THANH THANH Lớp: DH07DY Ngành: Thú Y chuyên ngành Dược Niên khóa: 2007 – 2012 Tháng 08/2012 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y **************** HUỲNH THỊ THANH THANH PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA TIÊU CHẢY BẰNG KỸ THUẬT PCR Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y Chuyên ngành Dược Giáo viên hướng dẫn PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN KS VĂN NGỌC DUNG Tháng 08/2012 i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên : HUỲNH THỊ THANH THANH Lớp : DH07DY Tên đề tài : “Phát yếu tố độc lực E coli phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy kỹ thuật PCR” Khóa luận thực theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến, đóng góp hội đồng chấm luận văn Ngày… tháng… năm 2012 Giáo viên hướng dẫn PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN ii LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên, cảm ơn cha mẹ người thân gia đình ln chăm sóc, nuôi dưỡng dạy dỗ ngày hôm Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy Nguyễn Ngọc Tuân nghiêm khắc, quan tâm, hướng dẫn, bảo tận tình cho trình thực tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời trân trọng cảm ơn: - Ban giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh - Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi – Thú y - Quý thầy cô khoa Chăn nuôi – Thú y tận tình, hết lòng học trò Chân thành cảm ơn thầy Lê Hữu Ngọc, cô Văn Ngọc Dung, anh chị em phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản Môi trường Sức khỏe Vật nuôi, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn tất bạn bè động viên, chia sẻ buồn vui quãng đời sinh viên Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trần Thị Mỹ Phúc tận tình bảo đồng hành suốt thời gian thực tập Và lời cuối cùng, xin kính chúc tồn thể Quý thầy cô Khoa Chăn nuôi – thú y dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công nghiệp giáo dục hoạt động nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Huỳnh Thị Thanh Thanh iii TÓM TẮT Đề tài “Phát yếu tố độc lực Escherichia coli phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy kỹ thuật PCR” thực trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, từ tháng 12/2011 đến tháng 6/2012 Quá trình nghiên cứu bao gồm thu thập xử lý 48 mẫu phân heo sơ sinh cai sữa, xác định tổng số vi khuẩn E coli, dùng kỹ thuật PCR để phát gen độc lực Kết thu được: Số lượng vi khuẩn E coli phân heo sơ sinh tiêu chảy giai đoạn – 21 ngày tuổi 1,58*108 MPN/g, cao heo giai đoạn 22 – 45 46 – 90 ngày tuổi Tỉ lệ phát gen độc lực E coli phân heo sơ sinh heo cai sữa tiêu chảy 43,75 % Tỉ lệ phát gen astA cao (37,5 %), cho thấy gen astA sản sinh yếu tố độc lực EAST1, yếu tố độc lực quan trọng dòng E coli gây bệnh phân heo tiêu chảy từ – 21 ngày tuổi, yếu tố hiệp lực phát sinh bệnh tiêu chảy E coli heo giai đoạn 22 – 90 ngày tuổi (heo sau cai sữa đến tháng) Chưa phát gen lt-I gen stx1 E coli 48 mẫu phân heo sơ sinh cai sữa iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu .2 Chương TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Nuôi cấy đặc điểm sinh hóa 2.1.3 Yếu tố kháng nguyên 2.1.4 Phân loại E coli gây bệnh 2.2 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC .7 2.2.1 Độc tố Shiga (Shiga toxin) 2.2.2 Yếu tố kết bám intimin .7 2.2.3 Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1: 2.3 NHÓM ETEC (Enterotoxigenic E coli) 2.3.1 Yếu tố độc lực 2.3.2 Tiêu chảy nhóm ETEC 10 2.4 NHÓM EPEC (Enteropathogenic E coli) 11 2.5 Kỹ thuật PCR 12 2.5.1 PCR gì? 12 2.5.2 Nguyên tắc PCR 13 2.5.3 Các thành phần phản ứng PCR 14 v 2.5.4 Phân tích kết PCR .15 2.6 Những cơng trình nghiên cứu liên quan 16 2.6.1 Trong nước .16 2.6.2 Thế giới 16 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 17 3.1 Thời gian địa điểm thực 17 3.1.1 Thời gian thực 17 3.1.2 Địa điểm thực 17 3.2 Nội dung thực 17 3.3 Phương pháp thực 17 3.3.1 Thu thập mẫu 17 3.3.2 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn 18 3.3.3 Ly trích DNA 19 3.3.4 Xác định gen liên quan đến yếu tố độc lực E coli 19 3.4 Chỉ tiêu khảo sát 20 Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 22 4.1 Tổng số E coli từ phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy theo ngày tuổi .22 4.2 Tỷ lệ mang gen liên quan đến yếu tố độc lực gốc E.coli phân lập 23 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Tồn .27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 34 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/E: Attaching - and - Effacing AMP: Adenosine 5’ monophosphate cAMP: cyclic Adenosine 5’ monophosphate CF: Colonization Factor DAEC: Diffusely adherent E coli DNA: Deoxyribonucleotide Acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate Eae: E coli attaching and effacing EAEC: Enteroaggregative E coli EAST1: Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable toxin EC: Enrichment Coli ED: Edema Disease EHEC: Enterohaemorrhagic E coli EIEC: Enteroinvasive E coli EMB: Eosin Methylen Blue EPEC: Enteropathogenic E coli ETEC: Enterotoxigenic E coli FAO: Food and Agriculture Organization GC-C: Guanylate Cyclase C GMP: Guanosine 5’ monophosphate HC: Haemorrhagic Colitis HUS: Haemolytic Uraemic Syndrome IMViC: Indol, Methyl red, Voges Proskauer, Citrate LT: heat-labile toxin LTB: Lauryl Tryptose Broth vii MR: Methyl Red MWM: Molecular Weight Marker NA: Nutrient Agar PCR: Polymerase Chain Reaction SE: Standard Error SLTEC: Shiga Like Toxin producing E coli ST: heat-stable toxin STEC: Shiga Toxin producing E coli Stx: Shiga toxin TBE: Tris-base Boric acid EDTA Tm: Temperature melting TP.HCM: Thành Phố Hồ Chí Minh TSI: Triple Sugar Iron UI: International Unit UV: ultraviolet VP: Voges Proskauer VT: Verotoxin VTEC: Verotoxigenic E coli viii DANH SÁCH CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Các type ETEC gây tiêu chảy phù thũng heo sau cai sữa 11 Bảng 2.2 Tóm tắt nhóm E coli quan trọng gây bệnh heo từ sơ sinh đến cai sữa 12 Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập, định lượng vi khuẩn E coli .18 Bảng 4.1 Tổng số E coli phân heo tiêu chảy theo ngày tuổi 22 Bảng 4.2 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo – 21 ngày tuổi 23 Bảng 4.3 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo 22 – 45 ngày tuổi 24 Bảng 4.4 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo 46 – 90 ngày tuổi 24 Bảng 4.5 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli phân lập .25 ix Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Tổng số E coli từ phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy theo ngày tuổi Xác định tổng số vi khuẩn E coli mẫu phân heo – 21 ngày tuổi, 22 mẫu phân heo 22 – 45 ngày tuổi 17 mẫu phân heo 46 – 90 ngày tuổi theo qui trình định lượng, kết trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1 Tổng số E coli phân heo tiêu chảy theo ngày tuổi Nhóm heo Số mẫu Tổng số E coli trung bình g phân (X ± SE) (MPN/g) – 21 ngày tuổi 1,58*108 ± 1,18*108 22 – 45 ngày tuổi 22 3,82*106 ± 2,35*106 46 – 90 ngày tuổi 17 3,68*106 ± 2,66*106 E coli vi khuẩn thuộc nhóm coliform sống thường trực chiếm ưu đường ruột người gia súc, theo phân phát tán vào mơi trường bên ngồi Kết xác định tổng số E coli phân heo tiêu chảy theo ngày tuổi cho thấy tổng số vi khuẩn E coli trung bình phân heo tiêu chảy từ – 21 ngày tuổi 1,58*108 MPN/g, biến thiên từ 1,10*106 đến 1,10*109 Kết phù hợp với kết nghiên cứu Phạm Thế Sơn cs năm 2008 1,56*108 MPN/g Điều cho thấy heo sơ sinh từ – 21 ngày tuổi, thời kỳ có tỉ lệ mắc bệnh chết tiêu chảy cao, số lượng vi khuẩn đường ruột tăng lên đột ngột heo mắc bệnh biến động loại vi khuẩn thường gặp gây ra, có E coli Tuy nhiên, tổng số E coli trung bình mẫu phân heo tiêu chảy 22 – 45 ngày tuổi 46 – 90 ngày tuổi biến thiên khoảng 3,82 – 3,68*106 MPN/g, thấp tổng số E coli phân heo – 21 ngày tuổi Kết thấp so với kết công bố Phạm Thế Sơn cs (2008) Thật vậy, số lượng E coli phân biến thiên lồi, phụ thuộc vào lứa tuổi, tình trạng tiêu chảy, cách chăm sóc quản lý, tình trạng sinh lý cá 22 thể Ngồi ra, mẫu phân lấy từ heo giai đoạn sử dụng kháng sinh, tổng số E coli thấp 4.2 Tỷ lệ mang gen liên quan đến yếu tố độc lực gốc E.coli phân lập Sau xác định tổng số E coli phân heo sơ sinh heo cai sữa, tiến hành xác định gen liên quan đến yếu tố độc lực gốc E coli phân lập, cách thu thập khuẩn lạc điển hình từ 48 mẫu phân heo tiêu chảy nhóm tuổi: heo từ – 21 ngày tuổi, heo từ 22 – 45 ngày tuổi, heo từ 46 – 90 ngày tuổi Kết ghi nhận Bảng 4.2, Bảng 4.3 Bảng 4.4 Bảng 4.2 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo – 21 ngày tuổi Mẫu Gen độc lực lt-I sta stb astA stx2e stx1 stx2 eae - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - mẫu lại - - - - - - - - Cộng 0 0 0 Tỉ lệ (%) 0 55,5 0 0 Kết Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ gen astA sản sinh yếu tố độc lực EAST1 5/9 mẫu (55,5%) Choi cs (2001) báo cáo gen astA diện phổ biến phân heo theo mẹ (164/720 gốc = 22,78 %) Tác giả nhận định gen astA yếu tố độc lực quan trọng dòng E coli gây bệnh phân heo theo mẹ Ở nhóm heo 22 – 45 ngày tuổi, tỉ lệ phát gen astA 4/22 mẫu (18,2 %), gen sta với 1/22 mẫu (4,5 %), trình bày Bảng 4.3 23 Bảng 4.3 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo 22 – 45 ngày tuổi Mẫu Gen độc lực lt-I sta stb astA stx2e stx1 stx2 eae - - - + - - - - - + - + - - - - - - - + - - - - - - - + - - - - 18 mẫu lại - - - - - - - - Cộng 0 0 Tỉ lệ (%) 4,5 18,2 0 0 Bảng 4.4 Kết phát gen độc lực E coli từ phân heo 46 – 90 ngày tuổi Mẫu Gen độc lực lt-I sta stb astA stx2e stx1 stx2 eae - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - + - - - - - - + - - - - - - + - + - - - - - - - + - - - - - + - + - - + - - + - + - - - - 10 - - - + - - - - 11 - - - - - - - + 12 - + - + - - - - mẫu lại - - - - - - - - Cộng 0 1 Tỉ lệ (%) 23,5 17,6 52,9 0 5,8 5,8 24 Trong trường hợp nhóm heo 46 – 90 ngày tuổi, gen astA chiếm tỉ lệ cao 52,9 % (9/17 mẫu) gen sta stb có tỉ lệ 23,5 % (4/17 mẫu) 17,6 % (3/17 mẫu), gen stx2 gen eae có 1/17 mẫu dương tính (5,8 %) Theo Choi cs (2001), gen astA yếu tố hiệp lực phát sinh bệnh tiêu chảy E coli heo cai sữa Với 48 mẫu phân heo sơ sinh heo cai sữa tiêu chảy nhóm tuổi: mẫu phân heo – 21 ngày tuổi, 22 mẫu phân heo 22 – 45 ngày tuổi, 17 mẫu phân heo 46 – 90 ngày tuổi, tổng kết kết phát gen độc lực E coli phân lập trình bày Bảng 4.5 Bảng 4.5 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli phân lập Nhóm heo – 21 ngày tuổi N n Gen độc lực lt-I sta stb astA stx2e stx1 stx2 eae 0 0 0 (%) 55,5 0 55,5 0 0 22 – 45 ngày 22 4 0 0 tuổi (%) 18,2 4,5 18,2 0 0 46 – 90 ngày 17 12 0 1 tuổi (%) 70,59 0 5,8 5,8 Cộng 48 21 0 1 (%) 43,75 0 2,1 2,1 23,5 17,6 52,9 18 10,4 6,25 37,5 N: số lượng mẫu khảo sát n: số lượng mẫu phát vi khuẩn E coli có mang gen độc lực Như vậy, 48 mẫu E coli phân lập định lượng, 21 mẫu phát mang gen độc lực, chiếm tỉ lệ 43,75 % Gen astA phát với tỉ lệ cao (37,5 %), gen sta diện E coli phân lập từ phân heo cai sữa tiêu chảy 10,4 %, tương tự gen stb 6,25 %, gen stx2 gen eae phát với tần số thấp (2,1 %) Không phát gen stx1 48 mẫu E coli phân lập định lượng Điều phù hợp với kết nghiên cứu Blanco cs (1997) tác giả kết luận gen stx1 thường không diện heo (chỉ phát 1/74 dòng 25 E coli heo tiêu chảy phù thũng) Botteldoorn cs (2003) xét nghiệm 177 mẫu phân heo không phát mẫu E coli mang gen stx1 Bên cạnh đó, Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ phát gen độc lực tương đối thấp so với nghiên cứu trước đây, đặc biệt trường hợp yếu tố độc lực gây nên tiêu chảy heo sơ sinh heo cai sữa STa, STb, LT Nguyên nhân qui trình định lượng, E coli tăng sinh chọn lọc môi trường EC 44,5oC 24 Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiệt độ cao (≥ 44oC) chủng E coli gây bệnh phát triển yếu dần, chủng E coli cộng sinh phát triển nhanh Ngoài Hill Carlisle ghi nhận tăng sinh mơi trường 44,5oC làm plasmid mã hóa yếu tố độc lực làm giảm số lượng dòng E coli gây bệnh (theo dẫn liệu Doyle Padhye, 1989) Từ lý trên, cho thấy ưu điểm phương pháp phân lập E coli theo qui trình định lượng xác định tổng số vi khuẩn E coli mẫu khảo sát, E coli phân lập chưa bao gồm chủng E coli gây bệnh (do khó vượt qua giai đoạn tăng sinh nhiệt độ 44,5oC) Đây có lẽ lý ảnh hưởng đến kết phát gen độc lực có tỉ lệ thấp E coli thu thập từ qui trình định lượng 26 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết xác định tổng số vi khuẩn tầm soát gen độc lực E coli phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy kỹ thuật PCR, rút số kết luận sau: Số lượng vi khuẩn E coli phân heo sơ sinh tiêu chảy giai đoạn – 21 ngày tuổi cao heo giai đoạn 22 – 45 46 – 90 ngày tuổi Tỉ lệ phát gen độc lực E coli phân heo sơ sinh heo cai sữa tiêu chảy 43,75 % Gen astA sản sinh yếu tố độc lực EAST1, yếu tố độc lực quan trọng dòng E coli gây bệnh phân heo tiêu chảy từ – 21 ngày tuổi, yếu tố hiệp lực phát sinh bệnh tiêu chảy E coli heo giai đoạn 22 – 90 ngày tuổi (heo sau cai sữa đến tháng) Chưa phát gen lt-I gen stx1 E coli 48 mẫu phân heo sơ sinh cai sữa 5.2 Tồn Do kinh phí thời gian có hạn, đề tài chúng tơi hạn chế: Chưa xác định tổng số vi khuẩn tỷ lệ phát gen độc lực E coli phân heo sơ sinh heo cai sữa bình thường Chưa ly trích trực tiếp DNA vi khuẩn từ phân heo sơ sinh heo cai sữa để phát gen độc lực kỹ thuật PCR 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử (Khái niệm - Phương pháp Ứng dụng) Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gene độc lực Escherichia coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex PCR Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, trang 123 – 133 Nguyễn Xn Hòa, Lê Văn Phước, Phạm Quang Trung, Lê Xuân Ánh Hồ Lê Quỳnh Châu, 2009 Xác định gien sinh độc tố vi khuẩn E coli phân lập từ heo bị tiêu chảy Tạp chí Khoa học, Đại học Huế số 55: 123 – 129 Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học Phạm Thế Sơn, Lê Văn Tạo, Cù Hữu Phú Phạm Khắc Hiếu, 2008 Đặc tính vi khuẩn E coli, Salmonella spp Cl perfringens gây bệnh lợn tiêu chảy Khoa học kỹ thuật Thú y Số – 2008: 73 – 77 Tô Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Tr 45 – 50 28 TIẾNG NƯỚC NGOÀI Afset J E., Bruant G., Brousseau R., Harel J., Anderssen E., Bevanger L and Bergh K., 2006 Identification of virulence genes linked with diarrhea due to atypical enteropathogenic Escherichia coli by DNA microarray analysis and PCR Journal of Clinical Microbiology 44: 3703 – 3711 Blanco M., Blanco J E., Gonzalez E A., Mora A., Jansen W., Gomes T A T., Zerbini L F., Yano T., de Castro A F P., and Blanco J., 1997 Note: Genes coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcin Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype J Clin Microbiol 35: 2958 – 2963 10 Blanco M., Blanco J E., Mora A., Dahbi G., Alonso M P., González E A., Bernárdez M I., and Blanco J., 2004 Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga toxin (Verotoxin)-producing Escherichia coli isolates from cattle in Spain and identification of a new intimin variant gene (eae-ξ) J Clin Microbiol 42: 645 – 651 11 Blanco M., Lazo L., Blanco J E., Dahbi G., Mora A., López C., González E A and Blanco J., 2006 Serotypes, virulence genes, and PFGE patterns of enteropathogenic Escherichia coli isolated from Cuban pigs with diarrhea International Microbiology 9: 53 – 60 12 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N and Herman L., 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154: 97 – 104 29 13 Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barrett T J., Griffin P M and Strockbine N A., 1996 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 62: 118 – 119 14 Choi C., Kwon D and Chae C., 2001 Prevalance of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin gene and its relationship with fimbrial and enterotoxin genes in E coli isolated from diarrheic piglets J Vet Diagn Invest 13: 26 – 29 15 Choi C., Cho W., Chung H., Jung T., Kim J and Chae C, 2001 Prevalance of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin (EAST1) gene in isolates in weaned pigs with diarrhea and/or edema disease Veterinary Microbiology 81: 65 – 71 16 Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O'Brien A D., Alroy J and Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92: 1418 – 1424 17 Doyle M P and Padhye V V., 1989 Escherichia coli In: Foodborne bacterial pathogens (Ed M P Doyle) Marcel Decker Inc New York p.235 – 281 18 Fairbrother J M, 2012 Neonatal Escherichia coli diarrhea In Disease of swine 19 FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory 20 Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H and Okamoto K., 1992 Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II Infect Immun 60: 4468 – 4474 30 21 Kaffmann F., 1947 The serology of coli group J Immunol 57: 71 – 100 22 Kaper J B., Nataro J P and Mobley H T L., 2004 Pathogenic Escherichia coli Nature Reviews Microbiology 2: 123 – 140 23 Konowalchuk J., Speirs J I and Stavric S., 1977 Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli Infect Immun.18: 775 – 779 24 Nataro J P and Kaper J B., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli J Clin Microbiol Rev 11(1): 142 – 201 25 Nguyen L., Truong T and Nguyen G., 2009 Determining virulence factors of Escherichia coli strains isolated from diarrhea piglets by using PCR method J Sci 7: 187 – 191 26 Ojeniyi, B., Ahrens, P., Meyling, A., 1994 Detection of fimbrial and toxin genes in Escherichia coli and their prevalence in piglets with diarrhea The application of colony hybridization assay, polymerase chain reaction and phenotypic assays Journal of Veterinary Medicine B 41, 49–59 27 Osek, J., Gallien, P., Truszczynski, M., Protz, D., 1999 The use of polymerase chain reaction for determination of virulence factors of Escherichia coli isolated from pigs in Poland Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 22, 163–174 28 Paton A W and Paton J C., 1998 Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assay for stx1, stx2, eaeA, 31 enterohemorrhagic E coli hlyA, rfbO111 and rfbO157 J Clinical Microbiol 36 (2): 598 – 602 29 Piérard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D and Lauwers S., 1998 Identification of New Verocytotoxin type Variant B-Subunit Genes in Human and Animal Escherichia coli Isolates J Clin Microbiol 36 (11): 3317 – 3322 30 Runnels P L and Moon H W., 1984 Capsule reduces adherence of enterotoxigenic Escherichia coli to isolated intestinal epithelial cells of pigs Infection and Immunity 45: 737 – 740 31 Sandhu K.S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H and Gyles C L., 1996 Prevalence of the eaeA gene in Verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario Epidemiol Infect 116: – 32 Taylor D N., Echeverria P., Sethabutr O., Pitarangsi C., Leksomboon U., Blacklow N R., Rowe B., Gross R and Cross J., 1988 Clinical and microbiologic features of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infections detected by DNA hybridization Journal of Clinical Microbiology 26: 1362 – 1366 33 Vidotte M C., Lima N C S., Fritzen J T T., Freitas J C.,Venâncio M J and Ono M A., 2009 Frequency of virulence genes in Escherichia coli strains isolated from piglets with diarrhea in the North Parana State, Brazil Brazilian Journal of Microbiology 40: 199 – 204 34 Yamamoto, T., Nakazawa, M., 1997 Detection and sequences of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin1 gene in enterotoxigenic 32 E coli strains isolated from piglets and calves with diarrhea Journal of Clinical Microbiology 35, 223 – 227 33 PHỤ LỤC Môi trường thuốc thử sử dụng cho qui trình định lượng Mơi trường LTB (Lauryl Tryptose Broth, Himedia) Tryptose 20 g Lactose 5g NaCl 5g Dipotassium phosphate 2,75 g Monopotassium phosphate 2,75 g Sodium lauryl sulphate 0,1 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 6,8 ± 0,2 (25oC) EC Broth (Enrichment Coli Broth, Himedia) Casein enzymic hydrolysate 20 g Lactose 5g Bile salt mixture 1,5 g Dipotassium phosphate 4g Monopotassium phosphate 1,5 g Sodium chloride 5g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 6,9 ± 0,2 (25oC) NA (Nutrient Agar, Merck) Peptone from meat 5g Meat Extract 3g Agar 12 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 7,4 ± 0,2 (25oC) 34 EMB (Eosin Methylen Blue, Himedia) Peptic digest of animal tissue 10 g Lactose 5g Sucrose 5g Dipotassium phosphate 2g Agar 13,5 g Eosin – Y 0,4 g Methylene blue 0,065 g Nước cất vừa đủ 1000 ml o pH = 7,2 ± 0,2 (25 C) MR – VP Broth (Acumedia) Peptone 7g Dextrose 5g K2HPO4 5g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 6,9 ± 0,2 (250C) SIMMONS CITRAT AGAR (Himedia) Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Bromo thymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH = 6,8 ± 0,2 (25oC) INDOL (Tryptone water, Oxoid) Tryptone 10 g NaCl 5g 35 Thuốc thử Kovac’s Paradimethylaminobenzaldehyde 5g Isoamyl alcohol 75 ml HCl 25 ml VP (Voges Proskauer) Alpha naphthol 5g Ethanol tuyệt đối 100 ml KOH 40% KOH 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,04 Alcohol 60 ml Hóa chất dùng trình điện di TBE (Tris-base Borate EDTA, Promega) 10 X Tris-borate 890 mM Acid Boric 890 mM EDTA 20 mM pH = 8,3 Agarose (2%) Loading dye Ladder 100 bp (Promega) Hóa chất cho nhuộm gel TBE 1X Ethidium bromide 10 mg/ml 36 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y **************** HUỲNH THỊ THANH THANH PHÁT HIỆN CÁC YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ESCHERICHIA COLI TRONG PHÂN HEO SƠ SINH VÀ CAI SỮA TIÊU... TUÂN KS VĂN NGỌC DUNG Tháng 08/2012 i PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên : HUỲNH THỊ THANH THANH Lớp : DH07DY Tên đề tài : “Phát yếu tố độc lực E coli phân heo sơ sinh cai sữa tiêu chảy... nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Huỳnh Thị Thanh Thanh iii TÓM TẮT Đề tài “Phát yếu tố độc lực Escherichia coli phân heo sơ sinh cai sữa tiêu