VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG THỰC KHUẨN THỂ ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG SỮA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : ThS Nguyễn Hồng Hải SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lê Thị Trang LỚP : 1302 HÀ NỘI – 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC oOo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu, tuyển chọn dòng thực khuẩn thể ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : ThS Nguyễn Hồng Hải SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lê Thị Trang LỚP : 1302 HÀ NỘI – 2017 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, làm việc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội Phòng Vi Sinh – Viện Di truyền Nông Nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ, bảo tận tình từ Thầy Cơ, anh chị bạn bè đồng nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc kính trọng tới Ths Nguyễn Hồng Hải – Viện Di truyền Nông Nghiệp, người tận tình bảo, hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn chú, anh chị cán phòng Công nghệ vi sinh – viện Di truyền nông nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội trang bị cho kiến thức suốt trình học tập tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập trường Cuối tơi xin bày tỏ tình cảm chân thành tới gia đình, bạn bè người thân thiết hết lòng giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập Bước đầu vào thực tế, tìm hiểu lĩnh vực sáng tạo nghiên cứu khoa học, kiến thức hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, tơi mong nhận ý kiến đóng góp quý báu thầy cô bạn để kiến thức tơi lĩnh vực hồn thiện Sinh viên thực Lê Thị Trang SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Mục Lục LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHÊN CỨU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes giới 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes Việt Nam 13 1.2 Vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 15 1.2.1 Cấu trúc 15 1.2.2 Phân loại 18 1.2.3 Đặc tính sinh hóa 19 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 20 1.2.5 Khả lây bệnh 20 1.2.6 Cơ chế gây bệnh 21 1.2.7 Miễn dịch 25 1.3 Tổng quan thực khuẩn thể (Biobacteria Phage) 25 1.3.1 Sơ lược thực khuẩn thể 25 1.3.2 Phương pháp khảo sát thực khuẩn thể 27 1.4 Ứng dụng thực khuẩn thể 28 1.4.1 Ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử 28 1.4.2 Ứng dụng chuẩn đoán dịch tễ học 29 SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học 1.4.3 Ứng dụng bảo quản thực phẩm 29 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu 30 2.1.1 Chủng nghiên cứu 30 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 30 2.1.3 Hóa chất thiết bị 30 2.1.4 Các môi trường sử dụng trình nghiên cứu 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn L monocytogenes (Theo TCVN 6401 : 1998) 33 2.2.2 Phân lập thực khuẩn thể 34 2.2.3 Đánh giá khả kí sinh dòng thực khuẩn thể chủng vi khuẩn gây bệnh khác 34 2.2.4 Đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn thể 35 2.2.5 Nhận dạng thực khuẩn thể giải trình tự gen Lys 35 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh 36 Listeria monocytogenes có sữa 36 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes 37 3.2 Phân lập dòng thực khuẩn thể có khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 40 3.2.1 Phân lập thực khuẩn thể 40 3.2.2 Khả ký sinh dòng TKT chủng L.monocytogenes phân lập 42 3.2.3 Đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn thể 42 3.3 Đánh giá khả kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thực khuẩn thể 43 SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học 3.4 Phân loại dòng thực khuẩn thể triển vọng LM1 44 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa 46 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Tiếng Việt 50 Tiếng Anh 51 Tài liệu Internet 53 SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Cấu trúc kháng nguyên 20 Bảng 2: Nguồn gốc chủng phát triển môi trường chuyên biệt 37 Bảng 3: Kết thử nghiệm sinh lý, sinh hóa chủng phát triển 37 Bảng 4: Nguồn gốc dòng thực khuẩn thể phân lập 40 Bảng 5: Khả ký sinh (tạo vết tan) dòng thực khuẩn thể 42 Bảng 6: Đường kính vòng phân giải vi khuẩn L monocytogenes 42 Bảng 7: Hoạt tính phân giải dòng TKT NA6 vi vi khuẩn gây bệnh 44 Bảng 8: Độ tương đồng đoạn gen dòng TKT LM1 46 Bảng 9: Mật độ dòng TKT LM1 sau 24, 48 nuôi cấy 46 Bảng 10: Mật độ vi khuẩn L monocytogenes sau 24, 48 nuôi cấy 47 SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 15 Hình 2: Màng tế bào vi khuẩn Listeria monocytogenes 16 Hình 3: Lơng roi vi khuẩn Listeria monocytogenes 18 Hình 4: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 18 Hình 5: Cơ chế gây bệnh vi khuẩn Listeria monocytogenes 23 Hình 6: Sự di chuyển vi khuẩn Listeria monocytogenes 24 Hình 7: Ảnh hiển vi điện tử phage bám bề mặt tế bào vi khuẩn (trái); Hình mặt cắt (giữa) hình dạng ngồi phage T2 26 Hình 8: Đốm tan -“plaque”của phage λ vi khuẩn E coli 28 Hình 9: Hình dạng thử nghiệm làm tan máu chủng Listeria monocytogenes 40 Hình 10: Dòng TKT NA6 lập phân mơi trường LEB vi khuẩn .41 Hình 11: Dòng thực khuẩn thể LM1 tách dòng mơi trường TSB 43 Hình 12: Đánh giá khả phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 47 SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngộ độc thực phẩm mối lo ngại nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng giới Nguyên nhân người sử dụng loại thực phẩm bị nhiễm loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố chúng Mặc dù có cơng nghệ đại, phương pháp thực hành sản xuất kiểm soát chất lượng, vệ sinh tốt số lượng trường hợp bị ngộ độc bị bệnh thực phẩm tăng lên suốt thập kỷ qua Tại Việt Nam, theo thống kê Bộ Y tế, tháng đầu năm 2016, nước xảy gần 30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm 1.386 người bị ngộ độc, có trường hợp tử vong Hầu hết bệnh nhân bị ngộ độc ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật E.coli, Listeria, Staphylococcus aureus, Salmonella, Trong vi khuẩn gây bệnh này, Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnh listeriosis vi khuẩn gây bệnh đứng thứ thuộc nhóm B sau Streptococus Ecoli Đồng thời nguồn gây nhiễm bệnh cho người sản phẩm bảo quản lạnh, vi sinh vật có khả tồn tăng trưởng sản phẩm suốt trình bảo quản lạnh Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng phát bệnh người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh triệu chứng lâm sàn biểu Trong Listeria monocytogenes diện với số lượng nhỏ thực phẩm, vào thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ hội Mặc dù bệnh Listeria monocytogenes gây tần số thấp, 2-5 trường hợp triệu người năm, tỉ lệ chết vi khuẩn cao, 25 – 30 % trường hợp tử vong ca nhiễm bệnh Tình hình nhiễm bệnh việc sử dụng chất hóa học để bảo quản thực phẩm chấp nhận nhiều chất bảo quản hóa học làm ảnh hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số chất bảo quản sinh học nay, thực khuẩn thể xem tác nhân phòng trừ SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học sinh học quan trọng thương mại mại hóa để phòng trừ vi khuẩn Listeria monocytogenes quản thực phẩm Chế phẩm LISTEX™ P100 (Micreos) FDA cấp phép cho lưu hành sử dụng năm 2006 chất phụ gia bảo quản thực phẩm dùng để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria Đây chế phẩm có nguồn gốc từ thực khuẩn thể sử dụng rộng rãi Mỹ nước giới mà không gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu ghi nhận sử dụng thực khuẩn thể phòng trừ vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có thực phẩm, đặc biệt có sữa Vì vậy, đề tài thực nhằm “phân lập, tuyển chọn đánh giá hiệu ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn thể nhằm ứng dụng bảo quản sữa.” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Phân lập vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa - Phân lập, tuyển chọn, đánh giá hiệu ức chế dòng thực khuẩn thể tới vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa NỘI DUNG NGHÊN CỨU - Phân lập, tuyển chọn dòng thực khuẩn thể có khả ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes sữa - Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn Phân lập vi khuẩn Listeria monocytogenes - Nghiên cứu đặc điểm sinh lí, hóa sinh dòng thực khuẩn thể tuyển chọn - Phân loại dòng thực khuẩn thể tuyển chọn - Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa SV: Lê Thị Trang Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Bảng 3: Kết thử nghiệm sinh lý, sinh hóa chủng phát triển môi trường Oxford Chủng MC1 MC2 MC3 GL4 GL5 NA6 NA7 NA8 NA9 Thạch Thạch máu mềm 370C, ủở 250C, 254-48h 48h Tan Di máu động hình dù Tan Di máu động hình dù Không Không tan di máu động Tan Di động máu hình dù Tan Di máu động hình dù Tan Di động máu hình dù Khơng Khơng tan di máu động Không Không tan di máu động Tan Di máu động hình dù Soi Thử Thử Canh Canh CAMP canh nghiệm nghiệm XPR, RPR, với S.aureu Catalase Oxidase ủ khuẩn ủở BHI 370C, 370C, ủ R.equi 48 48 250C giờ Chuyển S.aureu(+) + + động xoay R.equi(-) tròn Chuyển S.aureu(+) + + động xoay R.equi(-) tròn Khơng S.aureu(+) chuyển động R.equi(-) + + Chuyển S.aureu(+) động xoay R.equi(-) tròn Chuyển S.aureu(+) + + động xoay R.equi(-) tròn Chuyển S.aureu(+) + + động xoay R.equi(-) tròn Khơng S.aureu(+) chuyển động R.equi(-) Không S.aureu(+) chuyển R.equi(-) động Chuyển S.aureu(+) + + động xoay R.equi(-) tròn Chú thích: + dương tính - âm tính SV: Lê Thị Trang 39 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Kết bảng cho thấy, có chủng vi khuẩn MC1, MC2, GL4, GL5, NA6 NA9 thuộc lồi L Monocytogenes chúng có khả làm tan máu thạch, có khả dao động hình dù mơi trường thạch mền, có khả xoay tròn soi canh khuẩn BHI, dương tính với S.aureu âm tính với R.equi, Catalase dương tính, Oxidase âm tính, canh XPR âm tính canh RPR dương tính Các chủng đươc làm bảo quản cho nghiên cứu Hình 9: Hình dạng thử nghiệm làm tan máu chủng Listeria monocytogene 3.2 Phân lập dòng thực khuẩn thể có khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes 3.2.1 Phân lập thực khuẩn thể Từ 38 mẫu sữa tươi chưa trùng, phomai, sữa chua, thức ăn cho bò, dịch rửa sữa bò bị bệnh viêm vú, tỉnh Hà Nội, Nghệ An, Sơn La, phân lập dòng thực khuẩn thể (TKT) có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes Bảng 4: Nguồn gốc dòng thực khuẩn thể phân lập STT Chủng Nguồn gốc TKT LM1 Mộc Châu, Sơn La + LM2 Mộc Châu, Sơn La + LM3 Gia Lâm, Hà Nội + LM4 Thái Hòa, Nghệ An + SV: Lê Thị Trang 40 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Kết bảng cho thấy, mẫu thu Sơn La có mật độ thực khuẩn thể cao Hà Nội Nghệ An Thực khuẩn thể (bacteriophages) nhân lên tế bào vi khuẩn sống nhạy cảm Vì kích thước khơng cho phép quan sát trực tiếp khơng có kính hiển vi điện tử nên theo dõi hoạt động chúng phương tiện gián tiếp quan sát vùng phân giải vi khuẩn phát triển đĩa thạch Vùng phân giải gọi vết tan hay gọi đốm tan (plaque), tạo thành tế bào vi khuẩn bị nhiễm bacteriophages phân giải phóng thích nhiều hạt bacteriophages mới, bacteriophages liền xâm nhiễm tế bào vi khuẩn kế cận Quá trình lặp lại phát triển vi khuẩn đĩa thạch ngừng lại hết thức ăn Những vết tan tách khỏi đĩa thạch, ly tâm thu thực khuẩn thể nghiên cứu Hình 10: Dòng TKT NA6 lập phân môi trường LEB vi khuẩn ký chủ Listeria monocytogenes SV: Lê Thị Trang 41 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học 3.2.2 Khả ký sinh dòng TKT chủng L.monocytogenes phân lập Bảng 5: Khả ký sinh (tạo vết tan) dòng thực khuẩn thể Chủng vi Thực khuẩn thể khuẩn LM1 LM2 LM3 LM4 MC1 + + - - MC2 + - + - GL4 + - - + GL5 - + - + NA6 + - - - NA9 + + - + Chú thích: + Có ký sinh - Không ký sinh Kết bảng cho thấy dòng TKT có khả ký sinh chủng vi khuẩn L.monocytogenes phân lập với mức độ khác Trong số dòng TKT này, dòng LM1 có tỉ lệ ký sinh cao thấp dòng LA3 Vi khuẩn bị thực khuẩn thể ký sinh NA6 3.2.3 Đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn thể Các thực khuẩn thể phân giải vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sau phân tách, làm dùng để đánh giá khả tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh dựa vào đường kính vòng phân giải (vết tan) Bảng 6: Đường kính vòng phân giải vi khuẩn L monocytogenes dòng thực khuẩn thể Dòng TKT Đường kính phân giải (mm) 12 24 36 48 LM1 2,1 5,3 8,6 13,8 LM2 1,7 5,0 8,2 11,3 LM3 1,6 3,8 6,9 8,9 LM4 1,8 5,1 7,3 10,5 SV: Lê Thị Trang 42 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Kết bảng cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh L monocytogenes dòng thực khuẩn thể: LM1, LM2, LA3 LM4 tăng dần theo thời gian thời điểm khảo sát 12 giờ, 24 giờ, 36 48giờ Tại thời điểm 48 hoạt tính kháng khuẩn dòng TKT cao (đường kính vòng phân giải từ 8,9 mm13,8 mm), dòng TKT LM1 LM2 có hoạt tính tốt dòng TKT lại (13,8 mm 11,3 mm) dòng TKT LM4 thấp (8,9 mm) Dòng LM1 phân lập từ sữa tươi chưa trùng LM2 phân lập từ thức ăn cho bò Kết cho thấy dòng TKT LM1 có triển vọng để sử dụng bảo quản sữa tươi nguyên liệu có nhiễm vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes Hình 11: Dòng thực khuẩn thể LM1 tách dòng môi trường TSB vi khuẩn ký chủ 3.3 Đánh giá khả kháng số vi khuẩn gây bệnh dòng thực khuẩn thể Hiện tượng thực khuẩn thể nói chung thường đặc hiệu (một vi khuẩn bị thực khuẩn thể tương ứng làm tan mà thơi) Cấu tạo hóa học chủ yếu thực khuẩn thể AND protein Nó có cấu tạo kháng nguyên đặc hiệu riêng cho loại Thực khuẩn thể nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuẩn Trước tiên thực khuẩn thể bám vào tế bào vi khuẩn bề mặt cuối đuôi, màng vi khuẩn bị thủy phân AND chứa đầu thực khuẩn thể bơm vào tế bào vi khuẩn Việc tổng hợp AND, ARN protein vi khuẩn SV: Lê Thị Trang 43 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ sinh học bị đình tức khắc, việc tổng hợp AND protein thực khuẩn thể bắt đầu Các thí nghiệm hóa học sinh vật cho thấy khả tổng hợp tế bào vi khuẩn giữ nguyên vẹn mức độ động viên lượng, việc kiểm sốt tổng hợp quyền hướng dẫn AND thực khuẩn thể, dẫn tới nhân lên thành phần đơn vị thực khuẩn thể, cuối chúng tự xếp lại thành hạt thực khuẩn thể hoàn chỉnh phá vỡ vi khuẩn chứa Các thực khuẩn thể vừa giải phóng lại tìm đến ký sinh vào tế bào vi khuẩn khác lại tiếp tục xảy loạt trình nói Dòng TKT LM1 có hoạt tính phân giải khả ký sinh cao nên chọn để đánh giá hoạt tính phân giải vi khuẩn gây bệnh loài (vi khuẩn chủ) loại vi khuẩn gây bệnh loài khác Bảng 7: Hoạt tính phân giải dòng TKT NA6 vi vi khuẩn gây bệnh Chủng vi khuẩn Hoạt tính phân giải Staphylococus aureus + S aureus SA018 + Staphylococus - epidermidis Listeria monocytogenes - E coli - Salmonella enteritidis - Chú thích: - khơng có hoạt tính + có hoạt tính Kết bảng cho thấy, dòng TKT NA6 có hoạt tính phân giải với vi khuẩn chủ mà khơng có hoạt tính với vi khuẩn khác, đặc biệt vi khuẩn Gram âm 3.4 Phân loại dòng thực khuẩn thể triển vọng LM1 Dòng thực khuẩn thể LM1 có hoạt tính phân giải vi khuẩn gây bệnh L Monocytogenes cao dòng có khả ký sinh nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh lồi Đây dòng có triển vọng ứng dụng thực tế nên dòng giải trình từ gen cho nghiên cứu SV: Lê Thị Trang 44 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Cơng Nghệ sinh học Trình tự nucleotide dòng thực khuẩn thể LM1 CATATGACGAGCTACTACTACAGCCGTAGCCTGGCGAACGTT AACAACTGGCGGATAACACTAAAGCGGCGCGTCGTAAACTGCTGG ATTGGTCTGAATCTAACGGTATCGAAGTTCTGATCTACGAAACCAT ACGTACCAAAGAACAGCAGGCGGCGAACGTTAACTCTGGTGCTAG CCAGACCATGCGTAGCTACCACCTGGTTGGTCAGGCTCTGGATTTC GTGATGGCTAAAGGTAAAACCGTTGATTGGGGCGCGTACCGTAGT GATAAAGGTAAAAAATTTGTAGCTAAAGCTAAATCTTTAGGTTTTG AATGGGGCGGTGATTGGTCAGGTTTTGTTGATAATCCGCACCTGCA GTTTAATTATAAAGGTTACGGTACCGATACCTTCGGTAAAGGCGCC AGCACCTCTAACAGCAGCAAACCGAGCGCGGATACCAACACCAAC TCTCTGGGTCTGGTTGATTACATGAACCTGAACAAACTGGATTCTA GCTTCGCGAACCGTAAAAAACTGGCGACCTCTTACGGTATCAAAA ACTACTCTGGTACCGCGACCCAGAACACCACCCTGCTGGCGAAAC TGAAAGCGGGTAAACCGCACACCCCGGCGTCTAAAAACACCTACT ACACCGAAAACCCGCGTAAAGTTAAAACCCTGGTTCAGTGCGATC TGTACAAAAGCGTTGATTTCACCACCAAAAACCAGACCGGTGGTA CCTTCCCTCCTGGCACCGTTTTCACCATTTCTGGTATGGGTAAAAC CAAAGGCGGTACCCCGCGTCTGAAAACCAAATCTGGTTACTACCT GACCGCTAACACCAAATTCGTTAAAAAGATCCTCGAG So sánh trình tự ngân hàng liệu NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng dòng TKT LM1 Kết cho thấy dòng TKT LM1 có độ tương đồng tới ≥98% với Listeria phages như: WSLC 1118 PSA SV: Lê Thị Trang 45 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Bảng 8: Độ tương đồng đoạn gen dòng TKT LM1 Dòng Chiều dài trình tự Dòng bacteriophage tương Mức độ tương TKT so sánh (nu) đồng đồng (%) Listeria phages WSLC 1118 100 Listeria phages PSA 98 LM1 851 Theo liệu NCBI thông tin dòng bacteriophage Listeria phages WSLC 1118 Listeria phages PSA cho thấy dòng phage có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh L.monocytogenes cao 3.5 Đánh giá hoạt tính kháng thực khuẩn thể với vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có sữa Các nghiên cứu thực khuẩn thể độc lực cho thấy thực khuẩn thể nhân lên ký sinh vào tế bào vi khuẩn Theo nghiên cứu Iriarte ctv., 2007 cho thấy nhiệt độ, độ ẩm, yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến lớn đến tuổi thọ thực khuẩn thể Dòng TKT NA6 có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế nên chọn để đánh giá khả tồn NA6 hoạt tính phân giải với vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes (chủng NA9) môi trường sữa tươi nguyên liệu Bảng 9: Mật độ dòng TKT LM1 sau 24, 48 ni cấy Thời gian nuôi cấy (giờ) Mật độ TKT (pfu/ml) Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy 24 1,7x102 5,3x106 48 1,7x102 2,9x108 SV: Lê Thị Trang 46 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Hình 12: Đánh giá khả phát triển hoạt tính dòng TKT NA6 Bảng 10: Mật độ vi khuẩn L monocytogenes sau 24, 48 nuôi cấy Mật độ vi khuẩn (cfu/ml) Thời gian nuôi cấy (giờ) Trước nuôi cấy Sau nuôi cấy Đối chứng 24 1,8x107 3,2x103 5,3x109 48 1,8x107 2,9x102 7,1 x1011 Vì thí nghiệm đánh sữa tươi ngun liệu có độ đục nên khơng đo OD mà phải cấy trang đếm mật độ với vi khuẩn gây bệnh môi trường chọn lọc Theo kết bảng cho thấy mật độ thực khuẩn thể NA6 tăng lên sau 24 48 ni cấy Hoạt tính kháng dòng TKT NA6 thể bảng 10 qua giảm mật độ vi khuẩn gây bệnh Mật độ vi khuẩn giảm chứng tỏ khả tiêu diệt vi khuẩn TKT cao Theo kết bảng 10, mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt sau 24 48 nuôi cấy TKT, đối chứng (chỉ nuôi cấy vi khuẩn môi trường phù SV: Lê Thị Trang 47 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học hợp) mật độ vi khuẩn tăng cao Điều cho thấy dòng TKT NA6 có khả tiêu diệt vi khuẩn chủ, vi khuẩn gây bệnh cao có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế SV: Lê Thị Trang 48 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập làm chủng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes từ nguồn sữa tươi nguyên liệu, mai, thức ăn cho bò… tỉnh thành Sơn La, Hà Nội Nghệ An - Đã phân lập dòng thực khuẩn thể Trong dòng TKT NA6 có hoạt tính tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes cao TKT có khả ký sinh nhiều chủng vi khuẩn chủ gây bệnh - Giải trình tự gen dòng thực khuẩn thể LM1và so sánh NCBI chương trình BLAST để xác định mức độ tương đồng dòng TKT NA6 Kết cho thấy dòng TKT NA6 có độ tương đồng tới ≥98% Listeria phages WSLC 1118 Listeria phages PSA 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu dòng thực khuẩn thể, đặc biệt dòng TKT LM1 để ứng dụng bảo quản sữa bảo quản thực phẩm SV: Lê Thị Trang 49 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ: Nghiên cứu sử dụng hydrogen peroxyde để bảo quản sữa tươi” (2007) Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thị Lâm Đồn, Học viện Nơng nghiệp chủ trì Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010) Tách dòng biểu gen mã hố protease serine chủng Bacillus subtilis HT24 Escherichia coli Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (3A), 841-846 Lê Huy Chính (2001), Vi sinh y học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Việt Mẫn (2013) Giáo trình cơng nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống pha chế, Tập 1, Công nghệ sản xuất sữa NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Việt Mẫn (2013) Giáo trình cơng nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống pha chế, Tập 1, Công nghệ sản xuất sữa NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn Bùi Thị Kim Dung (2005), Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ Tp.Hồ Chí Minh năm 2002-2004, Trung tâm Y tế dự phòng Tp.Hồ Chí Minh, Thơng tin khoa học, Cục An toàn vệ sinh Thực phẩm Nguyễn Văn Hiếu, Phí Quyết Tiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010) Tách dòng biểu gen mã hố protease serine chủng Bacillus subtilis HT24 Escherichia coli Tạp chí Công nghệ Sinh học, (3A), 841-846 SV: Lê Thị Trang 50 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Tiếng Anh Borysowski, J., Weber-Dabrowska, B., & Gorski, A (2006) Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents Experimental Biology Medicine (Maywood), 231, 366-377 Briers Y, Walmagh M, Lavigne R Use of bacteriophage endolysin EL188 and outer membrane permeabilizers against Pseudomonas aeruginosa J Appl Microbiol 2011; 110(3):778–785 Briers, Y., Volckaert, G., Cornelissen, A., Lagaert, S., Michiels, C W., Hertveldt, K., et al (2007) Muralytic activity and modular structure of the endolysins of Pseudomonas aeruginosa bacteriophages phiKZ and EL Molecular Microbiology, 65, 1334-1344 Diaz E, Lopez R, Garcia JL Chimeric phage-bacterial enzymes: a clue to the modular evolution of genes Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87(20):8125–8129 Fischetti, V A (2004) The use of phage lytic enzymes to control bacterial infections In E S Kutter (Ed.), Bacteriophages: Biology and applications (pp 321-334), Boca Raton - Florida Kretzer, J W., Lehmann, R., Schmelcher, M., Banz, M., Kim, K P., Korn, C., et al (2007) Use of high-affinity cell wall-binding domains of bacteriophage endolysins for immobilization and separation of bacterial cells Applied and Environmental Microbiology, 73, 19922000 Lai MJ, Lin NT, Hu A, et al Antibacterial activity of Acinetobacter baumannii phage varphiAB2 endolysin (LysAB2) against both Grampositive and Gram-negative bacteria Appl Microbiol Biotechnol 2011; 90(2):529–539 SV: Lê Thị Trang 51 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học Liu, B., Wu, S., Song, Q., Zhang, X., & Xie, L (2006) Two novel bacteriophages of thermophilic bacteria isolated from deep-sea hydrothermal fields Current Microbiology, 53, 163-166 Loessner, M.J., 2005 Bacteriophage endolysins current state of research and applications Current Opinion in Microbiology 8, 480-487 10 Mayer, M J., Payne, J., Gasson, M J., & Narbad, A (2010) Genomic sequence and characterization of the virulent bacteriophage phiCTP1 from Clostridium tyrobutyricum and heterologous expression of its endolysin Applied and Environmental Microbiology, 76, 5415-5422 11.Oliveira, H., Azeredo, J., Lavigne, R., and Kluskens, L D (2012) Bacteriophage endolysins as a response to emerging foodborne pathogens Trends Food Sci Technol 28, 103–115 doi: 10.1016/j.tifs.2012.06.016 12.Schmelcher M, Shabarova T, Eugster MR, et al Rapid multiplex detection and differentiation of Listeria cells by use of fluorescent phage endolysin cell wall binding domains Appl Environ Microbiol 2010; 76(17):5745–5756 13.Tamakoshi, M., Murakami, A., Sugisawa, M., Tsuneizumi, K., Takeda, S., Saheki, T., et al (2011) Genomic and proteomic characterization of the large Myoviridae bacteriophage varphiTMA of the extreme thermophile Thermus thermophilus Bacteriophage, 1, 152-164 14.Turner MS, Waldherr F, Loessner MJ, Giffard PM Antimicrobial activity of lysostaphin and a Listeria monocytogenes bacteriophage endolysin produced and secreted by lactic acid bacteria Syst Appl Microbiol 2007; 30(1):58–67 15.William Burrows, Rippon(1968) Fex Robert book Murdoch of Lewert, microbiology- John The Willarel pathogenic Microorganisms SV: Lê Thị Trang 52 Lớp: ĐH 13-02 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ sinh học 16.Zhang, H., Bao, H., Billington, C., Hudson, J A., & Wang, R (2012) Isolation and lytic activity of the Listeria bacteriophage endolysin LysZ5 against Listeria monocytogenes in soya milk Food Microbiology, 31, 133-136 Tài liệu từ Internet http://vietq.vn/ngo-doc-thuc-pham-gan-1400-nguoi-mac-chi-trong-4thang-dau-nam-d90443.html http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/130907vikhuanlisteria.htm SV: Lê Thị Trang 53 Lớp: ĐH 13-02 ... vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes có thực phẩm, đặc biệt có sữa Vì vậy, đề tài thực nhằm “phân lập, tuyển chọn đánh giá hiệu ức chế vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes dòng thực khuẩn. .. gây bệnh Listeria monocytogenes sữa NỘI DUNG NGHÊN CỨU - Phân lập, tuyển chọn dòng thực khuẩn thể có khả ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes sữa - Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria. .. khuẩn thể nhằm ứng dụng bảo quản sữa. ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Phân lập vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes sữa - Phân lập, tuyển chọn, đánh giá hiệu ức chế dòng thực khuẩn thể tới vi khuẩn gây