VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI TÁCH DỊNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN TỪ VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG TRỊ Giáo viên hướng dẫn 1: PGS.TS Phạm Việt Cường Giáo viên hướng dẫn 2: NCS Trần Thị Hồng Sinh viên thực : Đỗ Thị Thương Lớp : 13-01 Hà Nội- 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC KHĨA LUẬN LU TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI TÁCH DỊNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN NT TỪ VI SINH VẬT T LIÊN K KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG NG TR TRỊ Giáo viên hướng dẫn n 1: PGS.TS Ph Phạm Việt Cường Giáo viên hướng dẫn n 2: NCS Tr Trần Thị Hồng Sinh viên thực n : Đỗ Thị Thương Lớp : 13-01 Hà Nội- 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trường Viện Đại Học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ em suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Phạm Việt Cường- Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung- Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam NCS Trần Thị Hồng, người trực tiếp hướng dẫn em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới cô chú, anh chị, cán Trung tâm công nghệ sinh học Phân tử Nghĩa Đô- Viện Nghiên cứu Khoa học miền Trung giúp đỡ em nhiều thời gian em thực tập Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân u ln động viên, khích lệ, giúp đỡ em q trình học tập để em hồn thành luận văn này! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Đỗ Thị Thương MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát hải miên 1.2 Khái quát vi sinh vật liên kết hải miên 1.3 Protease chất ức chế protease 1.3.1 Protease 1.3.1.1 Giới thiệu chung 1.3.1.2 Phân loại protease 1.3.2 Chất ức chế protease (protease inhibitor- PI) 11 1.3.2.1 Khái niệm phân loại 11 1.3.2.2 Cấu trúc tính chất chất ức chế protease 13 1.3.2.3 Cơ chế tác động chất ức chế protease 14 1.4 Tình hình nghiên cứu chất ức chế protease nước 15 1.4.1.Tình hình nghiên cứu giới 16 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 1.5 Vector tách dòng pCR® 2.1 invitrogen 19 PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1.Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu, hóa chất mơi trường nghiên cứu 22 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.2 Hóa chất 22 2.2.3 Môi trường nghiên cứu 23 2.2.4 Trang thiết bị máy móc 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 26 2.3.2 Phương pháp điện di gel agarose 28 2.3.3 Thiết kế mồi 29 2.3.4 Phương pháp PCR 29 2.3.5 Phương pháp gel 30 2.3.6 Phương pháp biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào khả biến E Coli Top 10F’ 32 2.3.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E Coli 34 2.3.8 Phương pháp cắt DNA plasmid enzyme giới hạn 35 2.3.9 Xác định trình tự gen máy tự động 36 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 38 3.2 Khuyếch đại gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị phản ứng PCR 39 3.3 Tách dòng gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị phản ứng PCR 40 3.3.1 Kết gel 40 3.3.2.Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR®2.1 41 3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng Top 10F’ 41 3.3.4 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 43 3.3.5 Cắt kiểm tra DNA plasmid enzym giới hạn EcoRI 44 3.3.6 Trình tự nucleotid gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT mg Miligram ml Mililitre g Gram µl Microlitre bp Base pair kb Kilobase DNA Deoxyribonucleotit Acid aa Acid amin Agar Agarose E Enzyme I Inhibitor E.coli Escherichia coli ETDA Ethylene Diamine Tetra- acetic Acid IPTG Isopropylthio- β- D- galactoside LB Luria Bertani PCR Polymerase Chain Reaction PI Protease Inhibitor (chất ức chế protease) SDS Sodium Dodecyl sulfate TAE Tris- acetat- ETDA Taq Thermus aquaticus rpm Vòng/ phút TTHĐ Trung tâm hoạt động UV Ultraviolet X- gal 5- brom-4- chloro-3- indolyl- β-D- galactosidase DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh Hải miên Hình 1.2: Cấu tạo protease Hình 1.3: Cấu trúc không gian protease Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt giới hạn vector pCR®2.1…………21 Hình 3.1: Điện di đồ DNA tổng số VSV-HM 39 Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi 667 39 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm gel HM9-QT gel agarose 1% 41 Hình 3.4: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli Top 10F’ 42 Hình 3.5: Kết tách DNA plasmid 43 Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm cắt enzym giới hạn 44 Hình 3.7: Kết blast gen HM9-QT ngân hàng quốc tế NCBI……….45 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số chất ức chế protease 12 Bảng 2.1: Tên hóa chất hãng sản xuất thí nghiệm 22 Bảng 2.2: Tên thiết bị máy móc hãng sản xuất thí nghiệm 25 Bảng 2.3: Thành phần phản ứngPCR 30 Bảng 3.1: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ AND (µg/ml) mẫu nghiên cứu .38 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Môi trường biển đa dạng, người ta tính vi khuẩn biển nhiều, đạt mật độ đến 106/ml nước biển, sinh khối biển chất trao đổi nhiều Môi trường biển, gồm lớp bề mặt, người ta tin chứa khoảng 3,67x1030 vi sinh vật với gần 71% bề mặt trái đất 361 triệu km2 bao phủ đại dương, môi trường khu vực rộng lớn tiềm đa dạng vi sinh vật cơng nghệ sinh học khai thác hay “công nghệ sinh học xanh” Trong môi trường biển, vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ vi sinh vật mơi trường rõ ràng có tính chất sinh lý sinh hóa đa dạng cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi phát triển mạnh điều kiện Như khai thác enzymes vi sinh vật biển tổng hợp có hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khả hoạt động điều kiện cực đoan Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật đa dạng mô chúng Sự đa dạng giải thích phần thay đổi điều kiện lý, hóa, sinh hải miên, ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật tiến hóa Vi sinh vật liên đới với hải miên có nội bào ngoại bào Những nghiên cứu vi sinh vật liên đới với hải miên sử dụng kỹ thuật vi sinh nuôi cấy truyền thống, kiểm tra mô hải miên kính hiển vi.Những nghiên cứu vi sinh vật liên đới hải miên cho thấy vi sinh vật chiếm đến 50% thể tích hải miên, số lớn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn nước biển, cộng đồng đặc hiệu cho hải miên Rất nhiều sản phẩm hải miên cho thực tế vi khuẩn liên đới sinh Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội nhiều báo cáo chứng minh giả thuyết Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt vi sinh vật liên kết với thể khác mối tương tác chúng phức tạp Hơn nữa, khai thác hải miên để tách chiết hoạt chất nguồn ngun liệu có hạn bị nhanh chóng, khó phục hồi gây hủy hoại mơi trường Vì cần phải có phương pháp nhằm phát thu hợp chất hoạt tính sinh học lượng lớn Phần lớn báo cáo phát tách chiết chất có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế khối u ức chế protease từ chủng vi sinh vật nuôi cấy Hiện nay, Serine protease inhibitors thành viên quan trọng chiếm tỉ lệ nhiều họ protease inhibitors.Chúng hoạt động tác nhân điều hòa (modulator) tham gia vào nhiều q trình phân giải protein quan trọng, liên kết hóa trị với protein đích bất hoạt chúng Vì việc tìm kiếm chất ức chế protease gợi quan tâm mạnh mẽ nhiều lĩnh vực.Vi sinh vật biển nguồn giàu hợp chất có hoạt tính sinh học Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu Sự đa dạng vi sinh vật liên kết hải miên biển đặc trưng mơi trường biển góp phần tạo nguồn gen có gen ức chế serine protease Các hợp chất ức chế serine protease mã hóa gen có đặc tính có tiềm ứng dụng chữa trị bệnh Xuất phát từ đó, chúng tơi thực đề tài: “ Tách dòng gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Mục tiêu đề tài Tách dòng thành cơng gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị Từ mẫu Hải miên thu thập từ vùng biển tỉnh Quảng Trị, tiến hành tách chiết DNA tổng số vi sinh vật liên kết hải miên theo phương pháp 2.3.1 nêu trên.Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agarose 1% Kết kiểm tra quang phổ kế đồng thời dùng để xác định nồng độDNA mẫu tách chiết Bảng 3.1 kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN theo công thức nêu Với giá trị A260/A280 dao động từ 1.82 đến 1.9 cho thấy mẫu ADN tách chiết có độ tinh cao Sau nồng độ ADN xác định, tiến hành pha lỗng đến nồng độ 50ng/µl, lấy µl để kiểm tra điện di Hình ảnh điện di (Hình 3.1) cho thấy mẫu ADN sạch, bị đứt gãy, sử dụng làm khn cho phản ứng PCR Bảng 3.1: Kết xác định tỷ lệ A260/A280 nồng độ ADN (µg/ml) mẫu nghiên cứu TT Tên mẫu A260 A280 A260/A280 Nồng độ ADN (µg/ml) HM1-QT 0.248 0.136 1.82 620 HM2-QT 0.310 0.167 1.86 775 HM3-QT 0.325 0.169 1.84 865 HM4-QT 0.250 0.220 1.82 625 HM5-QT 0.234 0.128 1.83 585 HM6-QT 0.255 0.134 1.90 637,5 HM7-QT 0.346 0.187 1.85 865 HM8-QT 0.344 0.184 1.87 860 HM9-QT 0.221 0.121 1.83 527,5 Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 38 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.2 Khuyếch đại gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị phản ứng PCR Sau tách chiết DNAtừ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị xác định thấy DNA tổng số có độ tinh cao, tiến hành PCR mẫu với cặp mồi 667 có trình tự trình bày phần phương pháp 2.3.3 Sau đó, sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1%, kết thể hình 3.2 M ~700bp Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR với cặp mồi 667 Giếng M: Maker 1kb hãng Fermentas Giếng 1: sản phẩm PCR mẫu HM1-QT Giếng 2: sản phẩm PCR mẫuHM2-QT Giếng 3: sản phẩm PCR mẫuHM3-QT Giếng 4: sản phẩm PCR mẫuHM4-QT Giếng 5: sản phẩm PCR mẫu HM5 QT Giếng 6: sản phẩm PCR mẫuHM6-QT Giếng 7: sản phẩm PCR mẫuHM7-QT Giếng 8: sản phẩm PCR mẫuHM9-QT Giếng 9: sản phẩm PCR mẫuHM8-QT Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 39 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết điện di sản phẩm PCR hình 3.2 cho thấy có đường chạy giếng số 4,6,8 xuất băng với kích thước khác Riêng có giếng số xuất băng sáng rõ, không bị đứt gãy, đối chiếu với thang DNA chuẩn, kích thước sản phẩm PCR tương ứng với kích thước dự đốn theo lý thuyết khoảng gần 700 bp Kết cho thấy, kích thước gene khuếch đại phù hợp với thiết kế cặp mồi nhân gene, sản phẩm PCR mẫu HM9-QT Còn giếng khác không xuất băng số giếng 4,6 xuất nhiều băng khơng có băng theo dự đốn lý thuyết Điều lý giải DNA hỗn hợp vi sinh vật liên kết với hải miên, chủng Vì vậy, việc khuếch đại gen theo tính toán hạn chế Tuy nhiên, số mẫu PCR có mẫu HM9-QT có xuất băng tương đương với kích thước theo dự đốn ban đầu Vì vậy, chúng tơi chọn mẫu để thực thí nghiệm với cặp mồi 667 3.3 Tách dòng gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị phản ứng PCR 3.3.1 Kết gel Quy trình tách dòng thực cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR®2.1của hãng Invitrogen Để việc gắn hiệu quả, sản phẩm PCR phải tinh sạch, thu băng đặc hiệu loại bỏ thành phần tạp chất sản phẩm PCR như: mồi, đệm, enzym, Quá trình làm DNA (thôi gel) thực theo hướng dẫn GeneJET Gel Extraction Kit mô tả mục 2.3.5 Khi nâng nhiệt độ dung dịch Binding buffer lên nhiệt độ 50ºC lượng DNA hòa vào dung dịch tách khỏi agarose Sau DNA gắn vào phân tử có lực cao với ADN cố định màng lọc cột lọc GeneJET purification column, dịch đệm Binding buffer loại nhờ ly Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 40 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội tâm nhanh với tốc độ cao (10.000 vòng/phút, phút) Để loại bỏ hết agarose bám màng lọc dung dịch Binding buffer bổ sung vào cột lần Dung dịch Binding buffer làm với dịch rửa Wash buffer có chứa 96% ethanol loại bỏ nhờ ly tâm Cuối ADN nằm lại màng lọc hòa tan dịch đệm Elution buffer nước Bằng phương pháp ADN thu lại với hiệu suất 85% trở lên Kết kiểm tra gel agarose 1% Kết quảtrên hình 3.3 cho thấy tinh thành công sản phẩm PCR mẫu HM9-QT có tính ngun vẹn, sử dụng làm nguyên liệu để gắn vào vector tách dòng 3.3.2.Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR®2.1 Sản phẩm PCR gắn trực tiếp vào vector pCR®2.1 nhằm mục đích tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen HM9-QT cần tách dòng Phản ứng ligate trình bày phần phương pháp Vector tái tổ hợp mong muốn vector gắn với sản phẩm pCR®2.1 mang gen PI (HM9-QT) 3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng Top 10F’ Sau gắn sản phẩm PCR vào vectorpCR®2.1 chúng tơi tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng Top 10F’ Nhờ máy tổng hợp tế bào vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp tạo với số lượng lớn Sau biến nạp dịch tế bào cấy trải môi trường thạch LB có bổ sung Kana (100mg/ml); X-gal (20mg/ml) chất cảm ứng IPTG 1M Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 41 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Trong môi trường chọn lọc có chứa chất kháng sinh nên tế bào có chứa vector tái tổ hợp có khả mọc phát triển Kết biến nạp thể hình 3.4 Hình 3.4: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli Top 10F’ Kết hình cho thấy, đĩa thạch xuất khuẩn lạc xanh trắng riêng rẽ Như vậy, khuẩn lạc xanh vector PCR®2.1có mangoperon Lac hoạt động bình thường, khơng có đoạn gen chèn vào có chất cảm ứng IPTG tổng hợp enzym β- galactosidase, chất chuyển hóa chất X- gal thành hợp chất có màu xanh Còn khuẩn lạc trắng có đoạn gen DNA ngoại lai xen vào lacpromoter gen lac Z cấu trúc operon Lac, gen bị bất hoạt, enzyme ß-galactosidase khơng tổng hợp Vì dù có X-gal mơi trường, chất không bị phân hủy, không tạo dẫn xuất indol khuẩn lạc có màu trắng Việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tách plasmid loại bỏ phần lớn trường hợp không mong muốn tất khuẩn lạc trắng mang vector plasmid tái tổ hợp chứa đoạn DNA cần thiết Để khẳng định cách chắn, thực bước kiểm tra Đó kiểm tra DNA plasmid tách chiết Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 42 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội enzym giới hạn so sánh kích thước đoạn cắt với sản phẩm phản ứng PCR 3.3.4 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli Chúng tơi tiến hành ni khuẩn lạc có khuẩn lạc trắng khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) mơi trường LB lỏng có chứa Kana (100mg/ml), sau tiến hành tách chiết DNA plasmid trình bày mục 2.3.7 phần phương pháp nghiên cứu Các DNA plasmid kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết thể hình 3.5 X Hình 3.5: Kết tách DNA plasmid Đường chạy X: DNA plasmid tách từ khuẩn lạc màu xanh Đường chạy 1: DNA plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu trắng mang gen HM9-QT (khoảng 667bp) Đối với kết tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp không sử dụng thang DNA chuẩn mà dựa ảnh điện di để quan sát nhận định kết quả.Theo lý thuyết điện di, phân tử DNA có kích thước lớn di chuyển chậm, gel điện di phân tử DNA có kích thước lớn nằm vị trí cao so với phân tử DNA có kích thước nhỏ Vector tái tổ hợp có gắn thêm sản phẩm PCR nên kích thước lớn vector đối chứng khơng mang đoạn xen di chuyển chậm vector đối chứng Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 43 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Kết điện di cho thấy có chênh lệch độ cao hai loại vector Kết điện di cho thấy DNA plasmid tách chiết sạch, băng điện di sáng, rõ, thành phần khác tế bào bị loại bỏ Mỗi đường chạy xuất ba băng: Băng plasmid dạng siêu xoắn, băng plasmid dạng mạch thẳng, băng plasmid dạng tháo xoắn Khi dạng siêu xoắn plasmid dễ dàng di chuyển ma trận gel hai dạng lại nên chạy nhanh Plasmid đường chạy có kích thước lớn plasmid đối chứng nên có đoạn DNA ngoại lai chèn vào Như plasmid từ dòng khuẩn lạc trắng tiếp tục sử dụng để tiến hành bước chọn lọcdòng mang gene HM9-QT 3.3.5 Cắt kiểm tra DNA plasmid enzym giới hạn EcoRI Để kiểm tra sản phẩm tách plasmid khẳng định lần có mặt đoạn DNA cần quan tâm plasmid tinh sạch, plasmid cắt enzym giới hạn EcoRI Kết thể hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen HM9-QT vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy sau cắt enzym giới hạncó văng băng có kích thước sản phẩm PCR (~ 667bp) DNA plasmid khuẩn lạc xanh khơng văng băng có kích thước sản phẩm PCR khơng có gen ngoại lại Còn sản phẩm PCR cắt EcoRI không văng băng sản phẩm PCR khơng có điểm cắt enzyme Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 44 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội giới hạn Điều chứng tỏ dòng plasmid mang gen HM9-QT đem để giải trình tự gen 3.3.6 Trình tự nucleotid gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị Mẫu gửi giải trình tự Base- Asia (Malaysia ) Kết xử lý phân tích phần mềm Bioedit.Sau xử lý chúng tơi thấy có trình tự tương đồng với trình tự vector tách dòng PCR®2.1 trình tự khác có kích thước khoảng 667bp Trình tự thu sau xử lý sau: TTCAACACGCAAGGTTACTGAAACACATGGGGTCGAGGTGTTTTTCCGCGGCGGTACATGCGTGCGACTC GCGCTCGCCGGTCCGGCACCAAACCGGAACGGGTCAGCACACCCTCGAATCCTGCGGAAGGATGCACACA ATGCGGAACACCGCGCGCTGGGCGGCCACCCTCGCCCTCACGGCCACCGCCGTCTGCGGACCCCTCACCG GAGCCGCGCTCGCCACCCCGGCCGCTGCTCCCGCCTCGCTCTACGCCCCCTCGGCCCTGGTGCTCACCGT CGGCCACGGCACTTCCGCGGCCGCCGCGTCCCCGCTGCGGGCAGTCACCCTGAACTGCGCCCCGACGGCC TCCGGCACCCATCCGGCCCCGGCCCTCGCCTGCGCCGACCTGCGCGGGGTCGGCGGTGACATCGACGCCC TGAAGGCGCGAGACGGCGTGATCTGCAACAAGCTGTACGACCCGGTCGTCGTCACGGTCGACGGAGTCTG GCAGGGCAAGCGCGTCTCCTACGAACGGACCTTCGGCGTCGAGTGCGTGAAGAACTCCTACGGGACCAGC CTCTTCGCGTTCTGAGAGACCGGGATCGCGGAGTCCTCGTGCACACCTGAAGAGGCACGCAGTTGGGGAG TGCGACTCCCTTGTCGCGGTACCCGTCGATTCGACGC Từ trình tự trên, blast ngân hàng NCBI cho thấy gen chúng tơi tách dòng có độ tương đồng 99% với gen Streptomyces longisporus protease inhibitor gene.Kết blast thể hình 3.7 Như vậy, kết luận chúng tơi tách dòng thành cơng gen protease inhibitor (HM9-QT) từ DNA vi sinh vật liên kết với hải miên Hình 3.7: Kết blast gen HM9-QT ngân hàng quốc tế NCBI Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 45 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Metagenomic lĩnh vực phát triển nhanh chóng Hiện nay, nhà nghiên cứu bắt đầu sử dụng phương pháp dựa metagenomic để phân lập hợp chất từ môi trường biển Báo cáo gần Jiang et al., (2011) cho thấy tách đượcdòng thơng qua sàng lọc dựa trình tự thư viện metagenomic từ vi sinh vật biển khơng ni cấygen mã hóa chất ức chế serine protease (serpin) gọi Spi 1C.Gen có ORF 642 bp, mã hóa cho polypeptide 214 amino acid với khối lượng phân tử dự đoán 28,7 kDa Protein Spi 1C có hoạt tính ức chế loạt serine proteases αchymotrypsin trypsin Như vậy, nghiên cứu theo phương pháp metagenomics bắt đầu Đây xem kết hợp hiệu công nghệ genomics, tin sinh học sinh học hệ thống nghiên cứu hệ sinh học tự nhiên Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 46 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Đã phân lập thành cơng gene PIcó kích thước khoảng 667bp phương pháp PCRtừ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị - Đã tách dòng thành cơng gene PI thơng qua vector tách dòng PCR®2.1và biến nạp vào chủng E coliTop 10F’ - Đã xác định trình tự gene PI 667 so sánh trình tự gene với trình tự cơng bố NCBI Gene PI 667 phân lập có độ tương đồng 99% với gene Streptomyces longisporus protease inhibitor gene cơng bố có mã số M80577.1 ngân hàng gene NCBI Kiến nghị Tiếp tục tiến hành nghiên cứu khác với gene PI 667đã tách dòng thành cơng biểu gen, xác định hoạt tính PI protein biểu hiện, từ có định hướng việc sản xuất chế phẩm phục vụ đời sống, bảo vệ sức khỏe người môi trường Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 47 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Trịnh Hồng Thái (1995), Nghiên cứu proteinase chất ức chế proteinase sâu xanh, Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học –Trường ĐHQGHN – Đại học Khoa học tự nhiên Phạm Thiện Ngọc, Nguyễn Thị Hà (1999), Protease chất ức chế protease ung thư, Tạp chí thơng tin Dược số 9/ 1999, tr 11-13 Bộ môn Dược lý: trường Đại học Dược Hà Nội, Dược lý học 2, tr.10710; 205-230 Hồng Thị Bích Ngọc, Lê Thị Thu (2001), Nồng độ alpha- 1- antitrysin bệnh nhân viêm gan, tạp chí nghiên cứu y học, 1/2001 Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng, Luận án tiến sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: Abdulaziz Anas, C Jasmin, , Shanta Nair(2015), “Bacterial diversity associatedwith Cinachyra cavernosa and Haliclona pigmentifera, cohabiting sponges inthe coral reef ecosystem of Gulf of Mannar, Southeast Coast of India”, PLoSONE, 10(5) Ahn, Y.B., Rhee, S.K., Fennell, D.E., Kerkhof, L.J., Hentschel, U., and Haggblom, M.M(2003), “Reductive dehalogenation of brominated phenoliccompounds by microorganisms associated with the marine sponge Aplysinaaerophoba”, Appl Environ Microbiol 69, pp 41594166 Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 48 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Terao T (2004), “ A soybean unitz trysin inhibitor suppress ovarian cancer cell invasion by blocking urokinase upregulation” clin Exp Metastasis: 21(2): 159-66 Barrett, A J., Rawlings, N D., and Woessner, J J F (1998): Hand book of proteolytic enzymes Academic Press London 10 Umezawa, H (1982): Low molecular weight enzyme inhibitors of microbial origin Ann Rev Microbiol 36, 75-99 11 Stockman F, Goke B, Otto J, Lankisch PG, Creutzfeld W (1984), “Effect of FOY- 305 on the activity and secretion of pancreatic enzyme in vitro”, Zgastroenterol, 22 (6):311-7 12 Calcinai B, Azzini F, Bavestrello G, Cerrano C., Pansini M, Do CongThung(2006), “Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam”,Zoological studies, 45(2), pp 201-212 13 Cho H.H, Shim E.J, Park, J.S(2010), “Phylogenetic Diversity of BacteriaAssociated with the Marine Sponges, Spirastrella abata and Cinachyrella sp”,The Korean J Microbiol, 46(2) 14 Rawlings, N D., and Barrett, A J (2011): MEROPS: the peptidase database, Wellcome Trust 15 Fieseler, L., Horn, M., Wagner, M., and Hentschel, U(2004), “Discovery of the novel candidate phylum "Poribacteria" in marine sponges”, Appl Environ Microbiol, 70, pp 3724-3732 16 Rawlings ND, Tolle DP, Barrett AJ (March 2004) "Evolutionary families of peptidase inhibitors" Biochem J 378 (Pt 3): 705–16 17 Alastair J.J., Wood M.D., (1998), "HIV-Protease inhibitors", N Engl J Med 338, pp 1281-1292 18 Patick A K., Boritzki T J., Bloom L A (1997), “Activities of the human immunodeficiency virus type (HIV-1) protease inhibitor nelfinavir mesylate in combination with reverse transcriptase and Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 49 Khóa luận tốt nghiệp protease inhibitors Viện Đại Học Mở Hà Nội against acute HIV-1 infection in vitro”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 41(10), pp 2159-2164 19 Dunn LA, Andrews KT, McCarthy JS, et al (2007) "The activity of protease inhibitors against Giardia duodenalis and metronidazoleresistant Trichomonas vaginalis" Int J Antimicrob Agents 29 (1) 20 Andrews KT, Fairlie DP, Madala PK, et al (2006) "Potencies of Human Immunodeficiency Virus Protease Inhibitors In Vitro against Plasmodium falciparum and In Vivo against Murine Malaria" Antimicrob Agents Chemother 50 (2): 639–48 21 Hocman G.: Chemoprevention of cancer: protease inhibitors Int.J Biochem 1365-1375 1992 22 Koopmans M, Martens D, Wijffels RH et al (2009), “Towards commercial production of sponge medicines” Mar Drugs 2009 Dec 2;7(4):787-802 23 Niyaz Ahamed “Isolation and identification of secondary metabolites producing organisms from marine sponge”, Discovery, 2012, 1(1), 1417 24 Hill MS, Hill AL, Lopez N, Harriott O (2006) Sponge-specific bacterial symbionts in the Caribbean sponge, Chondrilla nucula (Demospongiae, Chondrosida) Mar Biol 148: 1221-1230 25 Wang, G.(2006) “Diversity and biotechnological potential of the spongeassociated microbial consortia”, J Ind Microbiol Biotechnol, 33, pp 545-551 26 Li Z, He L & Miao X (2007) Cultivable bacterial communityfrom South China Sea sponge as revealed by DGGEfingerprinting and 16S rDNA phylogenetic analysis Curr Microbiol 55: 465–475 Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 50 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 27 Thomas T, et al 2010 Functional genomic signatures of sponge bacteria reveal unique and shared features of symbiosis ISME J 4:1557–1567 28 Penesyan A, et al 2011 Identification of the antibacterial compound produced by the marine epiphytic bacterium Pseudovibrio sp D323 and related sponge-associated bacteria Mar Drugs 9:1391–1402 29 Grasa J., Calvo B., Delgado‐Andrade C., and Navarro M P 2013 Variations in tendon stiffness due to diets with different glycotoxins affect mechanical properties in the muscle‐tendon unit Ann Biomed Eng 41:488–496 30 Ahmed I, Zia, M.A., and Iqbal, H M N (2011) “Purification and kinetic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique”, “ World Appl, Sci J 12(6), 751-757 31 Wahl SM1, McNeely TB, Janoff EN, Shugars D, Worley P, Tucker C, Orenstein JM “Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) in mucosal fluids inhibits HIV-I” 32 Abdelmohsen K, Tominaga-Yamanaka K, Srikantan S, Yoon JH, Kang MJ, Gorospe M (2012) RNA-binding protein AUF1 represses Dicer expression Nucleic Acids Res 33 Brümmer, F., Pfannkuchen, M., Baltz, A., Hauser, T., and Thiel, V (2008), “Light inside sponges”, JExp Mar Biol Ecol 367, pp 61-64 Tài liệu mạng: 34 http://123doc.org/document/3815353-phan-lap-va-sang-loc-hoat-tinhantri-protease-tu-vi-sinh-vat-lien-ket-hai-mien-tai-bien-da-nang.htm Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 51 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 35 http://xemtailieu.com/tai-lieu/phan-lap-tuyen-chon-vi-sinh-vat-lien-kethai-mien-co-hoat-tinh-doi-khang-voi-mot-so-vi-sinh-vat-kiem-dinh1174817.html 36 https://www.britannica.com/science/proteolytic-enzyme 37 luanvan.co/luan-van/seminar-enzyme-protease-51956/ 38 http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-tong-quan-ve-enzyme-protease8085/ 39 https://www.google.com/search?q=mo+hinh+protease&source=lnm&tb m 40 http://www.chuabuuchau.com.vn/chuong/5.-cac-chat-chong-ung-thucua-au-nanh_22699.html 41 http://text.123doc.org/document/1438425-khoa-luan-tot-nghiep-daihoc-sap-xep-theo-he-thong-va-buoc-dau-nghien-cuu-tach-chiet-mot-sochat-uc-che-protease.htm 42 http://tapchi.vnu.edu.vn/tn_4_08/b1.pdf Đỗ Thị Thương- Lớp 13- 01 CNSH Page 52 ... từ vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 38 3.2 Khuyếch đại gen ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị phản ứng PCR 39 3.3 Tách dòng gen ức chế protease vi sinh vật. .. chữa trị bệnh Xuất phát từ đó, chúng tơi thực đề tài: “ Tách dòng gen ức chế protease thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị Mục tiêu đề tài Tách dòng thành cơng gen ức chế. . .VI N ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI TÁCH DÒNG GEN ỨC CHẾ PROTEASE THU NHẬN NT TỪ VI SINH VẬT T LIÊN K KẾT HẢI MIÊN VÙNG BIỂN QUẢNG NG TR TRỊ