BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI VÀ TINH SẠCH NGUYỄN MINH THÀNH HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI VÀ TINH SẠCH NGUYỄN MINH THÀNH CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HOÀNG DƢƠNG NCS NGUYỄN PHƢƠNG HOA HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời cho xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hoàng Dƣơng, NCS Nguyễn Phƣơng Hoa - Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam - ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo suốt thời gian qua để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn chân thành tới cô chú, anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu thầy cô khoa Sau Đại học, Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho suốt hai năm qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân tồn thể bạn bè, ln quan tâm, ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập tiến hành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn Minh Thành LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn thầy, cô hƣớng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình Tác giả luận văn ( ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Minh Thành MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG 1.1.1 Lịch sử phát bệnh .3 1.1.2 Phân bố bệnh giới Việt Nam 1.1.3 Đặc điểm dịch tễ học .8 1.2 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG .12 1.2.1 Tổng quan virus Lở mồm long móng .12 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus Lở mồm long móng 16 1.2.3 Cấu trúc gen virus LMLM 19 1.3 HỆ BIỂU HIỆN E COLI 20 1.3.1 Đại cƣơng E.coli 20 1.3.2 Chủng biểu E coli BL21(DE3) 21 1.3.3 Vector biểu pET-SUMO 22 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Thiết bị hóa chất 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Phƣơng pháp điện di gel agarose .25 2.2.2 Phƣơng pháp khuếch đại gen PCR (Polymerase Chain Reaction) 25 2.2.3 Phƣơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM4-TOPO 26 2.2.4 Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 27 2.2.5 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid .28 2.2.6 Phƣơng pháp cắt DNA plasmid enzym giới hạn .28 2.2.7 Phƣơng pháp tinh DNA từ gel agarose 29 2.2.8 Xác định trình tự gene máy tự động 30 2.2.9 Cắt vector pET-SUMO enzym giới hạn 30 2.2.10 Phƣơng pháp gel (Cắt thu nhận băng AND từ gel agarose ) 31 2.2.11 Phƣơng pháp tạo vector tái tổ hợp 31 2.2.12 Biểu protein VP1 tái tổ hợp chủng E Coli BL21(DE3) .32 2.2.13 Phƣơng pháp điện di protein gel polyacrylamide 33 2.2.14 Phƣơng pháp Western Blot .35 2.2.15 Phƣơng pháp tinh protein tái tổ hợp 37 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ 39 3.1 TÁCH DÕNG ĐOẠN GEN VP1 VÀ GIẢI TRÌNH TỰ .39 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET- SUMO MANG GEN VP1 43 3.3 BIỂU HIỆN VECTOR PET-SUMO-VP1 TRONG TẾ BÀO E.COLI BL21 (DE3) .47 3.4 TINH SẠCH PROTEIN VP1 BẰNG ĐUÔI HIS-TAG 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin BP( bp) : Cặp Bazơ DNA maker : Thang DNA chuẩn DNA : Axit Deoxyribonucleic E.Coli : Escherichia Coli EDTA : Ethylen Diamine Tetra acetic Acid EtBt : Ethidium Bromide EtBt : Ethidium Bromide LB : Môi trƣờng Lauria Betani LMLM : Bệnh lở mồm long móng OD : Optical Density (mật độ quang học) OIE : Office International Epidemiology (Tổ chức dịch tễ giới) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RT-PCR : Reverse transcriptase-PCR (Kỹ thuật phối hợp khuyếch đại trình tự RNA) SAT : South Africa Territories SDS : Sodium dodecyl sulphate TAE : Tris – Acetate – EDTA Taq polymerase : Polymerase Thermus aquaticus v/ph : vòng / phút WHO : Who Health Organization (Tổ chức Y tế giới) IRES : International Ribosome Entry Site DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004 .8 Hình 1.1: Friedrich Loeffler Hình 1.2: Các đợt dịch LMLM năm 2003 Hình 1.3: Bản đồ phân bố type LMLM giới Hình 1.4 : Triệu chứng bệnh LMLM 12 Hình 1.5:Hình ảnh virus Lở mồm long móng 13 Hình 1.6: Hình thái virus LMLM 17 Hình 1.7: Cấu trúc vỏ ngồi cuả virus LMLM 18 Hình 1.8: Hệ gen mã hóa VP1 19 Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR gen VP1 cặp mồi VP1-F/R 40 Hình 3.2: Đĩa cấy tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1 41 Hình 3.3: Điện di đồ kiểm tra plasmid mang gen VP1 .41 Hình 3.4: Cắt kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp mang gen VP1 EcoRI 42 Hình 3.5:Kết so sánh trình tự gene mã hóa VP1 virus gây bệnh LMLM Việt Nam giới chƣơng trình Blast 43 Hình 3.6: Sản phẩm cắt gel vector pET- SUMO 43 Hình 3.7:Kết PCR đoạn gen VP1 tạo đầu so le 44 Hình 3.8: Kiểm tra dòng khuẩn lạc phản ứng PCR 45 Hình 3.9: Sản phẩm tách tinh plasmid khuẩn lạc số 1,2,3 .46 Hình 3.10 : Biểu gen VP1 18oC thu mẫu sau 3h,6h, 9h cảm ứng .47 Hình 3.11 : Kết kiểm tra lƣợng protein VP1 tạo biểu 48 18 oC, 20 oC 25 oC 48 Hình 3.12: Điện di đồ protein VP1 sau tinh .49 MỞ ĐẦU Những năm gần đây, chăn ni ln đóng vai trò quan trọng trì tốc độ tăng trƣởng lĩnh vực nông nghiệp với tốc độ 5-7%/năm so với 2-2,5% /năm ngành trồng trọt Chăn nuôi, ngành quan trọng để chuyển đổi cấu thúc đẩy tăng trƣởng nông nghiệp, riêng ngành chăn ni chiếm khoảng ¼ GDP sản xuất nơng nghiệp Theo Tổng Cục Thống Kê tính đến 7/2013 giá trị sản xuất ngành chăn nuôi (theo giá so sánh 2010) tăng 4,1% so với kỳ năm 2012, nhiên tổng số đàn trâu nƣớc lại giảm 2,5%, đàn bò giảm 3%, đàn lợn giảm 1,5%, gia cầm giảm 2% so với kỳ năm 2012 mà nguyên nhân đe dọa dịch bệnh ngày tăng, đặc biệt bệnh lở mồm long móng (LMLM ) Việc phòng chống bệnh LMLM nhiều nƣớc trở thành vấn đề trọng điểm quốc gia, kinh tế thị trƣờng, việc có hay khơng có bệnh LMLM sản xuất, chăn ni tiêu chí quan hệ buôn bán quốc tế quốc gia sử dụng nhƣ vũ khí thƣơng mại Thời gian gần đây, tình hình diễn biến dịch bệnh LMLM xảy nƣớc giới nói chung Việt Nam nói riêng ngày trở nên phức tạp khó kiểm sốt Ở Việt Nam, mục tiêu quan trọng mà ngành thú y phấn đấu thực là: khống chế số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gia súc, mà đặc biệt bệnh LMLM Thế kỷ XXI kỷ công nghệ sinh học với phát triển mạnh mẽ kỹ thuật sinh học phân tử mở triển vọng nghiên cứu vô to lớn có thành tựu đáng kể việc phát cấu trúc phân tử virus LMLM Do việc nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử virus LMLM thực cần thiết khơng cho nghiên cứu chẩn đốn xác bệnh nhƣ nghiên cứu sản xuất loại vắc-xin hệ phù hợp với virus LMLM lƣu hành Việt Nam mà cho phép xác định mức độ tiến hóa virus đƣơng nhiễm với chủng trƣớc Việt Nam giới Có type virus gây bệnh LMLM: O, A, C, Asia1, SAT1,SAT2 SAT3 với 70 subtype Ở Việt Nam, phát type O; type A Asia nhƣng thƣờng gặp type O Các type lở mồm long móng lại chia thành nhiều biến chủng (subtype) khác nhau; ví dụ type A có A1, A2, A3, type O có O1, O2, O3 Do có nhiều type type khơng gây miễn dịch chéo cho nên vụ dịch trâu bò mắc bệnh nhiều lần với subtype khác Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi capsome, capsome có loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) VP1 có vai trò quan trọng việc gây bệnh, nhƣ loại kháng nguyên tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM Trên sở chúng tơi tiến hành thực đề tài “Thiết kế, biểu đoạn gen VP1 virus Lở mồm long móng Type O E.coli tinh sạch.” với hi vọng kết thu đƣợc bƣớc đầu cung cấp sở khoa học cho đề tài“Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng giả virus (VLP) để sản xuất vắc xin lở mồm long móng (LMLM) type O” Q trình mục đích đề tài nghiên cứu chúng tơi nhƣ sau: +/ Tách dòng gen mã hóa protein vỏ VP1 virus LMLM type O Việt Nam +/ Biểu tinh gen VP1 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O Việt Nam để phục vụ cho trình nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng giả virus để sản xuất vắc xin lở mồm long móng type O Việt Nam Đề tài đƣợc thực Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR gen VP1 cặp mồi VP1-F/R M: Maker 1kb invitrogen 1: Gen VP1 có kích thước 639bp  Gắn gen VP1 vào vector tách dòng pCRTM4-TOPO Sản phẩm PCR gen VP1 đƣợc gắn trực tiếp vào vector pCRTM4-TOPO nhằm mục đích tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gene mã hóa kháng ngun cần tách dòng Phản ứng đƣợc thực nhiệt độ 22oC/ 30 phút Sau gắn sản phẩm PCR vào vector pCRTM4-TOPO tiến hành biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli chủng DH5α Nhờ máy tổng hợp tế bào vi khuẩn, plamid tái tổ hợp đƣợc tạo với số lƣợng lớn Sau biến nạp, dịch tế bào đƣợc cấy trải môi trƣờng thạch LB có bổ sung Amp (100μg/ml); X-gal (40mg/ml) chất cảm ứng IPTG 1mM Trong môi trƣờng chọn lọc có chứa chất kháng sinh nên có tế bào chứa vector tái tổ hợp có khả mọc phát triển Kết đĩa thạch xuất khuẩn lạc xanh, trắng mọc riêng rẽ 40 Hình 3.2: Đĩa cấy tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1  Tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli Nhặt ngẫu nhiên khuẩn lạc xanh, khuẩn lạc trắng tách thu plasmid theo kit invitrogen, sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% nhƣ hình 3.3 Hình 3.3: Điện di đồ kiểm tra plasmid mang gen VP1 Kết điện di kiểm tra plasmid mang gen VP1; đƣờng chạy 1, 2, khuẩn lạc trắng đƣợc cho mang gen, chạy chậm đƣờng chạy X, có khả chúng tơi tách dòng thành cơng gen VP1 Để khẳng định cách chắn ADN plamsid dòng 1, 2, mang gene mã hóa kháng ngun VP1 chúng tơi tiến hành kiểm tra plasmids tái tổ hợp 41 enzyme giới hạn EcoR I Kết đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1%, hình 3.4 M Hình 3.4: Cắt kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp mang gen VP1 EcoRI Đường chạy 1: Thang ADN chuẩn (Fermentas) Dựa vào kết điện di, nhận thấy ADN plasmid sau cắt enzyme giới hạn, xuất băng gene mã hóa kháng nguyên VP1 khoảng 650bp (nằm băng 500 bp băng 750bp) (Hình 3.4) băng kích thƣớc vector tách dòng (gần 4000 bp) Điều chứng tỏ chúng tơi gắn thành cơng sản phẩm PCR gen VP1 vào vector tách dòng ADN plasmid mang gene mã hóa kháng nguyên VP1 virus LMLM đƣợc tinh sử dụng để giải trình tự gene Kết giải trình tự * Trình tự gene mã hóa kháng nguyên VP1 virus LMLM lƣu hành Việt Nam nhƣ sau: Kết so sánh ngân hàng gen quốc tế: 42 Hình 3.5:Kết so sánh trình tự gene mã hóa VP1 virus gây bệnh LMLM Việt Nam giới chương trình Blast Kết giải trình tự gen cho thấy, gene mã hóa kháng nguyên VP1 virus LMLM có kích thƣớc dài 639 bp Khi so sánh trình tự với trình tự đƣợc đăng ký ngân hàng gene quốc tế phần mềm Blast, chúng tơi thấy có độ tƣơng đồng từ 93 đến 97% so với số trình tự đƣợc cơng bố ngân hàng gen 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET- SUMO MANG GEN VP1  Cắt vector pET-SUMO enzym giới hạn tinh A B Hình 3.6: Sản phẩm cắt gel vector pET- SUMO A) Sản phẩm cắt vector pET-SUMO enzym giới hạn XhoI SfoI B) Kết gel tinh vector sau cắt enzym XhoI SfoI 43 Kết cắt enzyme giới hạn cho thấy sản phẩm cắt băng riêng biệt chứng tỏ vector pET-SUMO đƣợc cắt mở vòng Tinh sản phẩm cắt Plasmid kit gen invitrogen để thu vector pET-SUMO mở vòng sãn sàng cho việc gắn gen VP1  Khuếch đại gen VP1 cặp mồi biểu Dựa vào khuôn đoạn gen VP1, đƣợc tách dòng, chúng tơi tiến hành PCR cho đoạn gen hai ống riêng biệt có chung primer xuôi VP1-F/R1 VP1F/R2 750bp Sp PCR gen VP1 500bp Hình 3.7:Kết PCR đoạn gen VP1 tạo đầu so le Sản phẩm PCR cặp mồi VP1-F/R1 đoạn gen VP1 Sản phẩm PCR cặp mồi VP1-F/R2 đoạn gen VP1 M: Thang ADN chuẩn Sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 639 bp tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen VP1 Ở primer ngƣợc R1 R2 khác tƣơng ứng với trình tự cắt enzyme XhoI tạo Sự sai khác giúp cho việc sau trộn lẫn ống PCR biến tính – ghép nối lại tạo đƣợc đoạn gen VP1, có mang đầu sole tƣơng thích cho gắn vào vector cắt XhoI Phƣơng pháp giúp nối trực tiếp sản phẩm PCR vào vector mà không cần dùng enzyme giới hạn đạt hiệu cao 44  Gắn gen VP1 vào vector biểu pET-SUMO biến nạp vào tế bào E Coli Tiến hành ligation vector đƣợc mở vòng cắt enzym giới hạn sản phẩm PCR, sản phẩm ligation đƣợc biến nạp vào tế bào E coli khả biến phƣơng pháp sốc nhiệt 42oC, Cấy chải môi trƣờng LB đặc có bổ sung Kanamicine 30µg/ml ni cấy 37oC, khuẩn lạc đƣợc hình thành sau 24h  Kiểm tra dòng khuẩn lạc dƣơng tính phản ứng PCR Ba khuẩn lạc đƣợc chọn lọc ngẫu nhiên kiểm để tra phƣơng pháp PCR trực tiếp với cặp mồi VP1-F VP1-R Hình 3.8: Kiểm tra dòng khuẩn lạc phản ứng PCR 1,2,3: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạc ngẫu nhiên đĩa biến nạp gen VP1 M: maker 1kb Thu đƣợc kết dƣơng tính Kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng với độ dài gen VP1 639bp Điều tạm khẳng định gắn đƣợc gen VP1 vào vector biểu pET-SUMO Để khẳng định chắn gen VP1 đƣợc gắn vào vector pET-SUMO chiều, khung đọc Vector tái tổ hợp pET-SUMO mang gen VP1 đƣợc đọc trình tự 45 Tiến hành nhặt ni khuẩn lạc mơi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh kana 30µg/ ml tách thu plasmid theo kit Invitrogen Sản phẩm plasmid đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 1% hình 3.9 Hình 3.9: Sản phẩm tách tinh plasmid khuẩn lạc số 1,2,3 Plasmid đƣợc tách kit Invotrogen đọc trình tự phân tích phần mềm bioedit, gen VP1 có trình tự nhƣ sau  Trình tự đoạn gen VP1 thu nhận đƣợc sau xử lý phần mềm bioedit: ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCCGATCCCGTTACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGC 61 GAGACACAGGTCCGGAGACGCCAACACACGGATGTCTCTTTCATATTAGACAGATTTGTG 60 120 121 AAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCCGCGCACACC 180 281 TTGGTGGGAGCGCTCCTCCGCACTGCCACCTACTACTTCGCAGATTTAGAAGTGTCAGTG 240 241 AAACACGAGGGGAACCTCACCTGGGTCCCAAACGGGGCGCCTGAGACGGCGTTGGACAAC 300 301 GCACCGCACCGTGTTCTGGCTACTGTTTACAACGGGGGCTGTAGGTACGGCGCGAGCCCC 420 421 GTGACCAACGTGAGGGGTGACCTACAAGTGTTGACCCCGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCC 480 481 ACCTCCTTCAACTACGGTGCCATCAAAGCCACTCAGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATG 540 541 AAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCCATCCACCCGAGTGAAGCTAGA 600 601 CGCAAGCAAAAGATTGTGGCACCTGTGAAACAGCTTTTG 639 46 3.3 BIỂU HIỆN VECTOR PET-SUMO-VP1 TRONG TẾ BÀO E.COLI BL21 (DE3) Protein mã hóa gen VP1 protein vỏ có vai trò quan trọng việc gây bệnh, nhƣ loại kháng nguyên tạo kháng thể chống lại bệnh LMLM Vì thế, ngƣời ta tiến hành giải mã nucleotit phần tồn gen mã hố VP1 để phân chia chúng thành serotype Một protein đƣợc biểu có hoạt tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong yếu tố cần quan tâm để protein có hoạt tính nhiệt độ biểu Vi khảo sát điều kiện biểu chủng E coli BL21 (DE3) mang gen VP1 18oC, 25oC 30oC sau 6h thu mẫu, chạy điện di gel SDS-Page 12% (Hình 1) kDa M 75 63 48 35 25 20 17 11 Hình 3.10 : Biểu gen VP1 18oC thu mẫu sau 3h,6h, 9h cảm ứng 11M: Maker protein GangNam-Pink 1: Protein VP1 biểu 18 oC thu mẫu sau 3h cảm ứng IPTG 2: Không cảm ứng 3, 4: Cảm ứng biểu 18oC thu mẫu sau 6h, 9h cảm ứng IPTG 47 Kết biểu hình 3.10 cho thấy thời điểm thu mẫu cảm ứng biểu protein thấy xuất băng protein có kích thƣớc khoảng 24kDa cộng 15kDa protein SUMO-His-Tag Nhƣ sản phẩm protein tái tổ hợp loại tạo có kích thƣơc khoảng 39kDa Tuy nhiên đƣờng chạy số 3, nhiệt độ cảm ứng biểu 18oC, sau 6h thu mẫu cho lƣợng protein nhiều cho thấy khoảng thời gian thu mẫu để đạt lƣợng protein tối đa 6h  Khảo sát nhiệt độ thu mẫu để lượng protein tạo lớn Để đảm bảo protein tạo đặt hiệu cao, ngồi thời điểm thu mẫu, chúng tơi khảo sát nhiệt độ biểu protein VP1 Một yếu tố đáng ý để protein tạo có hoạt tính Vì chúng tơi biểu vactor pET-SUMO tái tổ hợp mang gen VP1 nhiệt độ 18oC, 20oC, 25oC Kết biểu chạy kiểm tra gen SDS-PAGE 12% hình 3.11 kDa M 75 75 63 48 35 25 20 17 11 Hình 3.11 : Kết kiểm tra lượng protein VP1 tạo biểu 18 oC, 20 oC 25 oC 1, 2, 3: Cảm ứng biểu thu protein sau 6h, o 4:18 Mẫu cảm Kết biểu protein C, không 20oC 25oứng C, thu mẫu sau cảm ứng 6h M: Maker protein GangNam-Pink 48 Hình 3.11 cho thấy 18oC sau 6h cảm ứng có biểu protein đích, thu mẫu cho lƣợng protein lớn Vậy thấy với điều kiện biểu 18oC sau 6h thu mẫu cho hàm lƣợng protein VP1 lớn 3.4 TINH SẠCH PROTEIN VP1 BẰNG ĐUÔI HIS-TAG Do protein VP1 đƣợc biểu chủ yếu nằm pha dịch, vậy, sau siêu âm phá màng tế bào để thu dịch chiết, ly tâm loại bỏ toàn phần xác tế bào cho pha dịch trực tiếp qua cột sắc ký lực NiNTA Do VP1 đƣợc biểu hệ thống vector biểu pET-SUMO nên protein tạo đƣợc dung hợp với trình tự gồm amino axit histidine Trình tự His-tag giúp protein tái tổ hợp kết bám vào cột sắc ký, protein khác bị loại bỏ dung dịch rửa chứa Imidazol 30 mM Sau rửa protein tạo liên kết không đặc hiệu với cột sắc ký, protein VP1 đƣợc đẩy theo phân đoạn dung dịch đệm chứa Imidazol 250 mM Kết thu đƣợc điện di SDS-PAGE cho thấy protein VP1 tái tổ hợp đƣợc thu lại dạng tinh sạch, có kích thƣớc 39 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc tính tốn lý thuyết Hình 3.12: Điện di đồ protein VP1 sau tinh 49 Để xác định protein, biểu tinh đƣợc protein dung hợp VP1/His-tag, tiến hành kĩ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blot), sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với nồng độ pha loãng 1:25000 Kết cho thấy, dịch chiết tế bào, chúng tơi thu đƣợc băng protein có kích thƣớc khoảng 39 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết protein VP1 SUMO/His-tag (hình 3.12) , chứng tỏ protein vỏ VP1 virus LMLM mã hóa gen VP1 đƣợc biểu thành công tế bào E.coli BL21 (DE3) 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Qua kết nghiên cứu đƣợc trình bày xin rút số kết luận nhƣ sau: +/ Đã tách dòng thành cơng gen mã hóa protein vỏ VP1 virus LMLM type O Việt Nam +/ Biểu thành công gen VP1 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O Việt Nam +/ Đã tinh đƣợc protein VP1 virus LMLM type O Việt Nam II Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu protein tái tổ hợp VP1 đƣợc tạo nhƣ cắt đuôi SUMO/His-Tag điều kiện để protein vỏ VP1 giữ đƣợc hoạt tính tốt thử đáp ứng miễn dịch protein VP1 đánh giá hoạt tính protein đích thu đƣợc 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Báo cáo tổng kết cơng tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2011 Đào Trọng Đạt (2000) Góp phần vào việc đấu tranh phòng chống bệnh lở mồm long móng Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (7): 6-7 Cao Thùy Chi: Mô tả cấu trúc virus lở mồm long móng – luận văn thạc sỹ Đai học Nông nghiệp Hà Nội 2006 Chiến lƣợc phát triển chăn ni đến năm 2020 Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt Quyết định số 10/2008/QĐ – TTg ngày 16/01/2008 Cục Thú y (2010) Báo cáo kết thực Chƣơng trình quốc gia khống chế toán bệnh LMLM giai đoạn I (2006-2010), đề xuất giai đoạn II (2011-2015) Cục Thú y (2011) Chƣơng trình quốc gia khống chế bệnh lở mồm long móng giai đoạn II (2011-2015) Cục Thú y (2012) http://dx.doi.org/10.3201/eid1803.110908 Hoàng Văn Nam, Văn Đăng Kỳ: Tình hình bệnh lở mồm long móng giới ( 1999 – 5/2000) – Tạp chí KHKT Thú y, tập VII, số – 2000 số chuyên đề bệnh lở mồm long móng ( Tr 99) Tài liệu tiếng Anh Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A I & Garland, A J (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease J Comp Pathol 129(1): 1-36 Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins Catalog nos 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 Baxt B, Donald O Morgan, Betty H Robertson, and Charles A Timone Epitopes on Foot-and-Mouth Disease Virus Outer Capsid Protein VP1 52 Involved in Neutralization and Cell Attachment J Virology, 1984, 51(2): 298-305 10 Cao Y, Pu Sun, Yuanfang Fu, Xingwen Bai, Feipen Tian, Xiangtao Liu, Zengjun Lu, Zaixin Liu (2010) Formation of virus-like particles from O-type foot-and-mouth disease virus in insect cells using codon-optimized synthetic genes Biotechnol Lett 32:1223 - 1229 DOI 10.1007/s10529-010-0295-8 11 Cao Y, Zengjun Lu, Jiachuan Sun, Xingwen Bai, Pu Sun, Huifang Bao, Yingli Chen, Jianhong Guo, Dong Li, Xiangtao Liu, Zaixin Liu (2009) Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot- and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs Veterinary Microbiology 137: 10–17doi:10.1016/j.vetmic.2008.12.007 12 Chien-Der Lee, Yao-Pei Yan, Shu-Mei Liang and Ting-Fang Wang (2009) Production of FMDV virus-like particles by a SUMO fusion protein approach in Escherichia coli Journal of Biomedical Science, 10.1186/14230127-16-69 13 Chunhe Guo, Chunhong Zhang, Hongyu Zheng, Yumao Huang (2013) Recombinant adenovirus expression of FMDV P1-2A and 3C protein and its immune response in mice Research in Veterinary Science 95 736–741 14 Chien Der Lee, Hui chien Sun, Su Ming Hu, Ching-Feng Chiu, Atthachai HomHuan, Shu-MeiLiang, Chihih-Hsiang Leng, and Ting-Fang Wang.( April 3, 2008) An improved SUMO fusion protein system for effective production of native proteins 15 Cocks, P., Abila, R., Bouchot, A., Benigno, C., Morzaria, S., Inthavong, P., Long, N.V., Luthi, N.B., Scoizet, A and Sieng, S (2009) Study on CrossBorder movement and market chains of large ruminants and pigs in the Greater Mekong SubRegion 16 Crisci Elisa , Juan Bárcena, María Montoya (2012) Virus-like particle-based vaccines for animal viral infections http://dx.doi.org/10.1016/j.immuno.2012.08.002 53 Immunologia 17 Goodwin S, Tobias J Tuthill, Armando Arias, Richard A Killington, and David J Rowlands (2009) Foot-and-Mouth Disease Virus Assembly: Processing of recombinant Capsid Precursor by Exogenous Protease Induces Self-Assembly of Pentamers In Vitro in a Myristoylation-Dependent Manner J Virol, 83(21): 11275–11282 doi:10.1128/JVI.01263-09 18 Grubman MJ, Mauro P Moraes, Christopher Schutta, Jose Barrera, John Neilan, Damodar Ettyreddy, Bryan T Butman, Douglas E Brough & David A Brake Adenovirus serotype 5-vectored foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade Future Virol (2010) 5(1), 51–64 19 Hema M, D Chandran, SB Nagendrakumar, M Madhanmohan, and VA Srinivasan Construction of an infectious cDNA clone of foot-and-mouth disease virus type O1 BFS 1860 and its use in the preparation of candidate vaccine Biosci 34(1), 2009 http://www.ias.ac.in/jbiosci 20.Hosmer D.W and Lemeshow, S (2000) Applied logistic regression nd ed JonWiley and Sons Inc., New York, p.91-143 21 FAO Report 2013: Foot-and-Mouth Disease situation 22 Feng Q, Xi Chen, Ou Ma, Yingying Liu, Mingxiao Ding, Richard A Collins, Lung-Sang Ko, Jun Xing, Lok-Ting Lau, Albert Cheung-Hoi Yu, and Jianguo Chen Serotype and VP1 gene sequence of a foot-and-mouth disease virus from Hong Kong (2002) Biochemical and Biophysical Research Communications 30 (2003) 715–721 23 Fleiss J L (1981) Statistical methods for rates and proportions John Wiley and Sons Inc., New York, p 17-338 24 Fry EE, Stuart DI, Rowlands DJ (2005) The structure of foot-and-mouth disease virus Curr Top Microbiol Immunol.,288, 71-101 25.Van Phan Le:heterogeneity and genetic variations of serotype O and Asia1 foot-and-mouth disea viruses isolated in Viet Nam Foreign Animal Disease Division, National Veterinary Reseach and Quarantine Service Anyanng, Gyeonggi 430-757, Republic of Korea 10/2009 54 ...BỘ GI O DỤC VÀ Đ O T O VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN O N GEN VP1 CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI VÀ TINH SẠCH NGUYỄN MINH THÀNH... VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG .12 1.2.1 Tổng quan virus Lở mồm long móng .12 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus Lở mồm long móng 16 1.2.3 Cấu trúc gen virus LMLM 19 1.3 HỆ BIỂU HIỆN... subtype Ở Việt Nam, phát type O; type A Asia nhƣng thƣờng gặp type O Các type lở mồm long móng lại chia thành nhiều biến chủng (subtype) khác nhau; ví dụ type A có A1, A2, A3, type O có O1 , O2 ,