ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ Ngành: Hóa phân tích Mã số nghành: 62 44 29 01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Tp Hồ Chí Minh - 2017 Cơng trình hồn thành tại: Bộ mơn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: HDC: GS.TS CHU PHẠM NGỌC SƠN HDP: GS.TS TRẦN LINH THƯỚC Phản biện 1: PGS.TS Hà Diệu Ly Phản biện 2: TS Đặng Chí Hiền Phản biện 3: TS Đặng Thanh Dũng Phản biện độc lập 1: PGS.TS Hà Diệu Ly Phản biện độc lập 2: TS Đặng Thanh Dũng Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM MỞ ĐẦU Chloramphenicol (CAP) kháng sinh thuộc nhóm 2A, gây bệnh suy tủy, tác nhân dẫn đến ung thư người Hiện hầu hết quốc gia giới xếp CAP loại kháng sinh khơng cho phép có mặt thực phẩm hàm lượng Hiện CAP tồn dư loại thực phẩm khác cá, thịt, tôm, mật ong, thức ăn chăn ni… Nó khơng có sản phẩm sử dụng nước, mà diện sản phẩm xuất khẩu, làm ảnh hưởng đến q trình xuất mặt hàng nơng, lâm sản, đặc biệt mặt hàng hải sản mật ong Việc xác định CAP kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ gặp nhiều khó khăn cho kết thiếu xác mẫu có chứa nhiều tạp chất thức ăn chăn nuôi hay chứa hàm lượng đường cao mật ong Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ” nhằm mục tiêu sau: (1) Chế tạo cột sắc ký lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC-CAP) dùng cho bước tách chiết CAP từ mẫu thử; (2) Đánh giá qui trình phân tích CAP kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ sử dụng cột IAC-CAP trình xử lý mẫu Kết thu luận án tiền đề sử dụng cột IAC-CAP công tác giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm kiểm tra chất lượng thực phẩm xuất nhập Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chlorramphenicol (CAP) 1.1.1 Tổng quan kháng sinh CAP CAP sinh từ vi khuẩn Streptomyces venezuelae CAP có tác dụng điều trị bệnh vi khuẩn gây Mycoplasmas, Leptospira, Spirochaetes, Rickettsiae, Chlamydiae, Treponema pallidum, Borrelia, Pseudomonas pseudomallei, Actinomyces, Haemophilus influenza, Streptococus pneumonia, Neisseria meningitides 1.1.2 Độc tính CAP CAP có liên quan tới bệnh suy tủy xương tác nhân gây số bệnh ung thư (FAO, WHO, IARC) CAP xếp loại tác nhân gây ung thư với người thuộc nhóm 2A 1.2 Dư lượng kháng sinh thực phẩm 1.2.1 Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi Tại Việt nam 100% sở chăn nuôi nuôi trồng thủy sản cho thấy có sử dụng kháng sinh có nhiều kháng sinh cấm (CAP, nitrofuran) 1.2.2 Tình hình tồn dư kháng sinh thực phẩm Nhiều mẫu thực phẩm nước xuất có chứa tồn dư kháng sinh thuộc nhóm tetracycline, sulfonamide, quinolone kháng sinh cấm nitrofuran CAP 1.2.3 Ảnh hưởng sức khỏe người sử dụng Tồn dư kháng sinh thực phẩm tác nhân gây ung thư, gây đột biến gen, gây bệnh máu người sử dụng Gây tượng kháng thuốc chủng vi sinh vật gây bệnh ô nhiễm môi trường 1.2.4 Qui định tồn dư kháng sinh thực phẩm Kháng sinh tồn dư thực phẩm quan kiểm tra thực phẩm chia làm 02 nhóm A B Nhóm A kháng sinh khơng phép có mặt thực phẩm hàm lượng (zero tolerance), nhóm B kháng sinh phép có mặt thực phẩm không giới hạn qui định (MRL) Chloraphenicol kháng sinh khơng phép có thực phẩm hàm lượng 1.2.5 Kiểm soát tồn dư kháng sinh thực phẩm Kiểm soát dư lượng kháng sinh thực phẩm, chăn nuôi phương pháp phân tích có độ tin cậy cao 1.3 Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh thực phẩm 1.3.1 Xử lý mẫu Quá trình xử lý mẫu có hai giai đoạn: chiết kháng sinh khỏi mẫu loại bỏ tạp chất 1.3.2 Xác nhận diện kháng sinh Kháng sinh xác định 02 nhóm phương pháp: phương pháp sàng lọc ức chế vi sinh vật, miễn dịch gắn enzyme (ELISA), sắc ký mỏng (TLC), sắc ký khí, sắc ký lỏng; phương pháp xác nhận (phương pháp tiêu chuẩn) phương pháp sắc ký ghép khối phổ 1.4 Phương pháp xác định tồn dư CAP thực phẩm 14.1 Tách chiết làm mẫu Quá trình tách CAP từ mẫu thường thực với dung mơi ethyl acetate, dung dịch muối lỗng acetonitrile, chất béo loại bỏ cách rửa với n-hexan làm cột tách pha rắn Các cột tách pha rắn thường sử dụng bao gồm cột pha ngược, hay kết hợp cột pha đảo với cột pha thường trao đổi cation 1.4.2 Xác nhận diện CAP Phương pháp sàng lọc như: dựa ức chế vi khuẩn, hóa miễn dịch, xác định trực tiếp CAP phương pháp điện hóa, sắc ký khí hay sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp xác nhận phương pháp cung cấp rõ ràng tiêu chuẩn nhận dạng định lượng chất phân tích Để xác nhận CAP, phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ (MS) phù hợp Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để xác định CAP thường sử dụng mảnh ion mẹ với m/z 321 hai mảnh ion mảnh m/z 257 m/z 152 4.3 Một số tồn phương pháp phân tích CAP sắc ký lỏng ghép khối phổ Các mẫu mật ong, thức ăn chăn ni xác định CAP gặp khó khăn xác định CAP hiệu ứng mẫu Các hiệu ứng gây tượng suy giảm ion nhiều làm sai lệch kết phân tích xác định Giới hạn phát mẫu thường cao, không đạt tiêu chuẩn qui định Vì phải làm giàu nhiều lần gia tăng hàm lượng tạp chất dịch mẫu xử lý dẫn đến làm giảm khả hoạt động thiết bị phân tích (LC-MS/MS) 1.5 Chế tạo cột sắc ký lực miễn dịch dùng cho bước làm CAP Để loại bỏ hầu hết tác nhân gây nhiễu chiết với CAP từ mẫu, phải tăng tính chọn lọc bước làm CAP Cột sắc ký lực miễn dịch chuyên biệt (IAC – CAP) giúp đạt mục đích Để chế tạo cột IAC - CAP việc tạo kháng thể đặc hiệu với CAP Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm kháng ngun có tính sinh miễn dịch CAP để tạo kháng thể kháng CAP Sau thu kháng thể tinh chế Kháng thể kháng CAP tinh chế gắn lên pha rắn để tạo cột Để chế tạo cột IAC - CAP việc tạo kháng thể đặc hiệu với CAP Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm kháng ngun có tính sinh miễn dịch CAP để tạo kháng thể kháng CAP Sau thu kháng thể tinh chế Kháng thể kháng CAP tinh chế gắn lên pha rắn để tạo cột sắc ký lực miễn dịch CAP (IAC – CAP) 1.5.1 Tạo kháng ngun cộng hợp CAP - Protein có tính sinh miễn dịch Chloramphenicl trọng lượng phân tử thấp (