Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC HÓA HƯỚNG ĐỘNG CỦA VI KHUẨN PHÂN HỦY 2,4-D ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở TIỀN GIANG VÀ SÓC TRĂNG Cán hướng dẫn: hiện: Ths Nguyễn Thị Phi Oanh Bộ Môn Sinh Học Sinh viên thực Lý Thị Thùy Linh MSSV:3082435 Lớp: Sinh học, khóa 34 Cần Thơ, tháng 5/2012 i Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp đóng phần quan trọng hành trang học tập sinh viên nói chung, sinh viên ngành Sinh Học nói riêng Nó giúp tơi tiếp cận với thực tế, có thêm nhiều kiến thức ngành học định hướng cho lựa chọn nghiên cứu khoa học sau này; từ trang bị kiến thức thực tế tổng quan giúp tơi có khả định hướng tốt cơng việc có chuẩn bị tốt sau kết thúc học tập trường Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến TH.S Nguyễn Thị Phi Oanh tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Trần Thanh Mến q thầy mơn Sinh Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên cho tảng kiến thức, cho niềm tin vật chất để tơi học hỏi, trao dồi thêm kỹ Tơi xin cám ơn bạn Võ Thị Ngọc Diễm, chị Nguyễn Thị Mai Phương, Cao Học Sinh Thái Học K16 đồng hành suốt trình nghiên cứu anh Quách Quang Huy,các bạn lớp Sinh Học K34, anh chị phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử tận tình động viên giúp đỡ tơi thời gian qua Có thể trình học tập, nghiên cứu, với vốn kiến thức kinh nghiệm non nớt, chắn tơi khơng thể khơng có thiếu sót định Rất mong hướng dẫn, bảo từ phía q thầy cơ, anh chị trước để tơi hồn thiện hơn, tiếp tục đường nghiên cứu khoa học, xã hội Xin chân thành cảm ơn! Lý Thị Thùy Linh LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thân tôi, số liệu nêu luận văn trung thực Nếu sai, xin chịu hoàn toàn trách nhiệm chịu kỷ luật khoa nhà trường đề MỤC LỤC Mục lục .i Danh mục từ viết tắt .iii Danh mục bảng iv Danh mục hình v Tóm lược vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình sử dụng thuốc bảo vệ vật………………………………………………….… ……… thực 2.1.1 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật giới…………………… 2.1.2 Tình hình sử dụng thuốc BVTV Việt Nam……………………………… 2.2 Ảnh hưởng thuốc BVTV với môi trường tiềm sử dụng chế phẩm sinh học………………… 2.3 Tác hại thuốc diệt cỏ 2,4-D………………… …………………………… 2.5 Sự phân hủy sinh học 2,4-D…………………………………………………… 2.6 Hóa hướng động vi khuẩn………….……………………………………… 2.6.1 Hóa hướng động 2.6.2 Cơ chế hóa hướng động……………………………………………….…… 2.6.3 Hóa hướng động đến hợp chất nhân thơm có gốc Clo……………… 11 2.6 Các phương pháp kiểm tra hóa hướng động khuẩn…………………….…12 2.6.1 Thí nghiệm mơi trường agar………………………………………….1 2.6.2 Thử nghiệm agarose plug………………………………….…………12 2.6.3 Bộ nhỏ giọt…………………………………………………………….… 12 ii vi Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 2.6.4 Đo tỉ trọng chất hấp dẫn…………………………………………… 13 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP………………………… 14 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài…………………………….…… 14 3.2 Phương tiện thí nghiệm………………………………………………… 3.2.1 Thiết 14 bị thí nghiệm…… ………………………………………… … 14 3.2.2 Hóa chất……………………………………………………………… 14 3.2.3 Các dòng vi khuẩn dùng thí nghiệm……………….……… … ….15 3.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 15 3.3.1 Cơ sở tiến hành thí nghiệm khảo sát hóa hướng động…………………… 15 3.3.2 Thí nghiệm chứng minh tượng hóa hướng động………………………16 3.3.3 So sánh khả di chuyển theo 2,4-D dòng vi khuẩn ……… 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… ………….18 Khả hóa hướng động dòng vi khuẩn phân hủy 2,4D…………18 So sánh khả hóa hướng động đến 2,4-D dòng vi khuẩn………21 4.2.1 Khả hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Giang 4.2.2 Khả hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn iii 21 Tiền Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 phân lập Sóc Sóc Trăng……………………………………………………… 23 4.2.3 Khả hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn Tiền Giang Trăng……………………………………………………….25 4.2.4 Mối quan hệ khả hóa hướng động phân hủy 2,4-D dòng vi …………………………………………………… khuẩn 27 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………… … 30 5.1 Kết luận…… 30 5.2 Kiến nghị…… 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………… ………… ……… …… 31 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-DCP 2,4- dichlorophenol ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BVTV Bảo vệ thực vật ctv Cộng tác viên ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long iv Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 EPA Environment Protection Agency FAO Food and Agriculture Organization HPK Histidine protein kinase MCP Methyl-accepting chemotaxis protein OD Optical density RR Response regulator TSA Trypticase Soy Broth with agar TSB Trypticase Soy Broth DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Các dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D phân lập đất lúa tỉnh Sóc Trăng Tiền Giang………………………… …… ………………….15 Bảng Khoảng cách hóa hướng động theo 2,4-D tạo sinh khối năm dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang………… 21 v Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Bảng Khoảng cách hóa hướng động theo 2,4-D tạo sinh khối năm dòng vi khuẩn phân lập Sóc Trăng …………… 24 DANH MỤC HÌNH Trang Hình Cơng thức cấu tạo 2,4D……………………………………………………6 Hình Cấu tạo chiên mao Escherichia coli Hình Hệ thống dẫn truyền tín hiệu hóa hướng động Escherichia coli 11 vi Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Hình Thí nghiệm khảo sát hóa hướng động ……… 16 Hình Hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang 19 Hình Hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Sóc Trăng 20 Hình Hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang sau ngày thí nghiệm 22 Hình Khả hóa hướng động theo 2,4-D năm dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang 23 Hình Hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Sóc Trăng sau ngày thí nghiệm 24 Hình 10 Khả hóa hướng động theo 2,4-D năm dòng vi khuẩn phân lập Sóc Trăng 25 Hình 11 Khả hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang Sóc Trăng 26 Hình 12 Khả hóa hướng động phân hủy 2,4-D dòng vi khuẩn…… …………………………… .…….…27 TĨM LƯỢC Thí nghiệm chứng minh khả hóa hướng động dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D phân lập Tiền Giang Sóc Trăng mơi trường khống tối thiểu (0.45 % agar) có bổ sung 2,4-D nguồn cacbon cho thấy: tất dòng vi khuẩn có khả hóa hướng động theo 2,4-D Điều vii Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Aaron M J Law and Michael D Aitken, 2003 Bacterial Chemotaxis to Naphthalene Desorbing from a Nonaqueous Liquid Appl Environ Microbiol 10, pp 5968-5973 Anand, G S., Goudreau, P N & Stock, A M, 1998 Activation of methylesterase CheB: evidence of a dual role for the regulatory domain Biochemistry 37, pp 14038–14047 Anonymous, 1996, 1997 Statistical Data of Agriculture, Forestry and Fishery, 1985–1995 Statistical Publishing House, Hanoi Berg, H C, 2003 The rotary motor of bacterial flagella Annu Rev Biochem 72, pp.19–54 Charles JM, Hanley TR Jr., Wilson RD, van Ravenzwaay B, Bus JS, 2001 Developmental toxicity studies in rats and rabbits on 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and its forms Toxicological Sciences 60, pp.121-131 Chinalia F A., Regali-Seleghin Mirna Helena, Correa Elisete Marcia, 2007 2,4-D Toxicity: Cause, Effect and Control Danilo, Rodrigo De la Iglesia, Dietmar H Pieper& Bernardo Gonz ´ alez, 2008 Metabolic reconstruction of aromatic compounds degradationfrom 68, pp 968-972 Dung N H and Dung T T T., 1999 Economic and health consequences of pesticide use in paddy production in Mekong Delta, Viet Nam, Research Reports Environmental Protection Agency Pesticide Fact sheet Number, 1988 94 (2) 31 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 10 FAO, 2004 FAO- STAT Statistics 2012 downloaded for Vietnam http://apps.fao.org/default.jsp) 11 Fernando P Carvalho, J.P Villeneuve , C Cattini, I Tolosa , Thuan D D., Nhan D D., 2008 Agrochemical and polychlorobyphenyl (PCB) residues in the Mekong River delta, Vietnam Marine Pollution Bulletin 56, pp 1476–1485 12 Fishel, F.M, 2007 Pesticide use trends in the U.S.: Global Comparision 13 Grimm, A.C., and Harwood, C.S., 1997 Chemotaxis of Pseudomonas spp to the polyaromatic hydrocarbon naphthalene Appl Environ Microbiol 63, pp 4111-4115 14 Grimm, A.C., and Harwood, C.S., 1999 NahY, a catabolic plasmidencoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene J Bacteriol 181, pp 3310-3316 15 Harayama, S., Kok M., and E Neidle L., 1992 Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases Annu Rev Microbiol 46, pp 565-602 16 Harwood, C S., Parales R E., and Dispensa M., 1990 Chemotaxis of Pseudomonas putida toward chlorinated benzoates Appl Environ Microbiol 42, pp 263-287 17 Hawkins, A C., and Harwood C S., 2002 Chemotaxis of Ralstonia eutropha JMP123(pJP4) to the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate Appl Environ Microbiol 68, pp 968-972 18 Heong, K.L., Escalada M M and Mai.V., 1994 Analysis insecticide use in rice; Case studies in the philippnes and Viet Nam Internetional Journal of Pest manage 40 (2), pp 173-78 19 Hess, J F., Oosawa, K., Kaplan, N & Simon, M I., 1988 Phosphorylation of three proteins in the signalling pathway of bacterial chemotaxis Cell 53, pp 79–87 20 Homma, M., Oota H., Kojima S., Kawagishi, I , and Imae Y., 1996 Chemotactic response to an attractant and a repellent by the polar and lateral flagellar systems of Vibrio alginolyticus Microbiology 142, pp 2777-2783 House, Hanoi 32 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 21 Huong Nguyen L , Itod K, 2012 and Suyama K., 2008 2,4- Diclophenoxylacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-Triclophenoxylacetic acid (2,4,5-T) – degrading bacterial community in Vietnamese Soil- Water suspension during enrichment process Microbes and Environment 23 (3) pp 142-148 22 Huong N L , Itoh K , Suyama and K., 2007 2,4-Diclophenoxylacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-Triclophenoxylacetic acid (2,4,5-T) – degrading bacterial community in Vietnamese soil, Microbes and Environment 23 (2), pp 243-256 23 Itoh K., Tashiro, K Uobe, Kamagata Y., Suyama K and Yamamoto H., 2004 Root nodule Bradyhizobium spp, Habor tfdAα and cadA, homologous with gene encoding 2,4-Dichorophenoxyacetic acid- degrading protein Appl Environ Microbiol 70, pp 2110-2118 24 Kim, H & Farrand, S K., 1998 Opine catabolic loci from Agrobacterium plasmids confer chemotaxis to their cognate substrates Mol Plant Microbe Interact 11, pp 131–143 25 Marx, R B., and Aitken M D., 2000 Bacterial chemotaxis enhances naphthalene degradation in a heterogeneous aqueous system Environ Sci Technol 34, pp 3379-3383 26 McEvoy M M., Bren A., Eisenbach M and Dahlquist F.W, 1999 Indentification of the binding interacts on CheY for two of targets, the phosphotase CheZ and the flagellar switch protein FliM J Mol Biol 289, pp 1423-1433 27 Ortega-Calvo, J.J., Marchenko, A.I., Vorobyov, A.V., and Borovick, R.V, 2003 Chemotaxis in polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from coal-tar- and oil-polluted rhizospheres FEMS Microbiol Ecol 44, pp 373-381 28 Pandey G and Jain R K., 2002 Bacterial Chemotaxis toward Environmental Pollutants: Role in Bioremediation Environ Microbiol December.12, pp 5789-5795 29 Parales, R E., J L Ditty, and C S Harwood, 2000 Toluene-degrading bacteria are chemotactic towards the environmental pollutants benzene, toluene, and trichloroethylene Appl Environ Microbiol 66, pp 4098-4104 33 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 30 Parales, R.E., and Harwood, C.S., 2002 Bacterial chemotaxis to pollutants and plant-derived aromatic molecules Curr Opin Microbiol 5, pp 266-273 31 Pfeffer, W, 1883 Locomotorische richtungsbewegungen durch chemische rieze Ber Deutsch Bot Ges 1, pp 524-533 32 Pittman, M S., Goodwin, M and Kelly, D J., 2001 Chemotaxis in the human gastric pathogen Helicobacter pylori: different roles for CheW and the three CheV paralogues, and evidence for CheV2 phosphorylation Microbiology 147, pp 2493–2504 33 Reinke, W., and Knackmuss, H-J., 1988 Microbial degradation of haloaromatics Ann Rev Microbiol 42, pp 263-288 34 Top, E M., Holben W E and Forney L.J., 1995 Characterzition of Diverse 2,4-Dichorophenoxyacetic acid-degrative Plasmid isolated from soil by Complementation, Applied and Environmental microbiology 61 (5), pp 16911698 35 Rodrigues, B.N.; Almeida, F.S., 2005 Guia de herbicidas Grafmarke.5 ed Londrina, PR 36 Schiffmann, E., Corcoran B A., and Wahl S M., 1975 NFormylmethionine peptides as chemoattractants for leucocytes Proc Natl Acad Sci USA 72, pp.1059-1062 37 Silva T M., Stets M I., Mazzetto1A M.,; Andrade1F D., Pileggi S A V., Fávero P.R., Cantú M D.,Carrilho E., Carneiro P I.B., Pileggi M., 2007 Degradation of 2,4-D herbicide by microorganisms isolated from brazilian contaminated soil brazilian journal of microbiology 38, pp 522-525 38 Thomson, R., Pickup, R., and Porter, J., 2001 A novel method for the isolation of motile bacteria using gradient culture systems J Microbiol Meth 46 (2001), pp 141-147 39 Toker, A S & Macnab, R M, 1997 Distinct regions of bacterial flagellar switch protein FliM interact with FliG, FliN and CheY.J Mol Biol 273, pp 623–634 34 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 40 Wadhams, G.H and 2012 Armitage, J P, 2004 Making sense of it all: Bacterial chemotaxis Nature 5, pp.1024-1037 41 Welch, M., Oosawa, K., Aizawa, S.-I & Eisenbach, M, 1993 Phosphorylation-dependent binding of a signal molecule to the flagellar switch of bacteria Proc Natl Acad Sci USA 90, pp 8787–8791 42 Yoriko Naoto, Ogawa, Takeshi Fujii, Kazuo Sugahar, Kiyotaka Miyashita, 1999 2,4-Dichlophenoxyacetic acid-degrading genes from bacteria isolated from soil in Japan: Spread of Burkhoderia RASC-type degrading genes harbored on large plasmid pp 205-209 TIẾNG VIỆT 43 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, 2009 Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội 44 Hà Thị Hiến, 2003 Các biện pháp phòng trừ bệnh, cỏ dại NXB văn hóa dân tộc, Hà Nội 45 Nguyễn Thị Phi Oanh, Hứa Văn Ủ Dirk Springael, 2011 Vi khuẩn phân hủy 2,4-D đất lúa Ở Tiền Giang Sóc Trăng Tap chí khoa học Đai học cần thơ 46 Nguyễn Bảo Tồn, 2010 Giáo trình nuôi cấy mô thực vật Tủ sách Đại học Cần Thơ 47 Mai Thanh Truyết, 2001 Dioxin chất độc màu da cam, Hội khoa học kỹ thuật Việt Nam 48 Hứa văn Ủ, 2010 Phân lập dòng vi khuẩn có khả phân hủy 2,4D từ vùng đất lúa nhiểm 2,4-D tỉnh Sóc Trăng Tiền Giang Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Sinh thái học Đại Học Cần Thơ TRANG WEB 49 http://aem.asm.org/cgi/content/full/69/10/5968, 15/10/2011 50 http://aem.asm.org/content/68/12/5789.full.pdf+html,15/7/2011 35 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 51 http://ctu.edu.vn/colleges/tech/bomon/maynn/noi%20dung%20cua%20w eb%20mnn&cnsth/Nghien%20cuu%20khoa%20hoc/Cay%2001/Cay01%20trang 1.htm, 20/5/2012 52 http://diendankienthuc.net/diendan/dia-ly-thcs/65259-vung-dong-bangsong-cuu-long.html,19/5/2012 53 http://phanbonvisinh.blogspot.com/2012/01/su-dựng-che-pham-sinh-họctrong-trong.html, 19/2/2012 54 http://umbbd.msi.umn.edu/2,4-d/2,4-d_map.html, 19/9/2011 55 http://www.angimex.com.vn/vi/2012/03/việt-nam-dãn-dàu-thé-giới-vèxuát-khảu-gạo-trong-nam-2012/, 20/5/2012 56 http://www.alanwood.net/pesticides/2,4-d.html, 20/4/2012 57 http://www.baovethucvat.com/tin-tuc/2-thuoc-bao-ve-thuc-vat-gay-tachai-den-suc-khoe-nhu-the-nao.html, 20/4/2012 58 http://www.eoearth.org/article/Herbicide?topic=49494, 20/7/2011 59 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC126733/, 20/7/2011 60 http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.002004 9, 20/7/2011 61 http://www.nhandan.com.vn/cmlink/nhandandientu/thoisu/khoahọc/khoa-h-c/t-ng-c-ng-qu-n-l-vi-c-s-d-ng-thu-c-b-o-v-th-c-v-t-1.335200?mode, 12/3/2012 62 http://vietbao.vn/Xa-hoi, 13/10/2012 63 http://www.uprm.edu/biology/profs/rios/chemotaxis2.pdf E.coli, 20/8/2011 36 chemotaxis Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần, hóa chất sử dụng cho loại mơi trường dùng thí nghiệm 1.1 Mơi trường minimal media (MMO): mơi trường khống tối thiểu gồm năm loại stock với thành phần sau: Stock A: (khử trùng autoclave) NA2 HPO4 141,96 g (NA2HPO4 7H2O 177,99 g) K2PO4 136,09 g mQ-H2O 1000 ml Stock B: (khử trùng autoclave) (NH4)2SO4 100 g mQ-H2O 1000 ml Stock C: (khử trùng autoclave) MgSO4.7H2O 19,7 g mQ-H2O 1000 ml Stock D: (khử trùng autoclave) CaCl2.2H2O mQ-H2O 1,15 g 1000 ml Stock E: (khử trùng màng lọc vơ trùng đường kính 0.22m) Na2-EDTA 0,65 g (Titriplex = Na2-EDTA 2H2O) FeSO4.7H2O 0.55 g MnSO4.H2O 0,34 g H3BO4 0,232 g ZnSO4.7H2O 0.23 g CuSO4 0.048 g Co(NO3)2.7H2O 0.047 g (NH4)6MO7O24 4H2O 0,025 g 37 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học mQ-H2O 2012 1000 ml Cách pha môi trường MMO (công thức cho 1000 ml) + Cho 972 ml nước cất vào chai nấp xanh + Thêm 10 ml stock A + Khử trùng nhiệt ướt 121 0C 21 phút + Để nguội 500C cho ml stock B; 5ml loại stock C, D, E 1.2 Môi trường TSB:( khử trùng autoclave) TSB 30 g mQ-H2O 1000 ml 1.3 Môi trường TSA: mơi trường TSB có bổ sung agar (15 g/l) 38 Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học 2012 Phụ lục Kết thống kê kiểm định khác biệt khả hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang Kết thống kê cho thấy tốc độ hóa hướng động theo 2,4-D dòng vi khuẩn phân lập Tiền Giang khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (giá trị P: 0.000