VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus -Người hướng dẫn : TS Bạch Thị Mai Hoa Sinh viên : Nguyễn Thị Hà Lớp : 1302 Hà Nội-2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: : NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus Người hướng dẫn : TS Bạch Thị Mai Hoa Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hà Lớp : 1302 Hà Nội-2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở LỜI CẢM ƠN Để thực tốt đề tài nghiên cứu này, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ tận tình từ phía gia đình, thầy bạn bè Trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn tới TS Bạch Thị Mai Hoa người hướng dẫn chính, người thầy tận tâm định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi mong muốn gửi lời càm ơn chân thành tới cán bộ, nhân viên, sinh viên thực tập phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình nghiên cứu đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn người thân gia đình, cảm ơn anh chị em, bạn bè ln động viên, khích lệ tạo động lực cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hà Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Lysinibacillus Lysinibacillus sphaericus 1.1.1 Lysinibacillus 1.1.2 Lysinibacillus sphaericus 1.2 Giới thiệu collagen 1.2.1 Collagen 1.2.2 Ứng dụng collagen 1.3 Collagenase 12 1.3.1 Đặc điểm collagenase 12 1.3.2 Những nghiên cứu Việt Nam giới collagenase 14 1.3.3 Ứng dụng collagenase 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Chủng vi sinh vật 19 2.1.2 Hóa chất sử dụng 19 2.1.3 Môi trường 20 2.1.4 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng tái tổ hợp 21 2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH thời gian lên khả sinh tổng hợp collagenase chủng tái tổ hợp 22 2.2.3 Tách DNA plasmid 22 2.2.4 Biến nạp E coli phương pháp sốc nhiệt 23 2.2.5 Phương pháp khuếch đại gen col 23 2.2.6 Tinh collagenase tái tổ hợp 24 2.2.7 Phương pháp định hoạt tính enzyme 25 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở 2.2.8 Phương pháp zymogram gelatine 27 2.2.9 Phương pháp sắc ký protein polyacrylamid 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Đặc điểm sinh học chủng tái tổ hợp 29 3.2 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 31 3.2.1 Ảnh hưởng pH 31 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động collagenase 32 3.2.3 Động thái sinh tổng hợp collagenase chủng vi khuẩn 34 3.3 Tinh collagenase 36 3.4 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh collagenase tái tổ hợp 41 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố pH, nhiệt độ, ion kim loại chất ức chế lên hoạt động enzyme tinh 42 3.5.1 Ảnh hưởng pH 42 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động collagenase 43 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế lên hoạt động collagenase tinh 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết Luận 46 Kiến Nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 52 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số collagenase từ nguồn khác nghiên cứu 13 Bảng 2: Danh mục xuất xứ hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3: Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 4: Ảnh hưởng pH lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp collagenase chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 32 Bảng 5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng tổng hợp collagenase chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 33 Bảng 6: Giá trị Km V max collagenase chất khác 42 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram L Sphaericus Hình 2: Cấu trúc collagen Hình 3: Cấu trúc tropocollagen Hình 4: Đường chuẩn protein 25 Hình 5: Đường chuẩn Leucine 26 Hình 6: Hình ảnh điện di vector pIN III ompA, col pIN III ompA col agarose 1% Băng 1: pIN III ompA; Băng 2: col; Băng 3: col cắt với enzym giới hạn BamHI NotI; Băng 4: pIN III ompA- col 29 Hình 7: Đặc điểm nuôi cấy của chủng tái tổ hợp chủng vi khuẩn mang vector pIN III ompA mơi trường LB có bổ sung 1% casein, gelatin collage 30 Hình 8: Khả thủy phân chất casein, gelatin collagen dịch phá vỡ tế bào BL21(DE3) pIN III ompA- col 31 Hình 9: Định tính collagenase dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác 34 Hình 10: Động thái lên men chủng BL21 PinIII ompiA-col 35 Hình 11 : Định tính collagenase dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp thời gian nuôi cấy khác 36 Hình 12 Kiểm tra khả biểu COL SDS-PAGE Giếng 1: 10 g protein BL21(DE3) PIN III ompA Giếng 2: 20 g protein pha không tan BL21(DE3) PIN III ompA- col Giếng 3: 10 g protein pha tan BL21(DE3) PIN III ompA- col Giếng 4: Broad ranger protein marker 37 Hình 13: Quy trình tinh collagenase 38 Hình 14: Định tính phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp 40 Hình 15: Kết zymogram gelatin phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp 41 Hình 16 : Ảnh hưởng pH đến hoạt động collagenase 43 Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động collagenase 44 Hình 18: Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt động collagenase 45 Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở ĐẶT VẤN ĐỀ Collagen chiếm 30% thành phần protein cấu trúc thể động vật đến 70% cấu trúc da, chất bền khó phân giải số protein Chỉ có collagenase enzyme có khả phân giải collagen chất trạng thái siêu xoắn Bởi enzyme có hoạt tính protease, gelatinase biểu khả phân cắt procollagen gelatin Trong nhiều protease, gelatinase nghiên cứu lại khơng có khả phân cắt bó sợi collagen dạng hòa tan khơng hòa tan Việc nghiên cứu sản xuất collagenase trở nên vô hấp dẫn đặc biệt năm gần collagen ngày có nhiều ứng dụng lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, thẩm mỹ, sản phẩm chăm sóc sức khỏe Collagenase có khả phân cắt đoạn collagen, thành đoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian phân cắt, hiệu suất thu hồi cao, sản phẩm collagen có tính hòa tan cao, bảo toàn đặc điểm sinh học thân thiện với mơi trường Collagenase từ vi khuẩn có khả phân cắt hầu hết loại collagen nhiều vị trí sợi collagen Các collagenase hầu hết có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho người nên cần có thận trọng việc ứng dụng rộng rãi sản phẩm dành cho người Lysinibacillus sphaericus nhóm có khả sinh collagenase cao chưa nghiên cứu rộng rãi thơng tin trình tự gene mã hóa collagenase hệ gene công bố, đặc biệt chúng không mang trình tự mã hóa protein gây bệnh Đây ưu điểm sử dụng enzyme từ vi khuẩn tạo sản phẩm collagen không chứa tác nhân gây miễn dịch hay dị ứng Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Vì chúng tơi tiến hành đề tài : “ Nghiên cứu so sánh đặc điểm sinh hóa cllagenase tái tổ hợp từ chủng Lysinibacillus sphaericus ”với mục tiêu : Nghiên cứu thu nhận tinh collagenase từ chủng vi khuẩn Xác định đặc điểm sinh hóa collagenase tái tổ hợp Đề tài thực Phòng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam Lý lựa chọn nghiên cứu collagenase từ vi khuẩn collagenase từ vi khuẩn có khả phân cắt loại collagen hòa tan khơng hòa tan với hiệu suất thu hồi cao Bên cạnh collagenase từ vi khuẩn enzyme có khả phân cắt collagen type I, collagen type II mà collgen type I collagen type II chiếm đến 70% tổng số loại collagen nghiên cứu Trong prokaryote collagenase eukaryote collagen khơng có khả phân cắt hai loại collagen Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Lysinibacillus Lysinibacillus sphaericus 1.1.1 Lysinibacillus Lysinibacillus thuộc họ Bacillaceae Trước coi thành viên chi Bacillus Nhưng đến năm 2007 dựa vào trình tự rARN đổi thành chi Lysinibacillus So với Bacillus sp Lysinibacillus sp chứa lysine aspartate peptidoglycan, khác với Bacillus sp diaminopimelic acid Lysinibacillus thường tìm thấy đất, nước bùn số mô thực vật Chủng phân lập từ sản phẩm giống trồng lên men trí từ mẫu gan cá [1] Lysinibacillus thường sống yếm khí tùy tiện, nhiên điều kiện định sống kỵ khí 1.1.2 Lysinibacillus sphaericus Lysinibacillus sphaericus trực khuẩn Gram dương (hình 1), hình que sinh nội bào tử hình elip hình cầu, thuộc chi Lysinibacillus, có tên khác Bacillus sphaericus ( NCBI genome project entez) Sự thay đổi tên đề xuất Ahmet I năm 2007 dựa thành phần đặc biệt peptidoglycan thành tế bào, phân tích đặc điểm sinh lý L sphaericus [2] Nguyễn Thị Hà 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Dịch protein tổng thu nhận sau chủng E coli BL21(DE3) PIN III ompA- col cảm ứng biểu ly giải sóng siêu âm Dịch protein sử dụng làm nguồn nguyên liệu để tinh col tái tổ phương pháp phân tách protein dựa vào khích thước khối lượng phân tử chạy cột sắc ký Sephadex G150 Khi lọc chiết dung dịch đệm tris HCl pH 7.5 sử dụng, phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở muối) khuếch tán chậm chạp qua lỗ nhỏ hạt Sephadex bị trương phồng, chất có trọng lượng phân tử lớn collagenase khơng có khả vào mà lách nhanh qua hạt sephadex chiết nhanh khỏi cột Vì ta tách chất có trọng lượng phân tử cao khỏi cột gel trước so với chất có phân tử lượng nhỏ Kết tinh enzyme thể qua hình 14 15 Các phân đoạn từ đến 20 phân đoạn có hoạt tính collagenase Chúng tiến hành chạy zymogram gelatin từ phân đoạn 1-30 để kiểm tra hoạt tính độ tinh phân đoạn SDS – PAGE Nhưng kết gel SDS PAGE không rõ ràng luận văn Tuy nhiên phân đoạn chạy cột phân đoạn 10-16 collagenase thu tinh khoảng 70% Enzyme phân đoạn dùng cho nghiên cứu Nguyễn Thị Hà 39 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hình 14: Định tính phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp Nguyễn Thị Hà 40 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hình 15: Kết zymogram gelatin phân đoạn tinh collagenase tái tổ hợp 3.4 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh collagenase tái tổ hợp Giá trị Km thể lực enzyme với chất, giá trị Km nhỏ lực liên kết enzyme với chất lớn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn Theo kết bảng Km collagenase với casein nhỏ lớn so với Km collagen gelatin; Vmax casein nhanh so với collagen gelatin Nguyên nhân khác biệt cấu trúc casein đơn giản, trọng lượng nhỏ 28 – 30 kDa; gelatin có trọng hượng khoảng 95 kDa collagen có cấu trúc siêu xoắn Tuy nhiên, Km collagen gelatin khơng có khác biệt nhiều trình tự axit amin collagen gelatin giúp enzyme nhận biết không khác Nguyễn Thị Hà 41 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Bảng 6: Giá trị Km V max collagenase chất khác Cơ chất Km (%) Vmax Collagen 11.347 ± 4.675 0.0183 ± 0.0037 Gelatin 11.122 ± 3.865 0.0489 ± 0.0065 Casein 1.434 ± 0.142 0.1133 ± 0.0003 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố pH, nhiệt độ, ion kim loại chất ức chế lên hoạt động enzyme tinh 3.5.1 Ảnh hưởng pH Hoạt độ enzyme phụ thuộc vào pH mơi trường, pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc R amino acid phân tử collagenase, ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động, ion hóa chất Kết khảo sát hoạt động collagenase tinh điều kiện pH khác từ đến (5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9) cho thấy enzyme hoạt động tốt khoảng pH từ 6.5 với hoạt tính 191,54 U/mg Ở pH collagenase 98% hoạt tính pH pH 5,5 hoạt tính collagenase gần hồn tồn Nguyễn Thị Hà 42 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Ảnh hưởng pH đến hoạt động collagenase Hoạt tính (U/mg) 250 191.15 200 150 100 61.75 50 0.05 5.445 5.5 6.0 30.82 24.92 7.5 6.5 pH Hình 16 : Ảnh hưởng pH đến hoạt động collagenase 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động collagenase Bản chất collagenase protein, nên khác với phản ứng hóa học, hoạt độ collagenase tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, mà nhiệt độ chưa làm ảnh hưởng đến cấu trúc collagenase Sau khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt động enzyme điều kiện nhiệt độ khác (10, 20, 30, 37 45°C) cho thấy collagenase hoạt động khoảng nhiệt độ từ 10°C đến 45°C, hoạt động tối ưu 30°C với hoạt tính 156.3 U/mg Collagenase hoạt tính hồn tồn nhiệt độ < 4oC > 45oC (Hình 17) Nguyễn Thị Hà 43 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hoạt tính (U/mg) Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động collagenase 200 156.3 150 94.415 100 50 81.72 40.115 24.03 10 20 30 37 45 Nhiệt độ Hình 17: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động collagenase 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế lên hoạt động collagenase tinh Các ion kim loại chất ức chế có vai trò quan trọng hoạt tính xúc tác enzyme Các ion kim loại chất ức chế làm thay đổi trung tâm hoạt động enzyme làm thay đổi cầu nối disunphit enzyme ảnh hưởng đến bắt cặp chất enzyme Hoạt tính enzyme tăng lên giảm chí bất hoạt tùy vào ion kim loại chất ức chế Sự diện ion Zn hỗn hợp phản ứng giúp nâng cao hoạt tính collagenase gấp 1,24 lần từ 100,5 U/mg lên 125,115 U/mg Sự diện ion Ca , Fe , EDTA làm giảm hoạt tính collagenase từ 25% đến 66% Khi bổ sung Cu cystein vào hỗn hợp phản ứng ức chế hoàn toàn hoạt động collagenase Nguyễn Thị Hà 44 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt động collagenase Hoạt tính (U/mg) 140 125.115 120 100.5 100 75.51 80 72.165 60 34.015 40 20 0 Cu2+ Ca2+ Fe2+ Zn2+ EDTA Cystein Đối chứng Ion kim loại chất ức chế Hình 18: Ảnh hưởng ion kim loại chất ức chế đến hoạt động collagenase Nguyễn Thị Hà 45 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận Đã lựa chọn điều kiện sinh tổng hợp collagenase chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) PIN III ompA col môi trường LB có bổ sung 1% collagen, pH 7.5 ampicillin nồng độ 100 µM, IPTG 50 µM, lên men nhiệt độ tối ưu 30oC, sau 28 h thu hồi sinh khối Đã nghiên cứu quy trình thu nhận collagenase tái tổ hợp từ chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) PIN III ompA col cột sắc ký Sephadex G150, thu hồi collagenase có độ tinh khoảng 70% phân đoạn 10 - 16 Đã nghiên cứu đặc điểm hoá sinh collagenase tái tổ hợp Dung dịch đệm Tris HCl pH 6.5 nhiệt độ phản ứng 30oC điều kiện tối ưu cho khả phân cắt chất collagenase tái tổ hợp Sự diện ion Zn hỗn hợp phản ứng giúp nâng cao hoạt tính collagenase Kiến Nghị Tối ưu codon để làm tăng khả biểu tế bào E coli collageanase tái tổ hợp Sử dụng collagenase tái tổ hợp để phân cắt collagen từ phụ phẩm công nghiệp nhằm tách chiết collagen type I, II dùng ứng dụng y học Nguyễn Thị Hà 46 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Wang J, Fan Y, Yao Z (2010), “Isolation of a Lysinibacillus fusiformis strain with tetrodotoxin-producing ability from puffer fish Fugu obscurus and the characterization of this strain”, Toxicon, 56(4), 640-3 [2] Ahmet I , A Yokota , Ayamazoe and T Fujiwara (2007), “Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen nov sp nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb Now And Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb nov.", Int J Syts Evol Microbiol, 57( pt5) pp 1117-1125 [3] Hu X., W Fan , B Han , H Liu., D Zeng., Q Li., W Dong., J Yan., M Gao., C Berry an Z Yuan (2008), “Complete genome sequence of the mosquitocidal bacterium Bacillus sphaericus C3-4 l and comparison with those of closely ralated Bacillus species”, J Bacteriol, 190 (8), pp.28922902 [4] Priest F G., M Goofellow and C Todd (1988), “A numerical classification of genus Bacillus”, J Gen Microbiol, 134(7),pp.1847-1882 [5] Pena- Montenegro T D., J Dusan (2013), “Genome sequence and description of the heavy metal tolerant bacterium Lysinibacillus sphaericus strain OT4b.31”, Stand Genomic Sci, 9(1),pp.42-56 [6] Haper E., Seifter S and Hospelhorn V.D.(1965), "Evidence for subunits in bacterial collagenase", Biochem Biophys Res Commun, 18,pp.627-632 [7] Schaub B.C., Strauch L 1965), Evidence for a new bacterial collagenolytic enzyme, Biochem Biophys Res Commun, 21(1),pp.34-39 [8] Sugasawara R.Bond M.D and Van Wart H.E (1985), “Substrate specificity of beta-collagenase from Clostridium histolyticum”, J Biol Chem, 206(5),pp 2771-2775 Nguyễn Thị Hà 47 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp [9] Viện Đại học Mở Sugasawara R., Harper E (1984), “Purification and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum”, Biochemistry, 23(22), pp 5175-5181 [10]Carrick L Jr., and Berk R.S (1975), “Purification and characterization of acollagenolytic enzyme from Pseudomonas aeruginosa” Biochimica and Biophysica Acta (391), pp.422–434 [11] Merkel J R., Dreisbach J H and Ziegler H B (1975), “Collagenolytic activity of some marine bacteria”, Appl Microbiol, 29(2), pp.145-15 [12] Merkel J.Ra., Dreisbach J.H (1978), “Purification and characterization of a marine bacterial collagenase”, Biochemistry, 17(14), pp 2857-2863 [13] Demina N S., Lysenko S V 1996), “Collagenolytic enzymes synthesized by microorganisms”, Mikrobiologiia, 65(3), pp.293-304 [14] Nagano H., To K A (2000), Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2, Biosci Biotechnol Biochem, 64(1), pp.181-183 [15] Takeuchi H., Shibano Y., Morihara K., Fukushima J., Inami S., Keil B., Gilles AM., Kawamoto S and Okuda K (1992), “Structural gene and complete amino acid sequence of Vibrio alginolyticus collagenase”, Biochem J, 281(pt3), pp.703-708 [16] Juarez Z E., Stinson M W (1999), “An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collage analogues”, Infect Immun, 67 (1), pp 271-278 [17] Petrova D H.Shishkov S A and Vlahol SS (2006), “Novel thermostable serine collagenase from Thermoactinomyces sp 21E: purification and some properties”, J Basic Microbiol, 46(4), pp.275-285 Nguyễn Thị Hà 48 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở [18] Grab D J., Kennedy R and Philipp M T (1996), “Borrelia burgdorferi possesses a collagenolytic activity”, FEMS Microbiol Lett, 144(1),pp.39-45 [19] Krepel C J., Gohr C M., Walker A P., Farmer S G and Edmiston CE (1992), “Enzymatically active Peptostreptococus magnus: association with site of infection”, J Clin Microbiol, 30(9),pp.2330-2334 [20] Despres S., Metivier H and Weill R (1980), "Degradation of collagen by the cariogenic bacteria, Streptococcus mutans'', C R Seances Acad Sci D, 290 (1) pp.41- 44 [21] Molla A., Matsumoto K., Oyamada I., Katsuki T and Maeda H (1986), “Degradation of protease inhibitors, immunoglobulins, and other serum proteins by Serratia protease and its toxicity to fibroblast in culture”, Infect Immun, 53(3), pp 522-529 [22] Hausmann E., Kaufman E (1969), "Collagenase activity in a particulate fraction from Bacteroides melaninogenicus" Biochim Biophys Acta, 194(2), pp.612-615 [23] Liu L., Ma M., Yu X and Wang W (2010), “Screening of collagenase-producing strain and purification of Bacillus cereus collagenase”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 2602), pp.194-200 [24] Matsushita O., Yoshihara K., Katayama S., Minami J and Okabe A (1994), “Purification and characterization of Clostridium perfringens 120- kilodalton collagenase and nucleotide sequence of the corresponding gene” , J Bacteriol, 176(l), pp.149-156 [25] Sakurai Y., Inoue H Nishii w., Takahashi T lino Yamamoto M and Takahashi K (2009), “Purification and characterization of a major collagenase from Streptomyces parvulus”, Biosci Biotechnol Biochem, 73(1),pp 21-28 [26] Teramura N., Tanaka K., lijima K., Hayashida O., Suzuki K., Hattori S and Irie S (2011), “Cloning of a novel collagenase gene from the Nguyễn Thị Hà 49 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở gram-negative bacterium Grimontia (Vibrio) hollisae 1706B and its efficient expression in Brevibacillus choshinensis”, J Bacteriol, 193(12), pp.3049-3056 [27] Yu M s., Lee C Y (1999), “Expression and characterization of the prtV gene encoding a collagenase from Vibrio parahaemolyticus in Escherichia coli”, Microbiology, 145(pt1), pp.143-150 [28] Yhakoda, Y Ito, A Nagate, K Utssumi, M Aoshima and K Ohyashiki, 2002, “Increased collagenase activity in maccrophages From bronchial lavage as a diagnostic marker if non-small cell lung cancer” [29] Hiroko Nagano and Kim Anh To “ Purification and collagenase and Specificity of its Related Enzyme from Bacillus subtilis FS-2” Bioci Biotechnol Biochem, 182-183, 2000 [30] Methods in enzymeology, 1982, vol 28 [31] 10 Yhatodan Y lto, A Nagate, K Utssumi, M Aoshima and K ohyashiki, 2002, “Increased collagenase activity in maccrophages From bronchial lavage as a diagnostic marker if non-small cell lung cancer” [32] Yoshikiyo Sasagawa, Kazuo Izaki, Yuko Matsubara, Koki Suzuki, Hisao Kofima and Yoshiyuki Kamio 1995 “Molecular cloning and sequence analysis of the giene encoding the collagenase from Cytophage sp L43-1 strain” [33] Hiroaki Takeuchi, Yuji Shibano, Kazuyuki Morihara, Jun Fukushima, sumako Inarni, Borivoj Keil, Anne-marie Gilles, Susumu Kawamoto and Kenji okuda “Structural giene and complete amino acid sequence a vibrio alginolyticus collagenase” Biochem J (1992) 281 703708 [34] Osamu Marsushita Chang-Min Jung, Junzaburo Minami Seiichi Katayama, Nozomu Nishi, and Akinobu Okabe “ A study the collagen binding Domain of a 116-kDa clostridium histolycum collagenase” J Bio Chem, Vol.273, 1998 Nguyễn Thị Hà 50 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở [35] Berry C (2012), “The bacterium, Lysinibacillus sphaericus, as an insect pathogen”, J Invertabr Panthol, 109(1),pp.1-10 [36] Sarath G, De La Motte R, Wagner FW Proteolytic Enzymes, A Practical Approach New York: IRL Press; 1989 Protease assay methods; p 25 Nguyễn Thị Hà 51 13-02 Khoa Công nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở PHỤ LỤC Các loại môi trường nuôi cấy lên men vi sinh vật 1.1.Môi trường MPA: (g/l) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18- 20 Nước cất 1000ml pH 7- 7.2 1.2 Môi trường casein: (g/l) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18- 20 Nước cất 1000ml pH 7- 7.2 Casein 10 1.3 Môi trường gelatin: (g/l) Pepton 10 Cao thịt NaCl Agar 18- 20 Nước cất 1000ml pH 7- 7.2 gelatine 10 Nguyễn Thị Hà 52 13-02 Khoa Cơng nghệ sinh học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở 1.4 Môi trường khoáng ISP9 : (g/l) (NH4)2SO4 2,64 KH2PO4 2,38 K2HPO4 5.65 MgSO4.7H2O Muối vi lượng 1ml Agar 15 Nước cất 1000ml pH 6.8 - 1.4.1 Các nguồn muối vi lượng: (g/l) CuSO4.5H2O 1.5 0,64 FeSO4.7H2O 0,11 MnCl2.4H2O 0,79 ZnSO4.7H2O 0,15 Nước cất 100ml Mơi trường khống ISP9 có bổ sung collagen: (g/l) (NH4)2SO4 2,64 KH2PO4 2,38 K2HPO4 5.65 MgSO4.7H2O Collagen 10 Muối vi lượng 1ml Agar 15 Nước cất 1000ml pH 6.8 - Nguyễn Thị Hà 53 13-02 Khoa Công nghệ sinh học ... Nghiên cứu so sánh đặc điểm sinh hóa cllagenase tái tổ hợp từ chủng Lysinibacillus sphaericus ”với mục tiêu : Nghiên cứu thu nhận tinh collagenase từ chủng vi khuẩn Xác định đặc điểm sinh hóa. .. CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: : NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus. .. Hàn Quốc Pipetman Gilson, Mỹ Máy siêu âm Vibracell, Mỹ Tủ lạnh Nhật Bản Máy PCR Mỹ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp BL21(DE3) pIN III-