BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Lê Đình Quế PHÂN TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN PROTEIN TỪ NỌC RẮN HỔ VIỆT NAM OPHIOPHAGUS HANNAH VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ BIỆT HĨA Ở TẾ BÀO MƠ MỠ 3T3-L1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Lê Đình Quế PHÂN TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN PROTEIN TỪ NỌC RẮN HỔ VIỆT NAM OPHIOPHAGUS HANNAH VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ BIỆT HÓA Ở TẾ BÀO MƠ MỠ 3T3-L1 Chun ngành: Cơng nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Phịng Vi sinh vật học phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học dìu dắt, hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành cơng việc chun mơn phịng hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử chú, anh chị, bạn phịng Vi sinh vật học phân tử quan tâm, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Phịng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho sử dụng thiết bị thực đề tài Để có hiểu biết kiến thức chuyên ngành, xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Công nghệ hinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo cho mơi trường học tập tốt để tơi hồn thành khóa học Thạc sĩ trường Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè giúp đỡ động viên để tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2016 Học viên Lê Đình Quế LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài nghiên cứu tôi, tất số liệu nghiên cứu đề tài trung thực chưa công bố đề tài trước Hà nội, ngày 15 tháng 10 năm 2016 Tác giả Lê Đình Quế MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rắn 1.1.1 Họ Rắn hổ (Elapidae) 1.1.2 Họ Rắn lục (Viperidae) 1.1.3 Họ Colubridae 1.1.4 Họ Boidae 1.2 Các loại rắn độc Việt Nam 1.3 Nọc rắn hoạt tính sinh học chúng 14 1.3.1 Nọc rắn bệnh thần kinh 14 1.3.2 Nọc rắn bệnh máu 15 1.3.3 Nọc rắn bệnh ung thư 15 1.3.4 Nọc rắn bệnh tim mạch 16 1.4 Rắn Hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) 16 1.4.1 Đặc điểm sinh học rắn Ophiophagus hannah 16 1.4.2 Đặc điểm nọc rắn Ophiophagus hannah 17 1.5 Bệnh béo phì 23 1.6 Tổng quan dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1 24 1.7 Một số phương pháp phân tách protein nọc rắn 27 1.7.1 Phương pháp lọc gel (Gel-Filtration) 28 1.7.2 Phương pháp sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 29 1.7.3 Phương pháp điện di chiều (2D gel electrophoresis) 29 1.7.4 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 30 1.7.5 Phương pháp dùng ống có chứa màng lọc ly tâm (Centriplus Centrifugal Filter Devices) 31 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Vật liệu nghiên cứu 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Phương pháp thu nhận nọc rắn 32 2.3.2 Phương pháp phân tách phân đoạn protein từ nọc rắn Ophiophagus hannah 33 2.3.3 Phương pháp điện di gel polyacrylamide 34 2.3.4 Phương pháp HPLC để phân tách peptide 3-10 kDa 35 2.3.5 Phương pháp thử nghiêm ảnh hưởng phân đoạn peptide lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 35 2.3.6 Phương pháp thử nghiêm ảnh hưởng phân đoạn peptide lên biệt hóa tế bào mô mỡ 3T3-L1 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Thu nhận nọc rắn O hannah 38 3.2 Phân tách phân đoạn phân đoạn protein peptide từ nọc Ophiophagus hannah 39 3.3 Phân tách phân đoạn ≤ Pr < 10 kDa phương pháp HPLC 41 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 43 3.5 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên biệt hóa tế bào 3T3-L1 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 510 DANH MỤC HÌNH Stt Nội dung Trang Hình 1.1 Phương thức tác động LAAO 18 Hình 1.2 Phương thức tác động PLA2 19 Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian Haditoxin 20 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian Neurotoxin 21 Hình 1.5 Các loại tế bào mơ mỡ 25 Hình 1.6 Q trình biệt hóa (adipogenesis) tế bào mơ mỡ 26 Hình 1.7 Sắc kí lọc gel 28 Hình 1.8 Sắc kí trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 29 Hình 1.9 Sơ đồ phương pháp điện di chiều (2D gel electrophoresis) 30 Hình 1.10 Sơ đồ phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 31 Hình 2.1 Cách thức thu nhận nọc rắn 33 Hình 2.2 Thứ tự bước phân tách phân đoạn Protein nọc rắn 34 Hình 2.3 Các bước ni cấy tế bào đĩa 96 giếng 35 Hình 2.4 Các bước ni cấy tế bào đĩa 12giếng 36 Hình 2.5 Máy đo quang phổ kế mẫu đĩa 96 giếng 37 Hình 3.1 Nọc rắn O hannah sau đơng khơ 38 Hình 3.2 40 Hình 3.3 Ảnh điện di nọc rắn thô O hannah với protein chuẩn (kDa) gel polyacrylamide 12% Ảnh điện di phân đoạn protein (Pr) 41 Hình 3.4 Kết phân tách phân đoạn Protein - 10 kDa HPLC 42 Hình 3.5 Ảnh hưởng phân đoạn peptide lên sinh trưởng tế bào mơ 44 mỡ 3T3-L1 Hình 3.6 Sự tích lũy mỡ tế bào 3T3-L1 46 Hình 3.7 Ảnh hưởng phân đoạn peptide lên tích lũy lipid tế bào mơ 47 mỡ 3T3-L1 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loài rắn độc thuộc họ Elapidae Bảng 1.2 Một số loài rắn độc thuộc họ Viperidae .7 Bảng 1.3 Một số loài rắn độc thuộc họ Colubridae Bảng 1.4 Một số loài rắn độc Việt Nam .9 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE .25 MỞ ĐẦU Nguồn tài nguyên thực vật, động vật nguyên liệu dùng làm thuốc Việt Nam khơng phong phú đa dạng mà cịn có tính đặc thù cao Đây tiềm thực góp phần làm tảng cho chiến lược cung ứng nguồn nguyên liệu chỗ nhập để phục vụ ngành dược với chủ động, giá hợp lí có lồi rắn Theo kinh nghiệm từ bao đời từ sách vở, với thuốc cổ truyền để lại: thịt, xương, mỡ, mật, máu, da rắn dược liệu quí dùng điều chế nhiều loại thuốc bồi bổ điều trị bệnh cho người Tuy nhiên thập kỉ gần đây, xuất phát từ khám phá thú vị thành phần tính nọc độc, rắn nhiều động vật gây độc thu hút quan tâm sâu sắc nhà khoa hoc Trong số loại nọc độc, nọc rắn có thành phần đa dạng Nhiều nghiên cứu cho thấy nọc rắn gồm enzyme, protein, peptide hợp chất hữu khác Khi tiêm vào mồi, nọc rắn tác động lên hệ thần kinh, hệ hơ hấp, hệ tuần hồn kết làm biến đổi trình sinh lý bình thường mồi, chí làm chết mồi Các thành phần nọc rắn tác động cách đặc hiệu hiệu lên quan đích thụ thể, enzyme, protein màng Chính vậy, nọc rắn dùng công cụ hữu hiệu phục vụ cho nghiên cứu nguồn nguyên liệu tham gia để chế tạo thuốc (Del 2013) Một ví dụ điển hình captopril, thuốc điều trị bệnh huyết áp Nghiên cứu nọc rắn Bothrophs jararaca, tác giả phát hợp chất gồm 13 axit amin có tác dụng giống bradykinin, có tác dụng ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin (angiotensine converting enzyme - ACE) có tác dụng chuyển hóa AgI thành AgII (một oligopeptide có tác dụng làm co mạch, gây tăng huyết áp) Captopril chất ức chế enzyme sử dụng cho người mắc bệnh cao huyết áp (Camargo cộng sự, 2012) Dendrotoxins, 60 axit amin, tách từ rắn mamba Dendroaspis angusticeps tác động lên kênh K+ tế bào thần kinh làm tăng giải phóng achetylcholine khớp thần kinh-cơ (neuromuscular junctions) Do tính đặc hiệu hiệu kênh K+, phân tử dùng để nghiên cứu cấu trúc chức kênh ion (Harvey, Robertson 2004) Tương tự nhiều loài rắn khác, Rắn hổ Ophiophagus hannah có thành phần nọc phong phú Tại Việt Nam, nghiên cứu loài chủ yếu tập trung vào việc sử dụng nguồn nọc thô rắn để sản xuất kháng thể kháng nọc Để tìm hiểu thêm tính phong phú đa dạng nọc rắn hổ, nghiên cứu này, tiến hành thực đề tài “Phân tách phân đoạn protein từ nọc rắn hổ Việt Nam Ophiophagus hannah nghiên cứu tác động chúng lên biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1” Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Phân tách riêng rẽ phân đoạn protein nọc rắn O hannah Phân tách phân đoạn peptide có kích thước nằm khoảng từ 3-10 kDa Đánh giá tác động phân đoạn thu lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 Đánh giá tác động phân đoạn thu lên biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Đề tài thực Phòng Vi sinh vật học phân tử, có sử dụng thiết bị Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hình 3.4 Kết phân tách Reversed-phase HPLC nọc độc thô O hannah Phân đoạn tương ứng với peptide có khối lượng phân tử 10 kDa đưa vào cột bán điều chế Vydac C18 1, 2, 3, tương ứng với phân đoạn rửa giải tương ứng phút 36-39 (phân đoạn 1), 40-43 (phân đoạn 2), 44-46 (phân đoạn 3) 47-49 (phân đoạn 4) Protein từ kDa đến 10 kDa nọc rắn O hannah phân tách phương pháp HPLC sử dụng ct C18 (250ì21.2 mm; àm, 110 Phenomenex, Torrance, CA, USA) gradient tuyến tính ACN nước có chứa 0.06% TFA Bốn phân đoạn khác thu nhận, hình Các phân đoạn đông khô bảo quản tủ -80oC Như nhiều cơng trình cơng bố, nọc rắn phức hệ phong phú peptide, protein, lipid, hydrate cacbon ion kim loại Ngoài việc sở hữu hoạt tính sinh học khác nhau, phân tử có khác biệt lớn kích thước Do vậy, để phân tách riêng rẽ thành phần nọc rắn, nhiều phương pháp phát kết hợp chúng mang lại hiệu to lớn cho lĩnh vực nghiên cứu thành phần sinh học nọc động vật gây độc Để tách Ophioluxin, protein hoạt hóa tiểu cầu, Du XY cộng (2002) phải kết hợp phương pháp lọc gel, sắc kí trao đổi ion HPLC Một enzyme khác, Ohagin, 50 kDa, có tác dụng phân giải fibrin phân tách với kết hợp dựa vào kĩ thuật lọc gel, trao đổi ion sắc kí lực heparin (Guo X cộng 42 sự, 2007) Trong neurotoxin, Oh9-1, phân lập dựa vào kết hợp sắc kí trao đổi ion HPLC (Chang LS cộng sự, 2002) Phospholipase A2 (PLA2) thu nhận nhờ kết hợp sắc kí lọc gel với cột SP-Sephadex C-25, DE52, Q-Sepharose (Chiou JY cộng sự, 1995) Đây kết việc tách chiết cụ thể chất đó, nhiên việc tách phân đoạn nọc rắn, nhiều nhóm tác giả phải sử dụng kết hợp phương pháp khác Trong nghiên cứu này, việc sử dụng cột ly tâm với kích thước màng khác nhau, kết hợp với phương pháp HPLC, phân đoạn khác phân tử có kích thước nằm khoảng từ đến 10 kDa thu nhận Các phân đoạn dùng cho nghiên cứu xác định ảnh hưởng chúng lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 Như biết, nọc rắn có tác dụng độc nhiều loại tế bào khác Chính việc xác định hoạt tính peptide thu cần thiết Để kiểm tra ảnh hưởng lên sinh trưởng tế bào động vật phân đoạn peptide phân tách từ nọc rắn O hannah, chúng tơi sử dụng dịng tế bào mô mỡ 3T3L1 Sau 24 h nuôi cấy với có mặt phân đoạn peptide riêng biệt, kết hình 3.5 cho thấy, nồng độ thử nghiệm, 10 µg/mL, so với đối chứng tế bào mô mỡ 3T3-L1 không xử lý với peptide, phân đoạn peptide khơng có ảnh hưởng lên sinh trưởng dòng tế bào mỡ 3T3-L1 43 Hình 3.5 Ảnh hưởng phân đoạn peptide lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 Nhiều nọc rắn hay thành phần nọc rắn biết đến có khả gây độc tế bào Ví dụ L-amino acid oxidase tách từ nọc rắn Agkistrodon blomhoffii ussurensis Enzyme gây độc tế bào gan HepG2 với IC50 832.2 µg/mL Thêm vào đó, L-amino acid oxidase làm chết tế bào ung thư vú MCF-7 với IC50 370.6 µg/mL (El-Sayed et al., 2013) Nọc thô rắn lục Macrovipera lebetina lebetina cơng bố có khả gây độc tế bào nguyên sợi L929 (hình 3.7), tế bào biểu mô thận (MDCK) hay tế bào nội mơ Những tác dụng thành phần khác nọc rắn gây 44 metalloproteinases, phospholipase A2 hay L- amino acid oxidases (Kakanj et al., 2015) Với kết thu cho thấy, không giống nhiều công bố trước tác dụng độc nọc rắn tế bào động vật, phân đoạn peptide tách chiết từ nọc rắn hổ Việt Nam, O hannah- nồng độ thử nghiệm, chúng không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Sự khác biệt nồng độ thử nghiệm thấp thân phân đoạn peptide khơng có hoạt tính gây độc tế bào 3.5 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên biệt hóa tế bào 3T3-L1 Trong thể, mơ mỡ mô liên kết lỏng lẻo cấu tạo chủ yếu tế bào mỡ tế bào trưởng thành (adipocyte) Ngồi ra, mơ mỡ cịn gồm có nguyên bào mỡ (preadipocyte), nguyên bào sợi (fibroblast), tế bào nội mô mạch máu tế bào miễn dịch đại thực bào (macrophage, tế bào T) Dưới tác động tín hiệu gây biệt hóa, ban đầu, số lượng tế bào tăng lên, sau kích thước tế bào tăng lên có thay đổi dình dạng kích thước Về hình thái, nguyên bào từ hình dẹt trở thành dạng hình cầu bên tế bào xuất giọt mỡ tích tụ lại Chúng dễ dàng quan sát kính hiển vi Nhờ tăng lên số lượng kích thước tế bào, kích thước mô mỡ tăng tăng lên Nghiên cứu trước cho thấy, số thành phần nọc rắn dùng để chế tạo thuốc điều trị bệnh cho người (Camargo cộng sự, 2012) Thêm vào gần đây, nghiên cứu Marcia đồng tác giả (2010) cho thấy PLA2 nọc rắn kiểm sốt bệnh béo phì, q trình tăng lên số lượng kích thước tế bào mơ mỡ (được gọi q trình biệt hóa tế bào), phân đoạn thử nghiệm tác động chúng lên biệt hóa tế bào mơ mỡ chuột 3T3-L1 Để nghiên cứu tác động phân đoạn lên tạo thành tế bào mỡ, tế bào mô mỡ 3T3-L1 chọn dùng Sau ngày nuôi cấy, kết quan sát chụp ảnh kính hiển vi (Hình 3.3) cho thấy lô đối chứng tế bào mô mỡ 45 tiếp xúc với môi trường DMEM chứa hỗn hợp nhân tố có tác dụng kích thích biệt hóa giai đoạn đầu (preadipogenesis), bao gồm IMBX, desamethasone, insulin FBS sau tiếp đến insulin, FBS (adipogenesis) cuối FBS Sau q trình biệt hóa, hạt mỡ xuất hầu hết tế bào Hình 3.6 Sự tích lũy mỡ tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Các tế bào mơ mỡ 3T3-L1 q trình biệt hóa xử lý riêng biệt với phân đoạn 1, 2, mức 10 µg/mL ngày (từ ngày đến ngày 8) A: Lipid nội bào nhuộm với dầu Red O (A) Kết hình 3.6 cho thấy, bổ sung phân đoạn peptide nồng độ 10 µg/mL, tích lũy mỡ tế bào giảm rõ rệt phân đoạn Trong đó, phân đoạn 1, khơng có tác dụng rõ rệt lên tích lũy lipid Quan sát củng cố xác định lượng lipid tế bào Sử dụng thuốc nhuộm Red O, sau 30 phút, dịch chiết đỏ 530 nm, kết cho thấy so với đối chứng lượng lipid thu thí nghiệm với có mặt PĐ giảm rõ rệt 46 Trong đó, thí nghiệm với PĐ 1, PĐ hay PĐ 4, khác biệt lượng lipid thu so với đối chứng khơng có ý nghĩa thống kê Những nghiên cứu tìm kiếm liệu pháp có tiềm cho bệnh béo phì mở rộng nhiều đối tượng Gần số loài vi sinh vật cơng bố có khả ức chế biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Theo tác giả Jeong- Eun Park công năm 2013 cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus plantarum LG42 phân lập từ sản phẩm cá lên men có tác dụng làm giảm tích lũy lipid bên tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Ngoài vi khuẩn Lactobacillus brevis OPK-3 phân lập từ kim chi có tác dụng ức chế biệt hóa tế bào mỡ 3T3-L1, ức chế tích lũy triglyceride bên tế bào hoạt tính enzyme glycerol -3- phosphate dehydrogenase (GDPH) (Park el al., 2013) Hình 3.7 Ảnh hưởng phân đoạn peptide lên tích lũy lipid tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Các tế bào mơ mỡ 3T3-L1 q trình biệt hóa xử lý riêng biệt với phân đoạn 1, 2, mức 10 µg/mL ngày (từ đến ngày 8) Theo tổ chức y tế giới tồn giới có khoảng 2,1 tỉ người bị béo phì thừa cân 30% số người bị bệnh Số liệu thống kê cho thấy hàng năm giới sử dụng triệu tỉ USD để phục vụ nghiên cứu điều trị bệnh béo phì Đây nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm Tim mạch, Huyết áp, Viêm nhiễm Tiểu đường Chính việc tìm kiếm nhân tố phương pháp có tác dụng hữu ích cho bệnh béo phì cần thiết Một 47 kho nguyên liệu vơ giá cho khoa học có nguồn gốc tự nhiên nọc độc, đặc biệt nọc rắn Với phong phú đa dạng thành phần, nọc rắn giới quan tâm nghiên cứu nhiều Như tài liệu công bố cho thấy, Việt nam, số loại nọc rắn nghiên cứu sử dụng thành công để tạo huyết kháng nọc rắn để cấp cứu điều trị rắn độc cắn cho nhân dân nước Nọc rắn cịn ngun liệu dùng để bào chế dạng thuốc mỡ, dạng thuốc kem để xoa trị thấp khớp, đau vv nhiều Xí nghiệp dược phẩm Tại trại rắn Đồng Tâm, nọc rắn khai thác để chế tạo khoảng 500.000 đến 600.000 ống Cobratox năm dùng làm thuốc kem xoa giảm đau Tuy nhiên, viêc phát thành phần nọc O hannah có tác dụng ức chế biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1 nghiên cứu Việt Nam giới Việc phát đóng góp thêm vào phong phú, đa dạng thành phần nọc loại rắn hổ Kết góp phần làm tăng tính phong phú hoạt tính sinh học nguồn nguyên liệu Tuy nhiên, kết thử nghiệm ban đầu phân đoạn peptide Việc phân tách xác định cụ thể thành phần mang lại hoạt tính nêu chế tác động tích mỡ tế bào mô mỡ 3T3-L1 cần thiết nghiên cứu tiếp 48 KẾT LUẬN Đã tách chiết thành công phân đoạn protein có kích thước phân tử (1) từ kDa - 10 kDa, (2) từ 10 kDa - 30 kDa, (3) từ 30 kDa - 50 kDa (4) từ 50 kDa - 100 kDa có nọc rắn O hannah Đã tách chiết phân đoạn peptide PĐ1, PĐ2, PĐ3 PĐ4 từ hỗn hợp peptide Ở nồng độ 10 µg/mL, phân đoạn thu nêu không ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3-L1 PĐ nồng độ 10 µg/mL ức chế biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1 Sự ức chế lên đến 56% 49 KIẾN NGHỊ Tiếp tục tách chiết phân đoạn để thu peptide tinh thử nghiệm ảnh hưởng chúng lên sinh trưởng biệt hóa tế bào mơ mỡ (3T3-L1), nghiên cứu chế tác động ức chế q trình biệt hóa Dựa vào kết thu được, tổng hợp peptide có hoạt tính theo phương pháp sinh học hay hóa học Những kết thu góp phần cung cấp thêm tính đa dạng nọc rắn O hannah Hơn nữa, sản phẩm nghiên cứu nhân tố tiềm cho việc điều trị bệnh béo phì 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbott M.J., Tang T., Sul H.S “The Role of Phospholipase A2-derived Mediators in Obesity” Drug discov Today Dis Mech, 7(3-4): e213-e218 Alencar L.R., Quental T.B., Grazziotin F.G., Alfaro M.L., Martins M., Venzon M., Zaher H (2016), “Diversification in vipers: Phylogenetic relationships, time of divergence and shifts in speciation rates”, Mol Phylogenet Evol, 105: 50-62 Armani A., Mammi C., Marzolla V., Calanchini M., Antelmi A., Rosano G.M., Fabbri A., Caprio M.(2010) “Cellular models for understanding adipogenesis, adipose dysfunction, and obesity” J Cell Biochem 110, 564–572 Aziz T.M., Bourgoin-Voillard S., Combemale S., Beroud R., Fadl M., Seve M.,De Waard M (2015), "Fractionation and proteomic analysis of the Walterinnesia aegyptia snake venom using OFFGEL and MALDI-TOF-MS techniques", Electrophoresis 36(20), p 2594-2605 Bauchot Roland (1994) Snakes: A Natural History Sterling Publishing Co., Inc New York City, NY, Hoa Kỳ, tr 220 Calzadilla P., Gómez-Serrano M., García-Santos E., Schiappacasse A., Abalde Y., Calvo J.C., Peral B., Guerra L.N (2013) “N-Acetylcysteine affects obesity-related protein expression in 3T3-L1 adipocytes” Redox Rep 18 210–218 Camargo A.C., Ianzer D., Guerreiro J.R., Serrano S.M., (2012), “Bradykinin- potentiating peptides: beyond captopril”, Toxicon, 59(4): 516-23 Chang C.C., Lin K.Y., Peng K.Y., Day Y.J., Hung L.M (2015) “Resveratrol exerts anti-obesity effects in high-fat dietobese mice and displays differential dosage effects on cytotoxicity, differentiation, and lipolysis in 3T3-L1 cells” Endocr J., 63, 169–178 da Silva, D C., W A de Medeiros, et al (2011) "Characterization of a new muscarinic toxin from the venom of the Brazilian coral snake Micrurus lemniscatus in rat hippocampus." Life Sci, 89(25-26): 931-938 51 10 Del Brutto O.H (2013) “Neurological effects of venomous bites and strings: snakes, spiders, and scorpions”, Handb Clin Neurol, 114: 349-68 11 Dong M.W., (2013), “The essence of modern HPLC: Advantages, limitations, fundamentals, and opportunities”, LCGC North America, 31(6): 472479 12 Eseberri I., Miranda J., Lasa A., Churruca I., Portillo M.P (2015) “Doses of Quercetin in the Range of Serum Concentrations Exert Delipidating Effects in 3T3L1 Preadipocytes by Acting on Different Stages of Adipogenesis, but Not in Mature Adipocytes” Oxid Med Cell Longev 2015 480943 13 Gomes A., De P., (1999) “Hannahpep: A novel fibrinolytic peptide from the Indian King Cobra (Ophiophagus hannah) venom” Biochem Biophys Res Commun, 266(2): 488-91 14 Green H., Meuth M (1974) “An established pre-adipose cell line and its differentiation in culture” Cell 3, 127–133 15 Gygi S.P., Corthals G.L., Zhang Y., Rochon Y., Aebersold R., (2000), “Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology” PNAS 97(17): 9390-9395 16 Harvey A.L., Robertson B., (2004) “Dendrotoxins: structure-activity relationships and effects on potassium ion channels”, Curr Med Chem, 11(23): 3065-72 17 http://www.nih3t3.com/ 18 Huang M.Z., Gopalakrishnakone P., Kini R.M (1997), "Role of enzymatic activity in the antiplatelet effects of a phospholipase A2 from Ophiophagus hannah snake venom", Life Sciences 61(22), pp 2211–2217 19 Jain D., Kumar S (2012) "Snake venom: a potent anticancer agent." Asian Pac J Cancer Prev, 13(10): 4855-4860 20 Johnsen E., Brandtzaeg O.K., Vehus T., Roberg-Larsen H., Bogoeva V., Ademi O., Hildahl J., Lundanes E., Wilson S.R., (2016), “A critical evaluation of 52 Amicon Ultra centrifugal filters for separating proteins, drugs and nanoparticles in biosamples”, J Pharm Biomed Anal, 120: 106-11 21 Jungbauer A., Hahn R (2009) “Ion-Exchange Chromatography” In Methods in Enzymology 463: 349-371 22 Junqueira-de-Azevedo I.L., Campos P.F., Ching A.T., Mackessy S.P (2016) “Colubrid venom composition: An-omics perspective”, Toxins (Basel), 8(8): E230 23 Kang M.C., Kang N., Ko S.C., Kim Y.B., Jeon Y.J (2016) “Anti-obesity effects of seaweeds of Jeju Island on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and obese mice fed a high-fat diet” Food Chem Toxicol 90, 36–44 24 Kato H., Tanaka G., Masuda S., Ogasawara J., Sakurai T., Kizaki T (2015) “Melatonin promotes adipogenesis and mitochondrial biogenesis in 3T3-L1 preadipocytes” J Pineal Res 59 267–275 25 Mammi C., Marzolla V., Armani A., Feraco A, Antelmi A., Maslak E (2016) “A novel combined glucocorticoid-mineralocorticoid receptor selective modulator markedly prevents weight gain and fat mass expansion in mice fed a high-fat diet” Int J Obes 2016 26 Marsh N., V Williams (2005) "Practical applications of snake venom toxins in haemostasis." Toxicon, 45(8): 1171-1181 27 Matsuo H., Kondo Y., Kawasaki T., Imamura N (2015) “Cineromycin B isolated from Streptomyces cinerochromogenes inhibits adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells via Krüppel-like factors and 3” Life Sci 135 35–42 28 Mehrtens John (1987) Living Snakes of the World Sterling, New York 29 Ogden C.L., Yanovski S.Z., Carroll M.D., Flegal K.M (2007) “The epidemiology of obesity” Gastroenterology 132 2087-2102 30 Parker H.W., Grandison A.G.C (1977) Snakes – a natural history Second Edition British Museum (Natural History) and Cornell University Press 108 pp 53 31 Petras D., Heiss P., Süssmuth R.D.,Calvete J.J (2015), "Venom proteomics of indonesian king cobra, Ophiophagus hannah: integrating top-down and bottomup approaches", J Proteome Res 14(6), p 2539-2556 32 Poulos S.P., Dodson M.V., Hausman G.J (2010) “Cell line models for differentiation: Preadipocytes and adipocytes” Exp Biol Med 35, 1185–1193 33 Regnier S.M., El-Hashani E., Kamau W., Zhang X., Massad N.L., Sargis R.M (2015) “Tributyltin differentially promotes development of a phenotypically distinct adipocyte” Obesity 23 1864–1871 34 Reynolds R.G., Collar D.C., Pasachnik S.A., Niemiller M.L., Puente-Rolón A.R., Revell L.J., (2016), “Ecological specialization and morphological diversification in Greater Antillean boas”, Evolution, 70(8): 1882-95 35 Rodrigues-Simioni L., Zamunèr S.R., Cogo J.C., Borja-Oliveira C.R., Prado- Franceschi J., Cruz-Höfling M., Corrado A.P (2004) “Pharmacological evidence for a presynaptic action of venoms from Bothrops insularis (jararaca ilhoa) and Bothrops neuwiedi (jararaca pintada)” Toxicon, 43 (6): 633–638 36 Roy A., Zhou X., Chong M.Z., D’hoét D., Foo C.S., Rajagopalan N., Nirthanan S., Bertrand D., Sivaraman J., Kini R.M., (2010), “Structural and functional characterization of a novel homodimeric three-finger neurotoxin from the venom of Ophiophagus hannah (king cobra)” J Biol Chem 285(11): 8302-15 37 Serrano S.M., Shannon J.D., Wang D., Camargo A.C., Fox J.W (2005) “A multifaceted analysis of viperid snake venoms by two-dimensional gel electrophoresis: an approach to understanding venom proteomics” Proteomics 5(25): 501-10 38 Singh R., Artaza J.N., Taylor W.E, Gonzalez-Cadavid N.F., Bhasin S (2003) “Androgensstimulatemyogenic differentiation and inhibit adipogenesis in C3H10T1/2 pluripotent cells through an androgen receptor-mediated pathway” Endocrinology 147- 5081–5088 54 39 Student A.K., Hsu R.Y., Lane M.D (1980) “Induction of fatty acid synthetase synthesis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes J Biol Chem 255 4745–4750 40 Tan N.H., Saifuddin M.N., (1989), “Isolation and characterization of an anusual form of L-amino acid oxidase from king cobra (Ophiophagus hannah) venom”, Biochem Int, 19: 937-44 41 Tsai P C., Chu C L., et al (2013) "Inhibition of Src activation with cardiotoxin III blocks migration and invasion of MDA-MB-231 cells." Toxicon 74: 56-67 42 Vaiyapuri S., Harrison R.A., Bicknell A.B., Gibbins J.M., Hutchinson G (2010) “Purification and Functional Characterisation of Rhinocerase, a Novel Serine Protease from the Venom of Bitis gabonica rhinoceros”, PLoS One, 5(3): e9687 43 Vianna Braga M.C., Konno K., Portaro F.C., Carlos de Freitas J., Yamane T., Olivera B.M., Pimenta D C (2005) “Mass spectrometric and high performance liquid chromatography profiling of the venom of the Brazilian vermivorous mollusk Conus regius: feeding behavior and identification of one novel conotoxin” Toxicon 45,113-122 44 Vivek K.V., Keyur B., Hardik B., Utsav P (2013), "Therapeutic potential of snake venom in cancer therapy: current perspectives", Asian Pac J Trop Biomed 3(2), p 156–162 45 Vu T T., Stafford A R., Leslie B.A., Kim P.Y., Fredenburgh J.C., Weitz J.I (2013) "Batroxobin Binds Fibrin with Higher Affinity and Promotes Clot Expansion to a Greater Extent than Thrombin." Journal of Biological Chemistry, 288(23): 16862-16871 46 Vyas V K., K Brahmbhatt, et al (2013) "Therapeutic potential of snake venom in cancer therapy: current perspectives." Asian Pac J Trop Biomed 3(2): 156-162 55 47 Wolf-Eberhard Engelmann (1981) Snakes: Biology, Behavior, and Relationship to Man Leipzig, English version NY, USA 48 Wolins N.E., Quaynor B.K., Skinne J.R (2006) “OP9 mouse stromal cells rapidly differentiate into adipocytes: Characterization of a useful new model of adipogenesis” J Lipid Res 47 450–460 49 Yen C Y., Liang S S., Han L.Y., Chou H.L., Chou C.K., Lin S.R., Chiu C.C., (2013) "Cardiotoxin III inhibits proliferation and migration of oral cancer cells through MAPK and MMP signaling." ScientificWorldJournal, 2013: 650946 50 Young D (1999) “Ophiophagus hannah” Animal Diversity Web the King Cobra is undoubtedly a very dangerous snake ("Behavior" section) 51 Zhang S F., Shi W J., Cheng J.A., Zhang C X., (2003) “Cloning and characterization analysis of the genes encoding precursor of mast cell degranulating peptide from honeybee and wasp species” Acta Gene Sinica 9: 861-866 56 ... Nam Ophiophagus hannah nghiên cứu tác động chúng lên biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3- L1? ?? Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Phân tách riêng rẽ phân đoạn protein nọc rắn O hannah Phân tách phân đoạn peptide có... 41 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên sinh trưởng tế bào mô mỡ 3T3- L1 43 3.5 Ảnh hưởng phân đoạn nọc rắn Ophiophagus hannah lên biệt hóa tế bào 3T3- L1 ... VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Lê Đình Quế PHÂN TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN PROTEIN TỪ NỌC RẮN HỔ VIỆT NAM OPHIOPHAGUS HANNAH VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA CHÚNG LÊN SỰ BIỆT HĨA Ở